專利名稱：缺血后白細胞－內(nèi)皮細胞相互作用的調(diào)節(jié)的制作方法
本申請要求2001年8月3日遞交的序列號60/309,816的美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
中風(fēng)在美國是死亡率和成年人喪失行動能力的主要原因。根據(jù)聯(lián)邦中風(fēng)協(xié)會(National Stroke Association)的統(tǒng)計，中風(fēng)是美國第三大死因，導(dǎo)致接近160,000人死亡。在美國每年有大約720,000人患中風(fēng)，其中超過600,000人是缺血性中風(fēng)。缺血性中風(fēng)發(fā)生在血凝塊阻礙血液流向腦部區(qū)域的時候。引發(fā)的缺氧或缺血導(dǎo)致細胞死亡。通向大腦受影響區(qū)域的血流可自然恢復(fù)，或通過用溶栓藥物治療來恢復(fù)。血液回流至大腦受影響區(qū)域稱為再灌注。再灌注經(jīng)常引發(fā)據(jù)信導(dǎo)致相當(dāng)部分的中風(fēng)相關(guān)性腦損傷的急性炎癥反應(yīng)。這種損傷叫做再灌注損傷，主要由嗜中性白細胞引起。
已經(jīng)有相當(dāng)多的證據(jù)證明白細胞促使短暫缺血后的腦損傷惡化。還有證據(jù)表明粘附分子是缺血和再灌注損傷的重要影響因素。眾多動物研究證實，調(diào)節(jié)參與缺血和再灌注損傷的白細胞影響隨后的腦損傷程度。已證實白細胞減少在局部性和全身性缺血模型中都提供抗缺血/再灌注損傷的保護(Bendar等，(1991)Stroke2244-50；Dukta等，(1989)Stroke20390-5；Matsuo等，(1994)Brain Research656344-52)。稍后的研究證實，阻斷整聯(lián)蛋白對短暫缺血后的腦損傷程度有影響(Bowes等，(1993)Neurology119215-9；Chopp等，(1994)Stroke25869-75；Jiang等，(1994)Neuroscience ResearchCommunications1585-93；Zhang等，(1994)Neurology441747-51)。
選擇蛋白，例如P-選擇蛋白、E-選擇蛋白和L-選擇蛋白，據(jù)信通過與靶細胞(例如血小板和淋巴細胞)表面上存在的配體特異性相互作用，介導(dǎo)胞間粘附作用。一般來說，選擇蛋白配體至少部分由碳水化合物部分(例如唾液酸LewisX(sLeX)和唾液酸Lewisa(sLea))組成。P-選擇蛋白結(jié)合含非唾液酸化形式的LewisX血型抗原的碳水化合物，并對唾液酸LewisX具有較高親和力。P-選擇蛋白糖蛋白配體-1(PSGL-1)是一種高親和力P-選擇蛋白配體，它還可以結(jié)合E-選擇蛋白和L-選擇蛋白，它由白細胞表達，并介導(dǎo)白細胞、血小板和內(nèi)皮細胞類之間的細胞粘附作用(美國專利號5,843,707和美國專利號5,827,817)。
發(fā)明概述本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)了P-選擇蛋白拮抗劑(例如rPSGL-Ig)阻礙白細胞順著大腦皮層中的小靜脈滾動，并阻礙短暫缺血后白細胞與血小板的粘附。通過例如在缺血前、再關(guān)注前或再關(guān)注過程中給予患者P-選擇蛋白拮抗劑(如rPSGL-Ig)阻斷P-選擇蛋白與P-選擇蛋白配體相互作用，可有效減輕由短暫缺血引起的腦損傷程度，包括腦梗塞范圍。
因此，本發(fā)明提供用于患者減輕由缺血(例如中風(fēng))后再灌注損傷引起的組織或器官(例如腦)損傷的方法和組合物。本發(fā)明還提供用于患者減少由缺血后再灌注引起的梗塞(例如皮層梗塞)大小的方法和組合物。其它導(dǎo)致缺血并因此可造成再灌注損傷的缺血性疾病包括例如腸系膜及外周血管疾病、器官移植、循環(huán)休克和血栓形成疾病，例如血栓栓塞、深靜脈血栓形成、肺栓塞、中風(fēng)、心肌梗塞、流產(chǎn)、與抗凝血酶III缺乏、C蛋白缺乏、S蛋白缺乏、抗活性C蛋白相關(guān)的血栓形成傾向、血纖維蛋白原異常、纖溶病、高胱氨酸尿、妊娠、炎癥、骨髓增生性疾病、動脈硬化、心絞痛(例如不穩(wěn)定型心絞痛)、彌散性血管內(nèi)凝血、血栓性血小板減少性紫癜、癌轉(zhuǎn)移、鐮狀細胞病和腎小球腎炎。
本發(fā)明至少部分基于發(fā)現(xiàn)了通過給予患者P-選擇蛋白拮抗劑(包括P-選擇蛋白配體分子或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段，例如可溶性PSGL-1，或可溶性重組PSGL融合蛋白、抗P-選擇蛋白抗體和抗P-選擇蛋白配體抗體)產(chǎn)生的P-選擇蛋白拮抗作用，抑制細胞粘附(例如細胞與細胞的粘附，如白細胞-內(nèi)皮細胞粘附和白細胞-血小板粘附)以及細胞(例如白細胞)與血管的粘附，并減緩了白細胞在短暫缺血后的大腦表面小靜脈中滾動，由此有效減輕由短暫缺血和再灌注引起的腦損傷和梗塞程度。本發(fā)明的P-選擇蛋白配體分子在本文稱為P-選擇蛋白糖蛋白配體-1(PSGL-1)分子。
一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)防或減輕患者缺血后再灌注損傷(例如腦)的方法，包括給予有效量的含P-選擇蛋白拮抗劑的組合物。在一個實施方案中，所述患者患中風(fēng)。在另一個實施方案中，所述再灌注損傷為皮層梗塞。在再一個實施方案中，在缺血前給予所述患者P-選擇蛋白拮抗劑。在另一個實施方案中，在再灌注過程中給予所述患者P-選擇蛋白拮抗劑。在一個優(yōu)選實施方案中，在再灌注前給予所述患者P-選擇蛋白拮抗劑。在再另一個實施方案中，給予所述患者P-選擇蛋白拮抗劑連同有效量的一種或多種粘附分子拮抗劑，例如E-選擇蛋白、L-選擇蛋白、ICAM-1、VCAM-1或CD-18的抑制劑。在再一個實施方案中，給予P-選擇蛋白拮抗劑連同溶栓藥物(例如組織纖溶酶原激活物(tPA)或鏈激酶)、抗血小板藥物(如阿司匹林或肝素)、抗凝劑(如華法令)或細胞保護劑。
在一個實施方案中，P-選擇蛋白拮抗劑為P-選擇蛋白配體蛋白。在另一個實施方案中，P-選擇蛋白配體蛋白為人P-選擇蛋白配體蛋白。在一個優(yōu)選實施方案中，P-選擇蛋白拮抗劑為可溶性P-選擇蛋白配體蛋白或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段，如可溶性PSGL-1或可溶性重組PSGL融合蛋白，例如重組PSGL-Ig。在另一個實施方案中，P-選擇蛋白拮抗劑為抗P-選擇蛋白抗體或其生物活性片段、或抗P-選擇蛋白配體抗體或其生物活性片段。在再另一個實施方案中，所述組合物還包含藥用載體。
在一個實施方案中，所述患者為哺乳動物，例如人。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括給予可溶性P-選擇蛋白配體蛋白，包括P-選擇蛋白配體蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的至少一部分，例如SEQ IDNO2所示氨基酸序列的氨基酸42-60、42-88、42-118、42-189或42-310。在另一個實施方案中，所述蛋白為可溶性P-選擇蛋白配體蛋白，包括SEQ ID NO2所示P-選擇蛋白配體蛋白的至少胞外結(jié)構(gòu)域。在再一個實施方案中，本發(fā)明提供的可溶性蛋白還包含免疫球蛋白(例如人IgG)的Fc部分。在一個相關(guān)實施方案中，所述可溶性蛋白為可溶性P-選擇蛋白配體蛋白，它包含SEQ ID NO2的氨基酸42至氨基酸60的氨基酸序列，該序列以C末端和免疫球蛋白的Fc部分融合。在一個相關(guān)實施方案中，所述可溶性蛋白為可溶性P-選擇蛋白配體蛋白，它包含SEQ ID NO2的氨基酸42至氨基酸88的氨基酸序列，該序列以C末端和免疫球蛋白的Fc部分融合。在再一個實施方案中，免疫球蛋白的Fc部分通過連接序列與P-選擇蛋白配體蛋白融合。
另一方面，本發(fā)明提供一種方法，該方法通過給予一種組合物預(yù)防或減輕患者缺血后腦梗塞，所述組合物包含有效量的P-選擇蛋白拮抗劑或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段，例如可溶性PSGL-1或可溶性重組PSGL融合蛋白(如重組PSGL-Ig)、抗P-選擇蛋白配體抗體或其生物活性片段、或抗P-選擇蛋白抗體或其生物活性片段。再一方面，本發(fā)明提供一種方法，該方法通過給予一種組合物預(yù)防或減輕患者中風(fēng)后腦損傷，所述組合物包含有效量的P-選擇蛋白拮抗劑或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段，例如可溶性PSGL-1或可溶性重組PSGL融合蛋白(如重組PSGL-Ig)、抗P-選擇蛋白配體抗體或其生物活性片段、或抗P-選擇蛋白抗體或其生物活性片段。再另一方面，本發(fā)明提供一種方法，該方法通過給予一種組合物抑制患者缺血后細胞與血管粘附，所述組合物包含有效量的P-選擇蛋白拮抗劑或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段，例如可溶性PSGL-1或可溶性重組PSGL融合蛋白(如重組PSGL-Ig)、抗P-選擇蛋白配體抗體或其生物活性片段、或抗P-選擇蛋白抗體或其生物活性片段。在一個實施方案中，所述血管為患者腦血管。在另一個實施方案中，所述細胞為白細胞。
再另一方面，本發(fā)明提供一種方法，該方法通過給予一種組合物抑制患者缺血后細胞與細胞粘附(例如白細胞-血小板粘附)，所述組合物包含有效量的P-選擇蛋白拮抗劑或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段，例如可溶性PSGL-1或可溶性重組PSGL融合蛋白(如重組PSGL-Ig)、抗P-選擇蛋白配體抗體或其生物活性片段、或抗P-選擇蛋白抗體或其生物活性片段。
再另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定能夠在例如短暫缺血后預(yù)防或減輕再灌注損傷和/或減緩白細胞在血管中(例如順著大腦皮層小靜脈)滾動的化合物的方法，其中對所述化合物調(diào)節(jié)PSGL-1多肽活性的能力進行測定。在一個實施方案中，通過檢測細胞粘附(例如胞間粘附(如白細胞-內(nèi)皮細胞或白細胞-血小板粘附)和細胞(例如血小板或白細胞)與血管粘附)的降低，測定所述化合物調(diào)節(jié)PSGL-1多肽活性的能力。
由以下的詳述和權(quán)利要求顯見本發(fā)明其它的特征和優(yōu)勢。
附圖簡述

圖1圖示了rPSGL-Ig在大腦中動脈閉塞30分鐘后的再灌注過程中對白細胞在大腦表面小靜脈中滾動的影響。
圖2圖示了rPSGL-Ig在大腦中動脈閉塞120分鐘后的再灌注過程中對白細胞在大腦表面小靜脈中滾動的影響。
發(fā)明詳述本發(fā)明至少部分基于發(fā)現(xiàn)了可溶性P-選擇蛋白配體分子在缺血性中風(fēng)動物模型中調(diào)節(jié)(例如減緩)短暫缺血后沿著大腦皮層小靜脈的白細胞滾動。本文使用的“白細胞滾動”包括白細胞與血管內(nèi)皮細胞微弱粘附，并且在牢固粘附細胞之前和在白細胞遷移至內(nèi)皮組織中之前白細胞沿著血管內(nèi)皮細胞滾動。給予患者可溶性P-選擇蛋白配體分子也顯著降低由缺血后再灌注造成的皮層梗塞面積。因此，給予可溶性P-選擇蛋白配體分子保護患者大腦免受缺血(例如中風(fēng))和再灌輸損傷引起的損傷。
因此，本發(fā)明提供預(yù)防和減輕由缺血(例如中風(fēng))后再灌注引起的損傷(例如組織或器官(如腦)損傷)的方法和組合物。本發(fā)明還提供通過給予P-選擇蛋白拮抗劑(例如可溶性P-選擇蛋白配體蛋白或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段(如可溶性PSGL-1或可溶性重組PSGL融合蛋白)、抗P-選擇蛋白配體抗體或其生物活性片段、或抗P-選擇蛋白抗體或其生物活性片段)調(diào)節(jié)(例如預(yù)防或減輕)體內(nèi)再灌注損傷的方法和組合物。P-選擇蛋白拮抗劑可在缺血前、再灌注前或再灌注過程中給予。用于本發(fā)明方法的P-選擇蛋白配體蛋白在本文稱為P-選擇蛋白糖蛋白配體-1(PSGL-1)分子。
本文使用的缺血性疾病是指其中血流被阻塞或中斷導(dǎo)致供應(yīng)任何器官、組織或細胞的血液和氧缺乏的任何疾病。許多醫(yī)學(xué)干預(yù)，例如搭橋手術(shù)過程中的血流中斷，可導(dǎo)致缺血。缺血可由病態(tài)心血管組織引起，并可影響心血管組織，例如缺血性心臟病。但缺血可發(fā)生在任何遭遇氧供應(yīng)缺乏的器官。其它導(dǎo)致缺血并因此可導(dǎo)致再灌注損傷的疾病包括例如心肌缺血、腸系膜及外周血管疾病、器官移植、循環(huán)休克和血栓形成疾病，例如血栓栓塞、深靜脈血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞、流產(chǎn)、與抗凝血酶III缺乏、C蛋白缺乏、S蛋白缺乏、抗活性C蛋白相關(guān)的血栓形成傾向、血纖維蛋白原異常、纖溶病、高胱氨酸尿、妊娠、炎癥、骨髓增生性疾病、動脈硬化、心絞痛(例如不穩(wěn)定型心絞痛)、彌散性血管內(nèi)凝血、血栓性血小板減少性紫癜、癌轉(zhuǎn)移、鐮狀細胞病和腎小球腎炎。
本文使用的“再灌注”包括通向缺血性血管的血流或自然恢復(fù)，或通過用溶栓藥物(例如組織纖溶酶原激活物(tPA)或鏈激酶)或其它藥物(如抗凝劑或抗血小板藥物)誘導(dǎo)恢復(fù)。本文使用的“再灌注損傷”包括由可導(dǎo)致組織功能障礙和梗塞(例如皮層梗塞)的缺血和再灌注造成的任何器官、組織(例如血管)或細胞破壞或損傷。再灌注損傷至少部分是由患者的炎癥反應(yīng)引起，包括缺血區(qū)域的細胞與細胞粘附(例如白細胞-內(nèi)皮細胞粘附和白細胞-血小板粘附)和白細胞浸潤(白細胞滾動)，推測這部分是因為凝血酶和細胞因子活化血小板和內(nèi)皮細胞使它們粘附白細胞(Romson等，Circulation 671016-1023，1983)。在白細胞滾動后，這些粘附的白細胞可通過內(nèi)皮細胞遷移，并在再灌注過程中破壞缺血組織。因此，減緩白細胞滾動使再灌注引起的組織和器官損傷減輕。
本文使用的“P-選擇蛋白拮抗劑”包括例如通過抑制P-選擇蛋白或E-選擇蛋白和P-選擇蛋白配體蛋白之間的相互作用、例如通過抑制表達P-選擇蛋白或E-選擇蛋白的內(nèi)皮細胞和活化血小板與表達PSGL的白細胞的相互作用，能夠拮抗P-選擇蛋白和/或E-選擇蛋白的任何藥物。例如，P-選擇蛋白拮抗劑包括P-選擇蛋白配體分子或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段，例如可溶性PSGL-1或可溶性重組PSGL融合蛋白(如PSGL-Ig)，以及小分子、抗P-選擇蛋白抗體和抗P-選擇蛋白配體抗體。在一個優(yōu)選實施方案中，所述P-選擇蛋白配體是可溶的。
本文交互使用的“P-選擇蛋白配體活性”、“PSGL-1活性”、“PSGL-1的生物活性”或“PSGL-1的功能活性”包括按照標準技術(shù)在體內(nèi)或體外測定的由PSGL-1蛋白、多肽或核酸分子施加于PSGL-1反應(yīng)性細胞(例如血小板、白細胞或內(nèi)皮細胞)的活性。PSGL-1活性可以是一種直接活性，例如與PSGL-1靶分子(如P-選擇蛋白或E-選擇蛋白)結(jié)合。本文使用的“底物”或“靶分子”或“結(jié)合配偶體”是一種分子，例如P-選擇蛋白或E-選擇蛋白，PSGL-1蛋白與其天然互作或結(jié)合，從而獲得PSGL-1介導(dǎo)的功能，例如調(diào)節(jié)細胞遷移或粘附。PSGL-1靶分子可為非PAGL-1分子或PSGL-1蛋白或多肽。所述靶分子的實例包括和PSGL-1蛋白處于相同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的蛋白，例如在參與調(diào)節(jié)P-選擇蛋白結(jié)合的途徑中在PSGL-1蛋白上游(活性刺激劑和抑制劑都包括在內(nèi))或下游起作用的蛋白?；蛘?，PSGL-1活性是一種間接活性，例如由PSGL-1蛋白與PSGL-1靶分子(例如P-選擇蛋白或E-選擇蛋白)互作介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。本文描述的PSGL-1生物活性包括例如一種或多種以下活性1)結(jié)合或作用于P-選擇蛋白或E-選擇蛋白；2)調(diào)節(jié)P-選擇蛋白或E-選擇蛋白結(jié)合；3)調(diào)節(jié)(例如降低或減弱)細胞粘附，例如胞間粘附(例如白細胞-內(nèi)皮細胞粘附和白細胞-血小板粘附)和細胞(例如白細胞)與血管(例如腦血管)粘附；4)調(diào)節(jié)白細胞向血小板和內(nèi)皮細胞的募集；5)調(diào)節(jié)細胞(例如白細胞或血小板)遷移；6)調(diào)節(jié)(例如降低或減弱)例如腦血管中的白細胞滾動；7)調(diào)節(jié)(例如預(yù)防或減輕)缺血后的再灌注損傷；和8)調(diào)節(jié)(例如降低或減輕)再灌注后例如大腦中的梗塞程度。
可在缺血前、再灌注前或再灌注過程中給予患者P-選擇蛋白拮抗劑。在一個優(yōu)選實施方案中，在缺血后和再灌注前給予P-選擇蛋白拮抗劑。P-選擇蛋白拮抗劑可在例如再灌注前和再灌注過程中以單劑給予或以特定周期多劑量給予。在一個優(yōu)選實施方案中，P-選擇蛋白拮抗劑靜脈給予。
P-選擇蛋白拮抗劑可單獨給藥，或與溶栓藥物(例如組織纖溶酶原激活物(tPA)或鏈激酶)、抗血小板藥物(如阿司匹林或肝素)、抗凝劑(如華法令)或細胞保護劑一同給藥，或與一種或多種粘附分子抑制劑(例如E-選擇蛋白、L-選擇蛋白、ICAM-1、VCAM-1或CD-18抑制劑)聯(lián)合給藥。
用于本發(fā)明方法的PSGL-1分子描述于美國專利序號5,827,817，其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
用于本發(fā)明方法的PSGL-1分子是一種糖蛋白，其可以包含以下的一種或多種末端碳水化合物NeuAcα(2，3)Galβ(1，4)GlcNAc-R|α(1，3)FucNeuAcα(2，3)Galβ(1，4)GlcNAc-R|α(1，4)FucGalβ(1，4)GlcNAc-R|α(1，3)FucGalβ(1，4)GlcNAc-R|α(1，4)Fuc其中R表示碳水化合物鏈的剩余部分，其或者直接共價連接至P-選擇蛋白配體蛋白，或者共價連接至與P-選擇蛋白配體蛋白共價連接的脂質(zhì)部分。用于本發(fā)明方法的P-選擇蛋白配體糖蛋白又可硫酸化，或者翻譯后修飾。當(dāng)在COS和CHO細胞中表達時，全長P-選擇蛋白配體蛋白(SEQ ID NO2的氨基酸1-402)或成熟P-選擇蛋白配體蛋白(SEQ ID NO2的氨基酸42-402)為同型二聚體或二價蛋白，其表觀分子量據(jù)非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳所示為220kD。
PSGL-1是一種在內(nèi)皮細胞和血小板上起P-選擇蛋白和E-選擇蛋白配體作用的糖蛋白。SEQ ID NO1列出了PSGL-1的DNA序列。PSGL-1的完整氨基酸序列，即成熟肽加上前導(dǎo)序列，經(jīng)鑒定為SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸1至氨基酸402。成熟PSGL-1蛋白經(jīng)鑒定為SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸42至氨基酸402。
本文使用的“可溶性PSGL-1蛋白”或“可溶性P-選擇蛋白配體蛋白”是指可溶性P-選擇蛋白配體糖蛋白(例如可溶性PSGL-1)或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段，包括含sLeX的碳水化合物。用于本發(fā)明方法的可溶性P-選擇蛋白配體蛋白優(yōu)選至少包括SEQ IDNO2的約氨基酸18至約氨基酸310的PSGL-1胞外結(jié)構(gòu)域或其生物活性片段。其它可溶形式的P-選擇蛋白配體分子經(jīng)鑒定為SEQ IDNO2所示氨基酸序列的例如氨基酸42至310或其生物活性片段。PSGL-1胞外結(jié)構(gòu)域的生物活性片段包括例如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸42-60、42-88、42-118和42-189。用于本發(fā)明方法的可溶性PSGL-1蛋白優(yōu)選為單體或二聚體PSGL-1蛋白。
在本發(fā)明方法的一個實施方案中，本發(fā)明方法的可溶形式的P-選擇蛋白配體分子可通過“連接”序列與免疫球蛋白(例如IgG分子)的Fc部分融合，形成融合蛋白。其它免疫球蛋白同種型也可以用于產(chǎn)生所述融合蛋白。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述可溶性P-選擇蛋白配體蛋白是一種嵌合分子，其由PSGL-1蛋白分子的胞外結(jié)構(gòu)域(一種含sLeX的碳水化合物)組成，并通過連接序列與人IgG的Fc部分融合。
可通過例如改變PSGL-1的氨基酸序列使SEQ ID NO2位置310的半胱氨酸由絲氨酸或丙氨酸取代，或通過本領(lǐng)域已知的其它方法，生產(chǎn)單體形式的PSGL-1。
在一個優(yōu)選實施方案中，由成熟PSGL-1的N-末端47個氨基酸生產(chǎn)二聚體PSGL-1(dimPSGL-1)融合蛋白，由此保持對P-選擇蛋白的高親和力，但減弱了與L-選擇蛋白和E-選擇蛋白的結(jié)合。PSGL-1的N-末端47個氨基酸與人免疫球蛋白(IgG1)的Fc部分連接，由此恢復(fù)在天然PSGL-1分子中觀察到的二價提呈(bivalent presentation)。最后，為禁止Fc受體結(jié)合和補體結(jié)合作用(效應(yīng)子)或功能，突變IgG-Fc區(qū)的兩個氨基酸(參見實施例1)。
本發(fā)明的方法包括使用核酸分子，它們由于遺傳密碼簡并性而與SEQ ID NO1所示核苷酸序列不同，并因此與SEQ ID NO1所示核苷酸序列編碼相同的PSGL-1蛋白。在另一個實施方案中，包括在本發(fā)明方法中的分離核酸分子其核苷酸序列編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的蛋白。
本發(fā)明方法還包括使用人PSGL-1的等位基因變異體，例如功能性或非功能性等位基因變異體。功能性等位基因變異體是天然存在的人PSGL-1蛋白的氨基酸序列變異體，其保持本文所述的PSGL-1活性，例如結(jié)合P-選擇蛋白或E-選擇蛋白。功能性等位基因變異體一般僅包含SEQ ID NO2的一個或多個氨基酸的保守取代，或者包含所述蛋白非關(guān)鍵區(qū)域中非關(guān)鍵殘基的取代、缺失或插入。非功能性等位基因變異體是不具有PSGL-1活性的人PSGL-1蛋白的天然氨基酸序列變異體。非功能性等位基因變異體一般包含SEQ ID NO2氨基酸序列的非保守取代、缺失或插入或成熟前截短，或者包含所述蛋白關(guān)鍵殘基或關(guān)鍵區(qū)域的取代、插入或缺失。
以下小節(jié)更詳細地描述了本發(fā)明的各個方面。
I.用于本發(fā)明方法的分離PSGL-1蛋白、抗PSGL-1抗體和抗P-選擇蛋白抗體本發(fā)明方法包括使用分離的P-選擇蛋白配體蛋白(例如PSGL-1蛋白)及其生物活性部分，以及適用作激發(fā)抗P-選擇蛋白配體抗體的免疫原的多肽片段。在一個實施方案中，可通過使用標準蛋白純化技術(shù)的合適純化流程由細胞或組織來源中分離天然PSGL-1蛋白。在另一個實施方案中，通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)PSGL-1蛋白。作為對重組表達的替代方法，可使用標準肽合成技術(shù)化學(xué)合成PSGL-1蛋白或多肽。
本文使用的PSGL-1蛋白的“生物活性部分”包括具有PSGL-1活性的PSGL-1蛋白片段。PSGL-1蛋白的生物活性部分包括含與PSGL-1蛋白的氨基酸序列(例如SEQ ID NO2所示氨基酸序列)足夠相同或由其衍生的氨基酸序列的肽，它包含的氨基酸比全長PSGL-1蛋白少，并具有至少一種PSGL-1蛋白活性。通常，生物活性部分包含具有至少一種PSGL-1蛋白活性的結(jié)構(gòu)域或基序(例如含PSGL-1胞外結(jié)構(gòu)域的片段或其能夠與P-選擇蛋白和/或E-選擇蛋白互作的片段)。PSGL-1蛋白的生物活性部分可以為例如長度為18、20、22、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300或更多個氨基酸的多肽。PSGL-1蛋白的生物活性部分可用作開發(fā)PSGL-1活性調(diào)節(jié)藥物的靶點。
在一個優(yōu)選實施方案中，用于本發(fā)明方法的PSGL-1蛋白至少具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的胞外結(jié)構(gòu)域或PSGL-1胞外結(jié)構(gòu)域的P-選擇蛋白結(jié)合片段或SEQ ID NO2的胞外結(jié)構(gòu)域。在其它實施方案中，PSGL-1蛋白與SEQ ID NO2大致相同，并保有SEQ IDNO2蛋白的功能活性，但由于天然等位基因變異或誘變而在氨基酸序列上有差異，如以下第II小節(jié)的詳述。因此，在另一個實施方案中，用于本發(fā)明方法的PSGL-1蛋白包含的氨基酸序列與SEQ IDNO2至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同。
在一個優(yōu)選實施方案中，用于本發(fā)明方法的PSGL-1蛋白是一種可溶性P-選擇蛋白配體蛋白?？赏ㄟ^表達修飾的DNA制備編碼可溶形式的P-選擇蛋白配體蛋白的DNA，在所述修飾的DNA中，編碼P-選擇蛋白配體配體蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的區(qū)域缺失和/或終止密碼子引入至胞外結(jié)構(gòu)域羧基末端氨基酸密碼子的3′。例如，疏水性分析預(yù)示SEQ ID NO2所示的P-選擇蛋白配體蛋白具有由SEQ ID NO2的氨基酸311-332所組成的跨膜結(jié)構(gòu)域和由SEQ IDNO2的氨基酸333-402所組成的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?？赏ㄟ^標準分子生物技術(shù)(包括本領(lǐng)域已知的定點誘變法)或通過使用合適寡核苷酸引物的聚合酶鏈反應(yīng)制備如上所述的修飾DNA。美國專利第5,827,817號提供了各種可溶性P-選擇蛋白配體蛋白的幾個編碼DNA的生產(chǎn)方法，該專利通過引用結(jié)合到本文中。
為測定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分率，從對比最佳的目的出發(fā)，對這些序列進行比對(例如可將空位引入到第一個和第二個氨基酸或核酸序列的一個或兩個中，以便比對最佳，為對比可忽略不相同的序列)。在一個優(yōu)選實施方案中，用于對比的比對參比序列長度至少是參比序列長度的30％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％，再更優(yōu)選至少為60％，再更優(yōu)選至少為70％、80％或90％(例如當(dāng)比對第二個序列和具有400個氨基酸殘基的SEQ ID NO2的PSGL-1氨基酸序列時，要比對至少280個、優(yōu)選至少240個、更優(yōu)選至少200個、再更優(yōu)選至少160個、再更優(yōu)選至少120個、80個或40個或更少的氨基酸殘基)。然后對比相應(yīng)的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝粋€序列中的一個位置由與第二個序列相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，則所述分子在該位置相同(本文使用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。兩個序列之間的同一性百分比隨所述序列共有的相同位置數(shù)變化，還要考慮為兩個序列最佳比對目的而需要引入的空位數(shù)和每個空位的長度。
可使用數(shù)學(xué)算法完成兩個序列之間的序列對比和同一性百分率的測定。在一個優(yōu)選實施方案中，使用已加入到GCG軟件包(可在http//www.gcg.com獲得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48444-453(1970))算法，使用Blosum62矩陣或PAM250矩陣，空位插入罰分為16、14、12、10、8、6或4，空位延長罰分為1、2、3、4、5或6，測定兩個氨基酸序列之間的同一性百分率。在再另一個優(yōu)選實施方案中，使用GCG軟件包(可在http//www.gcg.com獲得)的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩陣，空位插入罰分為40、50、60、70或80，空位延長罰分為1、2、3、4、5或6，測定兩個核苷酸序列之間的同一性百分率。在另一個實施方案中，使用已加入到ALIGN程序(版本2.0或2.0U)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.411-17(1988))算法，使用PAM120權(quán)重殘基表、空位長度罰分12和空位罰分4，測定兩個氨基酸或核苷酸序列之間的同一性百分率。
本發(fā)明的方法還可以使用PSGL-1嵌合蛋白或融合蛋白。本文使用的PSGL-1“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含有效連接非PSGL-1多肽的PSGL-1多肽?！癙SGL-1多肽”是指具有對應(yīng)于PSGL-1分子的氨基酸序列的多肽，而“非PSGL-1多肽”是指其氨基酸序列對應(yīng)于與PSGL-1蛋白基本不同源的蛋白(例如與PSGL-1蛋白不同并來源于相同或不同生物的蛋白)的多肽。在PSGL-1融合蛋白中，PSGL-1多肽可對應(yīng)于PSGL-1蛋白的全部或一部分。在一個優(yōu)選實施方案中，PSGL-1融合蛋白包含PSGL-1蛋白的至少一個生物活性部分，例如PSGL-1胞外結(jié)構(gòu)域或其P-選擇蛋白結(jié)合片段。在另一個優(yōu)選實施方案中，PSGL-1融合蛋白包含PSGL-1蛋白的至少兩個生物活性部分。在融合蛋白中，術(shù)語“有效連接”意在表示PSGL-1多肽和非PSGL-1多肽相互按讀框融合。非PSGL-1多肽可融合至PSGL-1多肽的N末端或C末端。
例如，在一個實施方案中，所述融合蛋白為重組可溶形式的PSGL-1蛋白，其中所述PSGL-1分子的胞外結(jié)構(gòu)域與人IgG融合，例如可溶性rPSGL-Ig。
在另一個實施方案中，該融合蛋白是在其N端含異源信號序列的PSGL-1蛋白。在某些宿主細胞(例如哺乳動物宿主細胞)中，PSGL-1的表達和/或分泌可通過使用異源信號序列增加。
用于本發(fā)明方法的可溶性PSGL-1融合蛋白(例如rPSGL-Ig)可加入到藥用組合物中，并體內(nèi)給予患者。可溶性PSGL-1融合蛋白可用于影響PSGL-1底物(例如P-選擇蛋白或E-選擇蛋白)的生物利用率。
而且，用于本發(fā)明方法的PSGL-1融合蛋白可用作在患者中產(chǎn)生抗P-選擇蛋白配體抗體的免疫原、用于純化P-選擇蛋白配體并在篩選測定中用于鑒別抑制P-選擇蛋白配體分子與P-選擇蛋白分子相互作用的分子。
用于本發(fā)明方法的PSGL-1嵌合蛋白或融合蛋白最好通過標準重組DNA技術(shù)生產(chǎn)。例如，按照常規(guī)技術(shù)，例如通過使用用于連接的平端或錯口末端、限制酶消化產(chǎn)生合適的末端、填補合適的粘性末端、堿性磷酸酶處理以避免不需要的連接并酶促連接，按讀框?qū)⒕幋a不同多肽序列的DNA片段連接在一起。在另一個實施方案中，可通過常規(guī)技術(shù)(包括自動化DNA合成儀)合成融合基因?；蛘撸墒褂迷趦蓚€相鄰基因片段之間產(chǎn)生互補性突出端的錨式引物，對基因片段進行PCR擴增，其隨后可退火并再擴增，以產(chǎn)生嵌合基因序列(參見例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等編輯，JohnWiley&Sons1992)。而且，許多編碼融合部分(例如GST多肽)的表達載體可商購?？蓪⒕幋aPSGL-1的核酸克隆入這樣的表達載體，使所述融合部分按讀框連接至PSGL-1蛋白。
本發(fā)明還涉及使用PSGL-1蛋白的變異體，其或者起PSGL-1激動劑(模擬劑)的作用，或者起PSGL-1拮抗劑的作用。PSGL-1蛋白變異體可通過誘變(例如不連續(xù)點突變或截短)PSGL-1蛋白產(chǎn)生。PSGL-1蛋白激動劑可以保留大致相同或一部分的天然形式PSG-1蛋白的生物活性。PSGL-1蛋白拮抗劑可通過例如競爭性調(diào)節(jié)PSGL-1蛋白的PSGL-1介導(dǎo)活性，抑制天然形式的PSGL-1蛋白的一種或多種活性。因此，可用功能受限的變異體處理激發(fā)特定的生物學(xué)作用。在一個實施方案中，用具有天然形式PSGL-1蛋白一部分生物活性的變異體治療患者對患者的副作用比用天然形式的PSGL-1蛋白治療要小。
在一個實施方案中，可通過篩選PSGL-1蛋白突變體(例如截短突變體)的組合文庫的PSGL-1蛋白激動劑或拮抗劑活性，鑒定起PSGL-1激動劑(模擬劑)或PSGL-1拮抗劑作用的PSGL-1蛋白變異體。在一個實施方案中，通過在核酸水平組合誘變產(chǎn)生由多樣化(variegated)基因文庫編碼的PSGL-1變異體多樣化文庫。可通過例如酶促連接合成寡核苷酸混合物至基因序列，使?jié)撛诘腜SGL-1序列的簡并部分可作為獨立多肽表達，或者可作為其中含部分PSGL-1序列的較大融合蛋白(例如用于噬菌體文庫)的一部分表達，生產(chǎn)PSGL-1變異體的多樣化文庫。有各種各樣的方法可用于由簡并寡核苷酸序列產(chǎn)生潛在PSGL-1變異體的文庫?？捎米詣踊疍NA合成儀化學(xué)合成簡并基因序列，然后將合成基因連接至合適的表達載體。簡并部分基因的用途是可以在一個混合物中提供潛在PSGL-1序列需要部分的全部編碼序列。合成簡并寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的(參見例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 393；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等(1984)Science 1981056；Ike等(1983)Nucleic Acid Res.11477)。
另外，PSGL-1蛋白編碼序列片段文庫可用于生產(chǎn)PSGL-1片段的多樣化群，以篩選并隨后選擇PSGL-1蛋白變異體。在一個實施方案中，可通過在每一個分子僅切約1次的情況下用核酸酶處理PSGL-1編碼序列的雙鏈PCR片段、使雙鏈DNA變性、使DNA復(fù)性形成可包括不同切口產(chǎn)物的有義/反義對的雙鏈DNA、通過用S1核酸酶處理去除重新形成的雙鏈體的單鏈部分，并連接所獲得的片段文庫至表達載體，生產(chǎn)編碼序列片段的文庫。利用該方法，可獲得編碼各種大小的PSGL-1蛋白的N-末端、C-末端和中間片段的表達載體。
本領(lǐng)域已知有幾種技術(shù)篩選由點突變或截短制備的組合文庫的基因產(chǎn)物和篩選cDNA文庫中具有選定特性的基因產(chǎn)物。這些技術(shù)適用于快速篩選通過組合誘變PSGL-1蛋白生產(chǎn)的基因文庫。適合高通量分析并用于篩選大基因文庫的最廣泛使用的技術(shù)通常包括將基因文庫克隆入可復(fù)制的表達載體，用獲得的載體文庫轉(zhuǎn)化合適的細胞，在目的活性的檢測便于分離檢測其產(chǎn)物的基因編碼載體的條件下表達組合基因。遞歸系綜誘變(recursive ensemble mutagenesis)(REM)是一種增強文庫中功能性突變體頻率的技術(shù)，可與鑒定PSGL-1變異體的篩選測定聯(lián)合使用(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA897811-7815；Delgrave等(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。
本發(fā)明方法還包括使用抗PSGL-1抗體和抗P-選擇蛋白抗體。分離的PSGL-1蛋白或P-選擇蛋白或其部分或片段，可用作免疫原，以使用標準的多克隆和單克隆抗體制備技術(shù)生產(chǎn)結(jié)合PSGL-1或P-選擇蛋白的抗體。P-選擇蛋白配體抗體描述于例如美國專利號5,852,175。P-選擇蛋白特異性抗體描述于例如Kurome，T等(1994)J.Biochem.115(3)608-614。
全長PSGL-1蛋白或P-選擇蛋白或其抗原性肽片段可用作免疫原(Johnston等(1989)Cell561033-1044)。PSGL-1抗原性肽包括SEQID NO2所示氨基酸序列的至少8個氨基酸殘基，并包括PSGL-1表位，使針對所述肽產(chǎn)生的抗體與PSGL-1蛋白形成特異性免疫復(fù)合物。所述抗原肽優(yōu)選包含至少10個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少15個氨基酸殘基，再更優(yōu)選至少20個氨基酸殘基，最優(yōu)選至少30個氨基酸殘基。
所述抗原肽包含的表位優(yōu)選為位于所述蛋白表面上的PSGL-1區(qū)域，例如親水區(qū)以及高抗原性區(qū)。
PSGL-1或P-選擇蛋白免疫原通常用于制備抗體，方法是用所述免疫原免疫合適的患者(例如兔、山羊、小鼠或其它哺乳動物)。合適的免疫原性制劑可包括例如重組表達的PSGL-1蛋白或P-選擇蛋白或化學(xué)合成的PSGL-1或P-選擇蛋白多肽。所述制劑還可以包括佐劑，例如弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑或類似的免疫刺激劑。用免疫原性PSGL-1制劑免疫合適的患者誘導(dǎo)多克隆抗PAGL-1或抗P-選擇蛋白抗體應(yīng)答。
本文使用的術(shù)語“抗體”是指免疫球蛋白分子及其免疫活性部分，即含與抗原(例如PSGL-1或P-選擇蛋白)特異性結(jié)合(免疫反應(yīng))的抗原結(jié)合位點的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的實例包括可通過用酶(例如胃蛋白酶)處理抗體產(chǎn)生的F(ab)和F(ab′)2片段。本發(fā)明提供結(jié)合PSGL-1分子的多克隆和單克隆抗體。本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指僅含一種能夠與PSGL-1特定表位免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點的抗體分子群。因此單克隆抗體組合物通常顯示出對與其免疫反應(yīng)的特定PSGL-1蛋白或P-選擇蛋白的單一結(jié)合親合性。
可如上所述，通過用PSGL-1或P-選擇蛋白免疫原免疫合適的患者，制備多克隆抗PSGL-1抗體或P-選擇蛋白抗體?？赏ㄟ^標準技術(shù)，例如使用固定PSGL-1或P-選擇蛋白的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，即時監(jiān)測免疫患者的抗PSGL-1抗體或P-選擇蛋白抗體滴度。如果有需要，可由哺乳動物(例如血液)中分離直接抗任一種抗原的抗體分子，并再通過眾所周知的技術(shù)(例如A蛋白層析)純化，獲得IgG組分。在免疫后的合適時間，例如抗體滴度最高時，由所述患者獲得生產(chǎn)抗體的細胞，并可通過標準技術(shù)，例如由Kohler和Milstein(1975)Nature256495-497最早描述的雜交瘤技術(shù)(還參見Brown等(1981)J Immunol.127539-46；Brown等(1980)J Biol.Chem.2554980-83；Yeh等(1976)Proc.Natl.Acad.Sci.USA762927-31；和Yeh等(1982)Int.J.Cancer29269-75)、最近的人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等(1983)Immunol Today472)、ENV-雜交瘤技術(shù)(Cole等(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁)或三瘤技術(shù)，用其制備單克隆抗體。生產(chǎn)單克隆抗體雜交瘤的技術(shù)眾所周知(一般參見Kenneth，R.H.載于單克隆抗體生物分析新尺度，Plenum Publishing Corp.，New York，New York(1980)；Lerner，E.A.(1981)Yale J. Biol.Med. 54387-402；Gefter，M.L.等(1977)Somatic CellGenet.3231-36)。簡單地說，將無限增殖細胞系(通常為骨髓瘤)與用如上所述的免疫原免疫的哺乳動物的淋巴細胞(通常為脾細胞)融合，篩選獲得的雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清液，鑒定生產(chǎn)結(jié)合PSGL-1或P-選擇蛋白的單克隆抗體的雜交瘤。
可使用眾多廣為人知的用于融合淋巴細胞和無限增殖細胞系的方法中的任一種生產(chǎn)抗PSGL-1或P-選擇蛋白單克隆抗體(參見例如G.Galfre等(1977)Nature266550-52；Geffer等(1977)同上；Lerner(1981)同上；和Kenneth(1980)同上)。而且，一般技術(shù)人員就能意識到，所述方法有許多也應(yīng)有用的變化。通常，無限增殖細胞系(例如骨髓瘤細胞系)來源于和淋巴細胞相同的哺乳動物物種。例如，可通過使本發(fā)明免疫制劑免疫小鼠的淋巴細胞與無限增殖小鼠細胞系融合制備鼠雜交瘤。優(yōu)選的無限增殖細胞系為對含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基(“HAT培養(yǎng)基”)敏感的小鼠骨髓瘤細胞系。按照標準技術(shù)，可使用眾多骨髓瘤細胞系中的任一種作為融合配偶體，例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤細胞系。這些骨髓瘤細胞系可得自ATCC。通常，使用聚乙二醇(PEG)使HAT敏感性小鼠骨髓瘤細胞和小鼠脾細胞融合。然后使用HAT培養(yǎng)基選擇融合產(chǎn)生的雜交瘤細胞，HAT培養(yǎng)基可殺死未融合的骨髓瘤細胞和不能復(fù)制的融合骨髓瘤細胞(未融合的脾細胞將在幾天后死亡，因為它們沒有轉(zhuǎn)化)。通過例如使用標準ELISA測定，篩選雜交瘤培養(yǎng)上清液中結(jié)合PSGL-1或P-選擇蛋白的抗體的情況，檢測生產(chǎn)本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細胞。
作為制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的替代性方法，可通過分別用PSGL-1或P-選擇蛋白篩選重組組合免疫球蛋白文庫(例如抗體噬菌體展示文庫)，由此分離出結(jié)合PSGL-1或P-選擇蛋白的免疫球蛋白文庫成員，鑒定和分離單克隆抗PSGL-1或抗P-選擇蛋白抗體。生產(chǎn)和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒可商購(例如Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM噬菌體展示試劑盒，目錄號240612)。另外，特別適用于生產(chǎn)和篩選抗體展示文庫的方法和試劑的實例可見于例如Ladner等，美國專利第5,223,409號；Kang等，PCT國際公開號WO92/18619；Dower等，PCT國際公開號WO91/17271；Winter等，PCT國際公開號WO92/20791；Markland等，PCT國際公開號WO92/15679；Breitling等，PCT國際公開號WO93/01288；McCafferty等，PCT國際公開號WO92/01047；Garrard等，PCT國際公開號WO92/09690；Ladner等，PCT國際公開號WO90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay等(1992)Hum.Antibod.Hybridomas381-85；Huse等(1989)Science2461275-1281；Griffiths等(1993)EMBO J 12725-734；Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.226889-896；Clarkson等(1991)Nature352624-628；Gram等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA893576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology91373-1377；Hoogenboom等(1991)Nuc.Acid Res.194133-4137；Barbas等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887978-7982；和McCafferty等(1990)Nature 348552-554。
另外，可使用標準重組DNA技術(shù)制備重組抗PSGL-1或抗P-選擇蛋白抗體，例如同時包含人和非人部分的嵌合和人源化單克隆抗體，這些抗體也屬于本發(fā)明方法的范圍?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)，例如使用Robinson等，國際申請?zhí)朠CT/US86/02269；Akira等，歐洲專利申請184,187；Taniguchi，M.，歐洲專利申請171,496；Morrison等，歐洲專利申請173,494；Neuberger等，PCT國際公開號WO86/01533；Cabilly等，美國專利號4,816,567；Cabilly等，歐洲專利申請125,023；Better等(1988)Science2401041-1043；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA843439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.1393521-3526；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84214-218；Nishimura等(1987)Canc.Res.47999-1005；Wood等(1985)Nature314446-449；Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.801553-1559；Morrison-S.L.(1985)Science2291202-1207；Oi等(1986)BioTechniques4214；Winter美國專利5,225,539；Jones等(1986)Nature321552-525；Verhoeyan等(1988)Science2391534；和Beidler等(1988)J.Immunol.1414053-4060描述的方法生產(chǎn)所述嵌合和人源化單克隆抗體。
本文所述抗體可用于檢測(例如細胞裂解物或細胞上清液中的)PSGL-1蛋白或P-選擇蛋白，以便評價蛋白表達的豐度和模式。所述抗體例如可診斷性用于監(jiān)測組織蛋白水平，作為臨床試驗方法的一部分，以便例如判斷特定治療方案的功效。通過偶聯(lián)(即物理連接)所述抗體和可檢測物質(zhì)可便于檢測?？蓹z測物質(zhì)的實例包括各種酶輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)。合適酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適輔基復(fù)合物的實例包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適熒光物質(zhì)的實例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的實例包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的實例包括熒光素酶、熒光素和水母發(fā)光蛋白，而合適放射性物質(zhì)的實例包括125I、131I、35S或3H。
II.用于本發(fā)明方法的分離核酸分子SEQ ID NO1和2分別顯示了分離的人PSGL-1 cDNA編碼序列和人PSGL-1多肽的氨基酸序列。美國專利序號5,827,817和5,843,707也描述了PSGL-1序列，這些專利的內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明方法包括使用編碼PSGL-1蛋白或其生物活性部分的分離核酸分子，以及足以用作鑒定PSGL-1編碼核酸分子(例如PSGL-1mRNA)的雜交探針的核酸片段和用作PSGL-1核酸分子擴增或突變的PCR引物的片段。本文使用的術(shù)語“核酸分子”包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)，以及使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。核酸分子可以為單鏈或雙鏈DNA，但優(yōu)選為雙鏈DNA。
可使用標準分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息分離用于本發(fā)明方法的核酸分子，例如具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸分子或其部分。使用SEQ ID NO1的全部或部分核酸序列作為雜交探針，使用標準雜交和克隆技術(shù)(例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989)，可分離PSGL-1核酸分子。
此外，可使用基于SEQ ID NO1序列設(shè)計的合成寡核苷酸引物，使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分離包含全部或部分SEQ ID NO1的核酸分子。
可使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物，按照標準的PCR擴增技術(shù)，擴增用于本發(fā)明方法的核酸。而且，可通過標準合成技術(shù)(例如使用自動化合成儀)，制備對應(yīng)于PSGL-1核苷酸序列的寡核苷酸。
在一個優(yōu)選實施方案中，用于本發(fā)明方法的分離核酸分子包含示于SEQ ID NO1的核苷酸序列、示于SEQ ID NO1的核苷酸序列的互補序列或這些核苷酸序列中任一個的部分序列。與示于SEQ IDNO1的核苷酸序列互補的核酸分子是這樣一種分子其與示于SEQID NO1的核苷酸序列足夠互補，使其可與示于SEQ ID NO1的核苷酸序列雜交，由此形成穩(wěn)定雙鏈體。
在再另一個優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明方法的分離核酸分子包含與示于SEQ ID NO1的全長核苷酸序列至少約為55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同的核苷酸序列或這些序列任一個的一部分。
而且，用于本發(fā)明方法的核酸分子可僅包含SEQ ID NO1核酸序列的一部分，例如可用作探針或引物的片段或編碼部分PSGL-1蛋白(如PSGL-1蛋白的生物活性部分)的片段。所述探針/引物通常包含大致純化的寡核苷酸。所述寡核苷酸通常包含這樣的核苷酸序列區(qū)域在嚴格條件下，其與SEQ ID NO1的有義序列、反義序列或天然等位基因變異體或突變體的至少約12或15，優(yōu)選約20或25，更優(yōu)選約30、35、40、45、50、55、60、65或75個連續(xù)核苷酸雜交。在一個實施方案中，用于本發(fā)明方法的核酸分子含有的核苷酸序列長度超過100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600或更多的核苷酸，并在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO1的核酸分子雜交。
本文使用的術(shù)語“在嚴格條件下雜交”用于描述雜交和洗滌條件，在該條件下，互相之間顯著相同或同源的核苷酸序列相互雜交。所述條件使互相之間優(yōu)選至少約70％、更優(yōu)選至少約80％、再更優(yōu)選至少約85％或90％相同的序列相互雜交。這樣的嚴格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，可見于Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等編輯，John Wiley&Sons，Inc.(1995)的第2、4和6節(jié)。其它的嚴格條件可見于Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook等，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)的第7、9和11章。嚴格雜交條件的優(yōu)選非限制性實例包括在4X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中于約65-70℃雜交(或在4X SSC加50％甲酰胺中于約42-50℃雜交)，然后以1X SSC于約65-70℃洗滌1次或數(shù)次。高嚴格雜交條件的優(yōu)選非限制性實例包括在1X SSC中于約65-70℃雜交(或在1X SSC加50％甲酰胺中于約42-50℃雜交)，然后以0.3XSSC于約65-70℃洗滌1次或數(shù)次。還原性嚴格雜交條件的優(yōu)選非限制性實例包括在4X SSC中于約50-60℃雜交(或在6X SSC加50％甲酰胺中于約40-45℃雜交)，然后以2X SSC于約50-60℃洗滌1次或數(shù)次。本發(fā)明還包括介于以上提及的值(例如于65-70℃或42-50℃)之間的中間值。SSPE(1xSSPE為0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)可代替雜交和洗滌緩沖液中的SSC(1xSSC為0.15M NaCl和15mM檸檬酸鈉)；雜交完成后進行洗滌，每次15分鐘。預(yù)計長度小于50個堿基對的雜交物的雜交溫度應(yīng)比雜交物的解鏈溫度(Tm)低5-10℃，其中Tm按照以下方程確定。對于長度小于18個堿基對的雜交物，Tm(℃)＝2(A+T堿基的數(shù)量)+4(G+C堿基的數(shù)量)。對于長度在18-49個堿基對之間的雜交物，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是雜交物中堿基的數(shù)量，而[Na+]是雜交緩沖液中鈉離子的濃度(1xSSC的[Na+]＝0.165M)。熟練操作者還應(yīng)認識到，可向雜交和/或洗滌緩沖液中加入其它試劑，以降低核酸分子與膜(例如硝酸纖維素膜和尼龍膜)的非特異性雜交，所述試劑包括但不限于封閉劑(例如BSA、鮭魚或鯡魚精載體DNA)、去污劑(例如SDS)、鰲合劑(例如EDTA)、Ficoll、PVP等。具體地說，當(dāng)使用尼龍膜時，嚴格雜交條件的其它優(yōu)選非限制性實例為在0.25-0.5M NaH2PO4、7％SDS中于約65℃雜交，接著用0.02M NaH2PO4、1％SDS于65℃洗滌1次或數(shù)次，參見例如Church和Gilbert(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA811991-1995，(或0.2X SSC、1％SDS)。
在嚴格條件下與SEQ ID NO1的序列雜交的本發(fā)明分離核酸分子優(yōu)選對應(yīng)于天然核酸分子。本文使用的“天然”核酸分子是指具有天然存在的核苷酸序列(例如編碼天然蛋白)的RNA或DNA分子。
在優(yōu)選實施方案中，所述探針還包含與其連接的標記基團，例如，所述標記基團可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。所述探針可用作診斷測試試劑盒的一部分，例如通過檢測患者細胞樣品中編碼PSGL-1的核酸的水平，如檢測PSGL-1 mRNA水平或測定基因組PSGL-1基因是否突變或缺失，鑒定異常表達PSGL-1蛋白的細胞或組織。
本發(fā)明的方法可使用人PSGL-1蛋白的非人直向同源物。人PSGL-1蛋白的直向同源物為分離自非人生物并具有相同PSGL-1活性的蛋白。
本發(fā)明方法還包括使用含SEQ ID NO1核苷酸序列或其引入突變的部分的核酸分子。突變可導(dǎo)致“非必需”氨基酸殘基或“必需”氨基酸殘基的氨基酸取代?！胺潜匦琛卑被釟埢且吧蚉SGL-1序列(例如SEQ ID NO2的序列)中可改變而不改變生物活性的殘基，而“必需”氨基酸殘基是生物活性必須的。例如，能夠與P-選擇蛋白互作或能夠抑制P-選擇蛋白介導(dǎo)的細胞粘附或細胞遷移的片段所包含的氨基酸殘基不大可能適于改變。
可通過標準技術(shù)(例如定點誘變或PCR介導(dǎo)誘變)將突變引入到SEQ ID NO1中。優(yōu)選對一個或多個預(yù)測非必須氨基酸殘基進行保守氨基酸取代?！氨Ｊ匕被崛〈笔侵赴被釟埢删哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基替換。本領(lǐng)域已定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括堿性側(cè)鏈氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支鏈側(cè)鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，PSGL-1中的預(yù)測非必需氨基酸殘基優(yōu)選由相同側(cè)鏈家族的另一個氨基酸殘基替換。或者，在另一個實施方案中，例如通過飽和誘變，可順著全部或部分PSGL-1編碼序列將突變隨機引入，并可篩選所獲突變體的PSGL-1生物活性，以鑒定保留活性的突變體。在誘變SEQ ID NO1之后，可重組表達編碼蛋白，并可使用本文描述的測定測定蛋白活性。
已知本文公開的PSGL-1編碼序列的編碼鏈，則可按照Watson和Crick堿基配對原則設(shè)計本發(fā)明的反義核酸。所述反義核酸分子可與PSGL-1 mRNA的完整編碼區(qū)互補，但更優(yōu)選為與PSGL-1 mRNA的僅一部分編碼或非編碼區(qū)反義的寡核苷酸。例如，所述反義寡核苷酸可與PSGL-1 mRNA翻譯起始位點周圍的區(qū)域互補。反義寡核苷酸長度可為例如約5、10、1 5、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸。本發(fā)明的反義核酸可使用化學(xué)合成構(gòu)建，并使用本領(lǐng)域已知的方法酶連反應(yīng)。例如，可使用天然核苷酸或用來增加分子生物穩(wěn)定性或增加反義和有義核酸形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性的各種修飾核苷酸化學(xué)合成反義核酸(例如反義寡核苷酸)，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸?？捎糜诋a(chǎn)生所述反義核酸的修飾核苷酸的實例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷(beta-D-mannossylqueosine)、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。或者，可使用核酸以反義方向亞克隆入其中的表達載體生物生產(chǎn)反義核酸(即由插入核酸轉(zhuǎn)錄的RNA為目的靶核酸的反義方向，下一小節(jié)進一步詳述)。
在再另一個實施方案中，用于本發(fā)明方法的PSGL-1核酸分子可在堿基部分、糖部分或磷酸主鏈進行修改，以提升分子的例如穩(wěn)定性、雜交能力或溶解性。例如，可修飾核酸分子的脫氧核糖磷酸主鏈，以產(chǎn)生肽核酸(參見Hyrup B等(1996)Bioorganic&MedicinalChemistry4(1)5-23)。本文使用的術(shù)語“肽核酸”或“PNA”是指其中脫氧核糖磷酸主鏈由假肽主鏈取代并僅保留四種天然核堿基的核酸模擬物，例如DNA模擬物。已經(jīng)表明，PNA的中性主鏈允許在低離子強度條件下與DNA和RNA特異性雜交?？墒褂肏yrup B等(1996)同上；Perry-O′Keefe等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.9314670-675描述的標準固相肽合成方法進行PNA寡聚物合成。
PSGL-1核酸分子的PNA可用于本文所述的治療和診斷用途。例如，PNA可通過例如誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄或翻譯中止或抑制復(fù)制，用作序列特異性調(diào)節(jié)基因表達的反義或反基因藥物。PSGL-1核酸分子的PNA還可用于分析基因中的單堿基對突變(例如通過PNA定點型PCR鎖止法(PNA-directed PCR clamping))；當(dāng)與其它酶(例如S1核酸酶(HyrupB等(1996)同上))聯(lián)合使用時用作‘人工限制酶’；或用作DNA測序或雜交的探針或引物(Hyrup B等(1996)同上；Perry-O′Keefe等(1996)同上)。
在另一個實施方案中，可通過連接親脂或其它輔助基團至PNA、形成PNA-DNA嵌合體或使用脂質(zhì)體或本領(lǐng)域已知的其它藥物傳遞技術(shù)修飾PSGL-1的PNA，(例如增強其穩(wěn)定性或細胞吸收)。例如，可生產(chǎn)PSGL-1核酸分子的PNA-DNA嵌合體，其兼具PNA和DNA的優(yōu)勢特性。這樣的嵌合體可使DNA識別酶(例如RNA酶H和DNA聚合酶)與DNA部分互作，而PNA部分將提供高結(jié)合親合性和特異性?？墒褂酶鶕?jù)堿基堆積、核堿基之間的鍵數(shù)量和方向選擇的合適長度的連接體連接PNA-DNA嵌合體(Hyrup B等(1996)同上)。可如Hyrup B等(1996)同上和Finn P.J.等(1996)Nucleic Acids Res.24(17)3357-63所述合成PNA-DNA嵌合體。例如，可使用標準亞磷酰胺偶聯(lián)化學(xué)法在固相支持體上合成DNA鏈，并可在PNA和DNA5′末端之間使用修飾的核苷酸類似物，例如5′-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5′-脫氧-胸腺嘧啶亞磷酰胺(Mag，M.等(1989)Nucleic Acids Res.175973-88)。PNA單體然后以逐個方式偶聯(lián)，產(chǎn)生具有5′PNA節(jié)段和3′DNA節(jié)段的嵌合分子(Finn P.J.等(1996)同上)?；蛘?，可用5′PNA節(jié)段和3′DNA節(jié)段合成嵌合分子(Peterser，K.H.等(1975)BioorganieMed.Chem.Lett.51119-11124)。
在另一個實施方案中，用于本發(fā)明方法的寡核苷酸可包括其它附加基團，例如肽(如用于體內(nèi)靶向宿主細胞受體)或便于穿過細胞膜(參見例如Letsinger等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA866553-6556；Lemaitre等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84648-652；PCT公開號WO88/09810)或血腦屏障(參見例如PCT公開號WO89/10134)轉(zhuǎn)運的物質(zhì)。另外，可用雜交-引發(fā)裂解劑(參見例如Krol等(1988)Bio-Techniques6958-976)或插入劑(參見例如Zon(1988)Pharm.Res.5539-549)修飾寡核苷酸。為此，可將寡核苷酸與另一個分子(例如肽、雜交引發(fā)交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運劑或雜交引發(fā)裂解劑)綴合。
可通過表達其中全長序列部分已缺失或改變的修飾DNA，制備編碼用于本發(fā)明方法的P-選擇蛋白配體蛋白的其它片段或改變形式的DNA?？墒筆-選擇蛋白配體蛋白序列大量缺失，同時保留P-選擇蛋白配體蛋白活性。例如，含SEQ ID NO2的氨基酸42至氨基酸189的序列、SEQ ID NO2的氨基酸42至氨基酸118的序列或SEQID NO2的氨基酸42至氨基酸89的序列的P-選擇蛋白配體蛋白每個都保留了P-選擇蛋白結(jié)合活性和結(jié)合E-選擇蛋白的能力。其中一個或多個N-聯(lián)糖基化位點(例如SEQ ID NO2的氨基酸65、111和292的位點)已改變?yōu)槠渌被峄蛉笔У腜-選擇蛋白配體蛋白也保留了P-選擇蛋白結(jié)合活性和結(jié)合E-選擇蛋白的能力。含SEQ ID NO2的氨基酸42至氨基酸60(包含SEQ ID NO2的氨基酸45至氨基酸58的蛋白高陰離子區(qū))的P-選擇蛋白配體蛋白也保有P-選擇蛋白配體蛋白活性，但該序列限定的P-選擇蛋白配體蛋白不結(jié)合E-選擇蛋白。優(yōu)選P-選擇蛋白配體蛋白保留至少一個(更優(yōu)選至少兩個或最優(yōu)選全部三個)位于SEQ ID NO2的氨基酸46、48和51的酪氨酸殘基，這些殘基的硫酸化可影響P-選擇蛋白配體蛋白活性。可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法構(gòu)建編碼這些P-選擇蛋白配體蛋白和其它活性片段或改變形式的DNA。
用于本發(fā)明方法的分離DNA可與表達控制序列(例如Kaufinan等，Nucleic Acid Res.19，4485-4490(1991)公開的pMT2或pED表達載體)有效連接，以便重組生產(chǎn)P-選擇蛋白配體。本領(lǐng)域已知許多合適的表達控制序列。表達重組蛋白的一般方法也是已知的，其實例參見R.Kaufman，Methods in Enzymology.185，537-566(1990)。本文定義的“有效連接”是指酶連接或化學(xué)連接，以在本發(fā)明的分離DNA和表達控制序列之間形成共價鍵，以此方式由用連接的DNA/表達控制序列轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)染)的宿主細胞表達P-選擇蛋白配體蛋白。
已知幾種內(nèi)切蛋白水解酶在成對氨基酸序列的羧基側(cè)切割前體肽(例如-Lys-Arg-和-Arg-Arg-)，以產(chǎn)生成熟蛋白。這些酶一般稱為成對堿性氨基酸轉(zhuǎn)化酶或PACE，其在重組生產(chǎn)成熟肽中的用途在WO92/09698和美國申請序號07/885,972中詳盡公開，這兩個文獻都通過引用結(jié)合到本文中。PACE家族酶已知增加重組宿主細胞中前體多肽蛋白水解加工的效率。在某些實施方案中，本發(fā)明的P-選擇蛋白配體蛋白包含這樣的PACE切割位點。
可由含本文所述的任何可溶性P-選擇蛋白配體蛋白編碼DNA序列和WO92/09698與美國申請序號07/885,972(通過引用結(jié)合到本文中)描述的PACE編碼DNA序列的宿主細胞生產(chǎn)用于本發(fā)明方法的可溶性成熟P-選擇蛋白配體蛋白。這樣的宿主細胞可含有由分別含可溶性P-選擇蛋白配體蛋白DNA和PACE DNA的單獨表達載體共轉(zhuǎn)化或序貫轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的DNA。編碼3/4FT的第三個DNA也可以與P-選擇蛋白配體蛋白和PACE編碼DNA共轉(zhuǎn)化?；蛘撸拗骷毎砂赏瑫r含有可溶性P-選擇蛋白配體蛋白DNA和PACE DNA的單個表達載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的DNA。所述表達載體的構(gòu)建在分子生物學(xué)普通技術(shù)人員的水平之內(nèi)。共轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化的方法也是已知的。
許多PACE編碼DNA序列是已知的。例如，A.M.W.van denOuweland等，Nucl.Acids Res.18，664(1990)公開了一種稱為弗林蛋白酶(furin)的PACE的編碼DNA，該文獻通過引用結(jié)合到本文中。可溶形式的PACE的編碼eDNA稱為PACESOL。還存在其它形式PACE的編碼DNA，可使用任何所述PACE編碼DNA生產(chǎn)本發(fā)明的可溶性成熟P-選擇蛋白配體蛋白，只要所述PACE能夠切割P-選擇蛋白配體蛋白的氨基酸38-41?？扇苄问絇ACE的編碼DNA優(yōu)選用于生產(chǎn)本發(fā)明的可溶性成熟P-選擇蛋白配體蛋白。
編碼可溶形式P-選擇蛋白配體蛋白和PACE的DNA可單獨或一起有效連接至例如以上論述的pMT2或pED表達載體中含有的表達控制序列，以便重組生產(chǎn)PACE切割的可溶性P-選擇蛋白配體。其它合適的表達控制序列也是本領(lǐng)域已知的。
III.用于本發(fā)明方法的重組表達載體和宿主細胞本發(fā)明方法(例如本文描述的篩選測定)包括使用含PSGL-1蛋白(或其部分)的編碼核酸的載體，優(yōu)選為表達載體。本文使用的術(shù)語“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運與其連接的另一種核酸的核酸分子。一類載體是“質(zhì)?！?，是指另外的DNA節(jié)段可連入其中的環(huán)形雙鏈DNA環(huán)。另一類載體是病毒載體，其中另外的DNA節(jié)段可連入病毒基因組。某些載體能夠在其導(dǎo)入的宿主細胞中自發(fā)復(fù)制(例如具有細菌復(fù)制起點的細菌載體和游離型哺乳動物載體)。其它載體(例如非游離型哺乳動物載體)在導(dǎo)入宿主細胞時整合入宿主細胞基因組，由此和宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠控制與其有效連接的基因表達。所述載體本文稱為“表達載體”。一般來說，重組DNA技術(shù)中應(yīng)用的表達載體通常為質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可交互使用，因為質(zhì)粒是最常使用形式的載體。但是，本發(fā)明包括起相同功能的所述其它形式的表達載體，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
用于本發(fā)明方法的重組表達載體包含的本發(fā)明核酸其形式適于在宿主細胞中表達，這意味著所述重組表達載體包含一個或多個根據(jù)用于表達的宿主細胞選擇的調(diào)節(jié)序列，其與要表達的核酸序列有效連接。對于重組表達載體，“有效連接”意指目的核苷酸序列以其可表達的形式(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或當(dāng)載體導(dǎo)入宿主細胞中時在宿主細胞中)與一個或多個調(diào)節(jié)序列連接。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。這樣的調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel(1990)Methods Enzymol.1853-7。調(diào)節(jié)序列包括在許多類型的宿主細胞中控制核苷酸序列組成型表達的序列以及僅在某些宿主細胞中控制核苷酸序列表達的序列(例如組織特異性調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到可根據(jù)以下因素設(shè)計表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞的選擇、需要的蛋白表達水平等。本發(fā)明的表達載體可導(dǎo)入宿主細胞中，由此生產(chǎn)由本文所述核酸編碼的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽(例如PSGL-1蛋白、突變形式的PSGL-1蛋白、融合蛋白等)。
用于本發(fā)明方法的重組表達載體可用來在原核細胞或真核細胞中表達P-選擇蛋白配體蛋白。例如，可在細菌細胞(如大腸桿菌)、昆蟲細胞(使用桿狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞中表達PSGL-1蛋白。Goeddel(1990)同上也討論了適合的宿主細胞。或者，所述重組表達載體可體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如使用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。
以原核細胞表達蛋白最常用載體在大腸桿菌中進行，其中所述載體含控制融合或非融合蛋白表達的組成型或誘導(dǎo)型啟動子。融合載體向其編碼蛋白中加入許多氨基酸，通常加入到重組蛋白的氨基末端。所述融合載體通常有三個目的1)增加重組蛋白的表達；2)增加重組蛋白的溶解性；和3)有助于通過在親和層析中作為配體純化重組蛋白。通常，在融合表達載體中，在融合部分和重組蛋白的接合處引入蛋白酶切割位點，以能夠在純化融合蛋白后分離融合部分和重組蛋白。所述酶及其關(guān)連識別序列包括Xa因子、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene6731-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它們分別使谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或A蛋白與靶重組蛋白融合。
純化的融合蛋白可用于PSGL-1活性測定(例如以下詳述的直接測定或競爭性測定)或用于生產(chǎn)PSGL-1蛋白特異性抗體。
在另一個實施方案中，使用哺乳動物表達載體在哺乳動物細胞中表達本發(fā)明核酸。哺乳動物表達載體的實例包括pCDM8(Seed，B.(1987)Nature329840)和pMT2PC(Kauftnan等(1987)EMBO J.6187-195)。當(dāng)在哺乳動物中使用時，表達載體的控制功能經(jīng)常由病毒調(diào)節(jié)元件提供。例如，通常使用的啟動子來源于多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒和猿猴病毒40。關(guān)于其它同時適用于原核細胞和真核細胞的表達系統(tǒng)，參見Sambrook，J.等，Molecular CloningA LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中的第16章和第17章。
在另一個實施方案中，重組哺乳動物表達載體能夠控制核酸優(yōu)先在特定細胞類型中表達(例如使用組織特異性調(diào)節(jié)元件表達所述核酸)。
本發(fā)明方法還可使用含本發(fā)明DNA分子的重組表達載體，其中所述本發(fā)明DNA分子以反義方向克隆入表達載體。即，所述DNA分子以允許與PSGL-1 mRNA反義的RNA分子表達(通過DNA分子轉(zhuǎn)錄)的方式與調(diào)節(jié)序列有效連接?？梢赃x擇控制所述反義RNA分子在各種細胞類型中連續(xù)表達的調(diào)節(jié)序列，例如病毒啟動子和/或增強子，其與以反義方向克隆的核酸有效連接，或者可選擇控制反義RNA組成型表達、組織特異性表達或細胞類型特異性表達的調(diào)節(jié)序列。反義表達載體可以為重組質(zhì)粒、噬菌?；驕p毒病毒形式，其中反義核酸在高效調(diào)節(jié)區(qū)控制下生產(chǎn)，其活性可根據(jù)導(dǎo)入載體的細胞類型確定。關(guān)于使用反義基因調(diào)節(jié)基因表達的論述，參見Weintraub，H.等，反義RNA作為遺傳分析的分子工具，Reviews-Trends in Genetics，1(1)卷1986。
本發(fā)明另一方面涉及使用本發(fā)明的PSGL-1核酸分子導(dǎo)入其中的宿主細胞，例如重組表達載體含有的PSGL-1核酸分子或允許其同源重組入宿主細胞特定位點含PSGL-1核酸分子的序列。術(shù)語“宿主細胞”或“重組宿主細胞”在本文交互使用。應(yīng)當(dāng)理解，所述術(shù)語不僅指特定的題述細胞，而且指該細胞的后代或潛在后代。因為在傳代過程中由于突變或環(huán)境影響可能發(fā)生某些變化，這樣的后代實際上可能與母細胞不一樣，但仍包括在本文使用的該術(shù)語范圍內(nèi)。
宿主細胞可以為任何原核細胞或真核細胞，例如PSGL-1蛋白可以在細菌細胞(例如大腸桿菌)、昆蟲細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或COS細胞)中表達。其它合適的宿主細胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
許多類型的細胞都可作為適于表達P-選擇蛋白配體蛋白的宿主細胞。適合的宿主細胞能夠連上功能性P-選擇蛋白配體蛋白特有的碳水化合物側(cè)鏈。這種能力可借助于宿主細胞中存在的合適的糖基化酶產(chǎn)生，無論所述糖基化酶是天然存在、化學(xué)誘變誘導(dǎo)產(chǎn)生還是用合適的表達質(zhì)粒(含所述糖基化酶編碼DNA序列)轉(zhuǎn)染宿主細胞獲得。宿主細胞包括例如猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人腎293細胞、人表皮A431細胞、人Colo205細胞、3T3細胞、CV-1細胞、其它轉(zhuǎn)化的靈長類細胞系、正常二倍體細胞、衍生于原代組織體外培養(yǎng)物的細胞株、原代移植物、Hela細胞、小鼠L細胞、BHK、HL-60、U937或Hak細胞。
還可以通過將本發(fā)明的分離DNA和一個或多個合適糖基化酶的編碼DNA與一個或多個昆蟲表達載體中的合適控制序列有效連接，并使用昆蟲表達系統(tǒng)，生產(chǎn)P-選擇蛋白配體蛋白。用于桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)的材料和方法可以試劑盒的形式由例如Invitrogen，SanDigeo，California，U.S.A.商購(MaxBac試劑盒)，并且所述方法在本領(lǐng)域眾所周知，描述于例如Summers和SmithTexas AgriculturalExperiment station Bulletin，No.1555(1987)，該文獻通過引用結(jié)合到本文中。還可以使用上述合適的分離DNA在昆蟲細胞中生產(chǎn)可溶形式的P-選擇蛋白配體蛋白。一種PACE的編碼DNA還可在昆蟲宿主細胞中共表達，以生產(chǎn)PACE切割形式的P-選擇蛋白配體蛋白。
或者，可以在低等真核細胞(例如酵母)或在原核細胞(例如細菌)中生產(chǎn)P-選擇蛋白配體蛋白。潛在合適的酵母菌株包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母菌屬菌株(Kluyveromyces)、假絲酵母菌屬(Candida)或任何能夠表達異源蛋白的酵母菌株。潛在合適的細菌菌株包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)或任何能夠表達異源蛋白的細菌菌株。如果用酵母或細菌生產(chǎn)P-選擇蛋白配體蛋白，則必須將合適的碳水化合物共價連接至蛋白部分上的合適部位，以便獲得糖基化P-選擇蛋白配體蛋白。這樣的共價連接可使用已知的化學(xué)或酶法實現(xiàn)。
可通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入到原核或真核細胞中。本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)染”意指本領(lǐng)域公知的各種將外源核酸(例如DNA)導(dǎo)入宿主細胞中的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔。合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞的方法可見于Sambrook等(Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其它實驗室指南。
用于本發(fā)明方法的宿主細胞，例如培養(yǎng)的原核或真核宿主細胞，可用于生產(chǎn)(即表達)PSGL-1蛋白。因此，本發(fā)明還提供使用本發(fā)明宿主細胞生產(chǎn)PSGL-1蛋白的方法。在一個實施方案中，所述方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明宿主細胞(編碼PSGL-1蛋白的重組表達載體已導(dǎo)入其中)，以生產(chǎn)PSGL-1蛋白。在另一個實施方案中，所述方法還包括由培養(yǎng)基或宿主細胞中分離PSGL-1蛋白。
IV.使用方法本發(fā)明同時提供治療、預(yù)防或減輕有缺血性疾病和/或再灌注損傷(包括中風(fēng))風(fēng)險或易患此類疾病的患者(例如人)組織損傷的預(yù)防和治療方法。關(guān)于治療的預(yù)防和治療方法，所述治療可根據(jù)由藥物基因組領(lǐng)域獲得的知識特別調(diào)整或修改。本文使用的“治療”定義為以治療、治愈、緩解、減輕、變更、減輕、改善、改進或影響疾病、癥狀或素因為目的，向患病、癥狀或素因的患者施用或給予治療藥物，或向其離體組織或細胞系施用或給予治療藥物。
本文使用的“藥物基因組”是指對臨床開發(fā)或上市藥物使用基因組技術(shù)，例如基因測序、統(tǒng)計遺傳學(xué)和基因表達分析。更具體地說，該術(shù)語指研究患者基因如何決定其對藥物的反應(yīng)(例如患者的“藥物反應(yīng)表型”或“藥物反應(yīng)基因型”)。
因此，本發(fā)明另一方面提供按照個體的藥物反應(yīng)基因型，對患者的預(yù)防或治療性治療(治療采用本發(fā)明的P-選擇蛋白拮抗劑或P-選擇蛋白配體調(diào)節(jié)劑)進行個體化的方法。藥物基因組學(xué)使臨床醫(yī)生或醫(yī)師可將診斷或治療性治療定位于將由該治療獲得最大利益的患者，并避免治療患者遭受毒性藥物相關(guān)的副作用。
A.預(yù)防和治療方法P-選擇蛋白具有幾個與血管損傷和血栓形成有關(guān)的功能，包括介導(dǎo)白細胞在血管內(nèi)皮上滾動；促進血小板與白細胞互相作用，導(dǎo)致白細胞活化，并由這些活化細胞釋放組織因子豐富的微?；蜥尫糯傺捉閷?dǎo)物，進一步活化內(nèi)皮細胞，促使更多白細胞捕獲；捕獲凝塊和內(nèi)皮上的白細胞源微粒，促進凝塊增長；以及堵塞微血管，擴大了缺血區(qū)域。P-選擇蛋白特異性抑制劑與其配體PSGL-1相互作用，預(yù)期將明顯減少這些事件。對于rPSGL-Ig，該可溶性配體構(gòu)建物預(yù)計結(jié)合內(nèi)皮細胞和血小板上表達的P-選擇蛋白，因此降低白細胞或白細胞源微粒表面上的天然PSGL-1的結(jié)合能力。在導(dǎo)致P-選擇蛋白/PSGL-1相互作用增加的情況下，rPSGL-Ig存在的作用就是減輕炎癥和血栓形成反應(yīng)。
抑制P-選擇蛋白/PSGL-1相互作用對血栓性中風(fēng)特別有用。用rPSGL-Ig減少活化血小板/白細胞復(fù)合物的形成通過減少由于P-選擇蛋白/PSGL-1相互作用形成的血小板/白細胞復(fù)合物引起的血管堵塞，可提升血管堵塞下游的微血管流量。這可減小腦栓塞增長，因此減輕長期腦損傷的程度。纖溶劑治療限于中風(fēng)初始臨床癥狀后的3小時，這主要是因為出血的風(fēng)險較高，且對較長的中風(fēng)后階段沒有明顯的療效。因為rPSGL-Ig沒有明顯促進出血趨勢，但可通過其對組織因子途徑和凝塊增加的作用促進溶解提升，所以rPSGL-Ig與纖溶劑組合治療可能有利于加速溶解反應(yīng)。另外，通過減小白細胞/內(nèi)皮細胞滾動，rPSGL-Ig可減輕凝塊溶解后的再灌注損傷程度，因此明顯減小梗塞面積。最后，中風(fēng)后的腦水腫可能是緩慢發(fā)展的血管炎癥事件的結(jié)果，這些事件由選擇蛋白介導(dǎo)，并導(dǎo)致微血管完整性損壞。rPSGL-Ig通過抑制這些長期事件可減緩出現(xiàn)水腫的趨勢。水腫減輕可明顯降低與血栓性中風(fēng)相關(guān)的患病率和死亡率。
使用rPSGL-Ig還可能有利于治療出血性中風(fēng)患者。與rPSGL-Ig相關(guān)的出血少至無應(yīng)使早期給藥的中風(fēng)患者相對安全。已知出血通過由激活血細胞和/或凝結(jié)途徑釋放的炎癥介導(dǎo)物(包括血清素、凝血酶和白三烯C4)，促進組織炎癥。這些藥物已知促進血小板和內(nèi)皮細胞上的P-選擇蛋白表達。通過用選擇蛋白拮抗劑進行早期干預(yù)降低這些次級炎癥反應(yīng)，可以證明對減輕與出血性中風(fēng)相關(guān)的患病率和死亡率非常有效。
一方面，本發(fā)明提供一種方法通過給予患者一種組合物，調(diào)節(jié)(例如治療、預(yù)防或減輕)所述患者由缺血(例如中風(fēng))后再灌注損傷引起的器官或組織損傷(例如腦損傷)，其中所述組合物包含調(diào)節(jié)PSGL-1表達或PSGL-1活性(例如調(diào)節(jié)P-選擇蛋白或E-選擇蛋白結(jié)合、調(diào)節(jié)細胞粘附(例如大腦中的細胞與細胞粘附，如白細胞-內(nèi)皮細胞粘附和白細胞-血小板粘附)和細胞(例如白細胞)與血管的粘附以及調(diào)節(jié)例如大腦小靜脈中白細胞滾動)的物質(zhì)。可通過例如本文描述的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的診斷或預(yù)后測定中的任一種或組合鑒別有缺血和/或再灌注損傷風(fēng)險的患者。
將患者置于由缺血和再灌注引起的組織或器官損傷風(fēng)險之中并使其成為本發(fā)明P-選擇蛋白拮抗劑治療目標的缺血性疾病包括例如中風(fēng)、腸系膜及外周血管疾病、器官移植、循環(huán)休克和血栓形成疾病，如血栓栓塞、深靜脈血栓形成、肺栓塞、中風(fēng)、心肌梗塞、流產(chǎn)、與抗凝血酶III缺乏、C蛋白缺乏、S蛋白缺乏、抗活性C蛋白相關(guān)的血栓形成傾向、血纖維蛋白原異常、纖溶病、高胱氨酸尿、妊娠、炎癥、骨髓增生性疾病、動脈硬化、心絞痛(如不穩(wěn)定型心絞痛)、彌散性血管內(nèi)凝血、血栓性血小板減少性紫癜、癌轉(zhuǎn)移、鐮狀細胞病和腎小球腎炎。
可在再灌注前給予預(yù)防或治療劑，例如P-選擇蛋白配體分子或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段(如可溶性PSGL-1或可溶性重組PSGL融合蛋白(例如rPSGL-Ig))、抗P-選擇蛋白抗體或其生物活性片段、或抗P-選擇蛋白配體抗體或其生物活性片段，使組織和器官(如腦)損傷和梗塞體積受到抑制或減輕。
給予患者P-選擇蛋白拮抗劑(例如抗P-選擇蛋白抗體、抗P-選擇蛋白配體抗體、可溶性P-選擇蛋白配體、可溶性PSGL-1或其片段、或可溶性rPSGL-Ig)以治療、預(yù)防或減輕缺血和/或再灌注后的器官或組織損傷的方法包括但不限于以下方法。
給予患者的本發(fā)明可溶性P-選擇蛋白拮抗劑為適于所述給予的藥用組合物形式。所述組合物通常包含有效量的活性藥物(例如蛋白或抗體)和藥用載體。本文使用的詞語“藥用載體”包括任何和所有與藥物給予相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這些介質(zhì)和物質(zhì)對藥用活性物質(zhì)的用途本領(lǐng)域眾所周知。除非任一常規(guī)介質(zhì)或物質(zhì)與活性藥物不相容，否則還考慮其在組合物中的用途。組合物中還可以加入其它活性化合物。
用于本發(fā)明治療方法的藥用組合物要配制得與其要給予的途徑相匹配。
給藥途徑的實例包括胃腸外(例如靜脈、皮內(nèi)、皮下)、口服(例如吸入)、經(jīng)皮(局部)、粘膜和直腸給藥。用于胃腸外、皮內(nèi)或皮下給藥的溶液或懸浮液可包含以下組分無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑，例如芐醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩沖劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)，例如氯化鈉和葡萄糖。pH可用酸或堿調(diào)節(jié)，例如鹽酸或氫氧化鈉。胃腸外制劑可封裝入安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制的多劑量小瓶。
適于注射用的藥用組合物包括無菌水溶液(水溶性的)或分散劑和用無菌可注射溶液或分散劑即時配制的無菌粉劑。對于靜脈內(nèi)給藥，適合的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，所述組合物必須無菌，并應(yīng)當(dāng)是達到易注射程度的液體。其在生產(chǎn)和儲存條件下必須穩(wěn)定，必須防腐以防微生物(例如細菌和真菌)污染。所述載體可以是包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)的溶劑或分散介質(zhì)及其合適混合物。例如通過使用包衣劑(例如卵磷脂)、在分散劑情況下通過維持需要的顆粒大小和通過使用表面活性劑，可以維持適宜的流動性?？赏ㄟ^各種抗菌劑和抗真菌劑(例如羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等)達到防止微生物的作用。在許多情況下，組合物中優(yōu)選包括等滲劑，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)和氯化鈉。組合物中包含延遲吸收物質(zhì)(如一硬脂酸鋁和明膠)可使注射性組合物的延長吸收。
可通過在合適溶劑中加入需要量的調(diào)節(jié)PSGL-1活性的藥物(例如可溶性PSGL-1蛋白片段)以及根據(jù)需要加入上述成分中的一種或組合，然后除菌過濾，制備無菌注射溶液。一般來說，通過在含有基本分散介質(zhì)和需要的上述其它成分的無菌溶媒中加入活性化合物制備分散劑。對于用于制備無菌注射溶液的無菌粉劑，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干，由其先前除菌過濾溶液產(chǎn)生活性成分以及任何其它所需成分的粉末。
口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用的載體。它們可以封裝入明膠膠囊或壓成片劑。為口服治療給藥，活性化合物可加入賦形劑，并以片劑、錠劑、膠囊形式使用。還可以使用液態(tài)載體制備用作漱口藥的口服組合物，其中在液態(tài)載體中的化合物口用嗽口，然后吐出或吞咽?？砂帉W(xué)上相容的結(jié)合劑和/或佐劑物質(zhì)作為所述組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可包含任何以下組分或類似性質(zhì)的化合物結(jié)合劑，例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖；崩解劑，例如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑，如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑，例如膠質(zhì)二氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑，例如薄荷油、水楊酸甲酯或橙味調(diào)味劑。
對于吸入給藥，由含合適噴射劑(例如二氧化碳之類的氣體)的壓力容器或分配器或噴霧器傳遞氣溶膠噴物形式的所述化合物。
還可以通過經(jīng)粘膜或經(jīng)皮方法全身給藥。對于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮給藥，在制劑中使用適于穿透屏障的滲透劑。這樣的滲透劑一般是本領(lǐng)域已知的，包括例如用于經(jīng)粘膜給藥的去污劑、膽汁酸鹽和梭鏈孢酸衍生物。經(jīng)粘膜給藥可通過使用鼻噴霧劑或栓劑實現(xiàn)。對于經(jīng)皮給藥，可將活性化合物配制為本領(lǐng)域周知的軟膏劑、油膏劑、凝膠劑或乳膏劑。
還可以制備栓劑(例如用常規(guī)栓劑基質(zhì)，例如可可油和其它甘油酯)或保留灌腸形式的調(diào)節(jié)PSGL-1活性的藥物，用于直腸傳遞。
在一個實施方案中，用保護化合物免從機體快速清除的載體制備調(diào)節(jié)PSGL-1活性的藥物，例如控釋制劑，包括植入劑和微囊化傳遞系統(tǒng)。可以使用生物可降解、生物可相容聚合物，例如乙烯基乙二酸二乙酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制備這些制劑的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些物質(zhì)也可以由Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.商購。也可以使用脂質(zhì)體懸浮液(包括用抗病毒抗原單克隆抗體的靶向感染細胞的脂質(zhì)體)作為藥用載體。這些物質(zhì)可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，例如美國專利第4,522,811號描述的方法。
配制單位劑量形式的口服或胃腸外組合物特別有利，因為易于給予且劑量均一。本文使用的單位劑量形式是指適于作為要治療患者單一劑量的物理分散單位；每單位包含預(yù)定量的活性化合物，目的在于產(chǎn)生與需要的藥用載體相關(guān)的理想療效。PSGL-1活性調(diào)節(jié)藥物的獨有特征和要達到的特定療效以及本領(lǐng)域配制所述患者治療藥物的固有限制決定并直接決定了本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格。
可通過標準藥學(xué)細胞培養(yǎng)或?qū)嶒炇覄游锓椒y定所述藥物的毒性和療效，例如，測定LD50(群體50％致死的劑量)和ED50(群體50％治療有效的劑量)。毒性和療效之間的劑量比率是治療指數(shù)，可表示為LD50/ED50比率。優(yōu)選治療指數(shù)大的藥物。盡管可使用具有毒副作用的藥物，但應(yīng)小心設(shè)計將所述藥物靶向染病組織部位的傳遞系統(tǒng)，以便使對未感染細胞的潛在損傷最小，由此降低副作用。
由細胞培養(yǎng)測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于配制一系列人用劑量。所述PSGL-1調(diào)節(jié)藥物的劑量優(yōu)選處于循環(huán)濃度(包含ED50但幾乎沒有或沒有毒性)范圍內(nèi)。劑量可根據(jù)使用的劑型和使用的給藥途徑在此范圍內(nèi)變化。對于用于本發(fā)明治療方法的任一藥物，開始可由細胞培養(yǎng)測定評價治療有效劑量?？筛鶕?jù)細胞培養(yǎng)的測定，用動物模型配制達到循環(huán)血漿濃度范圍(包含IC50，即測試化合物濃度達到癥狀最大抑制的一半)的劑量。此信息可用于更精確地測定人中的有效劑量。例如可通過高效液相層析檢測血漿水平。
本文定義的蛋白或多肽的治療有效量(即有效劑量)范圍為約0.001-30mg/kg體重，優(yōu)選約0.01-25mg/kg體重，更優(yōu)選約0.1-20mg/kg體重，再更優(yōu)選約1-10mg/kg體重、2-9mg/kg體重、3-8mg/kg體重、4-7mg/kg體重或5-6mg/kg體重。技術(shù)人員將認識到，某些因素可能影響有效治療患者所需的劑量，這些因素包括但不限于疾病的嚴重性、先前的治療、患者的一般健康情況和/或年齡以及所患的其它疾病。此外，用治療有效量的蛋白、多肽或抗體治療患者可包括單獨治療，或者優(yōu)選可包括一系列的治療。
在一個優(yōu)選實施方案中，用抗體、蛋白或多肽治療患者，其劑量范圍為約0.1-20mg/kg體重，每周一次，大約1-10周，優(yōu)選2-8周，更優(yōu)選約3-7周，再更優(yōu)選約4、5、或6周。還應(yīng)認識到，用于治療的抗體、蛋白或多肽的有效劑量在具體治療中可增加或降低。根據(jù)本文描述的診斷測定的結(jié)果可改變劑量，而是顯而易見。
本發(fā)明包括調(diào)節(jié)表達或活性的藥物。藥物例如可以是小分子。例如，所述小分子包括但不限于肽、肽模擬物、氨基酸、氨基酸類似物、多核苷酸、多核苷酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、分子量小于10,000g/mol的有機或無機化合物(即包括雜原子有機化合物(heteroorganic compound)和有機金屬化合物)、分子量小于5000g/mol的有機或無機化合物、分子量小于1,000g/mol的有機或無機化合物、分子量小于5,00g/mol的有機或無機化合物以及所述化合物的鹽、酯和其它藥用形式。應(yīng)當(dāng)理解的是，小分子藥物的合適劑量取決于很多因素，這些因素在一般醫(yī)生、獸醫(yī)或研究者的知識范圍內(nèi)。所述小分子的劑量例如可根據(jù)要治療患者或處理樣本的身份、外形和狀況而改變，如果適用的話，還可根據(jù)所述組合物的給予途徑改變，還可根據(jù)執(zhí)業(yè)醫(yī)師希望所述小分子所具有的對本發(fā)明核酸或多肽的作用而改變。
代表劑量包括mg或μg量/kg患者或樣本重量的所述小分子(例如約1μg/kg至約500mg/kg、約100μg/kg至約5mg/kg或約1μg/kg至約50mg/kg)。還要理解的是，小分子的合適劑量取決于小分子調(diào)節(jié)表達或活性的潛力?？墒褂帽疚乃鰷y定確定所述合適劑量。當(dāng)將一種或多種這些小分子給予動物(例如人)以便調(diào)節(jié)本發(fā)明多肽或核酸的表達或活性時，醫(yī)生、獸醫(yī)或研究者例如可首先開相對較低劑量的處方，隨后增加劑量，直至獲得合適的反應(yīng)。另外，應(yīng)當(dāng)理解，對于任一具體動物患者的特定劑量水平取決于多種因素，包括使用的具體化合物的活性、患者的年齡、體重、一般健康情況、性別和飲食狀況、給藥時間、給藥途徑、排泄速率、任何藥物組合以及表達或活性要調(diào)節(jié)的程度。
此外，抗體(或其片段)可綴合至治療部分，例如治療劑或放射性金屬離子。治療藥物包括但不限于抗代謝物(例如氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯唑胺(decarbazine))、烷化劑(例如氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥(BSNU)和環(huán)己亞硝脲(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲菌素、絲裂霉素C和順-二氯二胺鉑(II)(DDP)、順鉑)、蒽環(huán)類(例如柔紅霉素(以前稱為道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前稱為放線菌素)、博來霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有絲分裂劑(例如長春新堿和長春花堿)。
本發(fā)明的綴合物可用于改進某種已知生物反應(yīng)，不能將藥物部分理解為限于經(jīng)典化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是具有需要生物活性的蛋白或多肽。這樣的蛋白可包括例如毒素，如相思豆毒蛋白、篦麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白，例如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖溶酶源激活物；或生物反應(yīng)改進劑，例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生長因子。
使所述治療部分與抗體綴合的技術(shù)是眾所周知的，參見例如Arnon等，“癌癥治療中用于藥物免疫靶向的單克隆抗體”，載于Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(編輯)，第243-56頁(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等“用于藥物傳遞的抗體”，載于Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等(編輯)，第623-53頁(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“癌癥治療中細胞毒性劑的抗體載體綜述”，載于Monoclonal Antibodies′84Biological AndClinical Applications，Pinchera等(編輯)，第475-506頁(1985)；“放射性標記抗體在癌癥治療中的治療用途的分析、結(jié)果和未來展望”，載于Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(編輯)，第303-16頁(Academic Press 1985)和Thorpe等，“抗體-毒素綴合物的制備和細胞毒性特征”，Immunol.Rev.，62119-58(1982)?；蛘?，可將抗體綴合至二抗，以形成Segal在美國專利第4,6776,980號所述的抗體復(fù)共軛對配合物(heteroconjugate)。
用于本發(fā)明方法的核酸分子可插入到載體中，并可用作基因治療載體?；蛑委熭d體可通過例如靜脈注射、局部給藥(參見美國專利5,328,470)或定向注射(參見例如Chen等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA913054-3057)傳遞給患者?；蛑委熭d體的藥物制劑可包括基因治療載體的藥用稀釋劑溶液，或者可包含其中嵌入基因傳遞載體的緩釋基質(zhì)。或者，可由重組細胞完整地生產(chǎn)整個基因傳遞載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，藥物制劑可包含生產(chǎn)基因傳遞系統(tǒng)的一種或多種細胞。
B.藥物基因組學(xué)可考慮將藥物基因組學(xué)(即研究患者基因型與患者對外來化合物或藥物的反應(yīng)之間的關(guān)系)與本發(fā)明治療方法相結(jié)合。治療藥物的代謝差異可通過改變藥學(xué)活性藥物的劑量和血液濃度之間的關(guān)系而導(dǎo)致嚴重的毒性或治療失敗。因此，醫(yī)師或臨床醫(yī)生可考慮應(yīng)用由相關(guān)藥物基因組學(xué)研究獲得的知識決定是否給予P-選擇蛋白拮抗劑(例如可溶性PSGL-1)以及具體確定PSGL-1活性調(diào)節(jié)藥物的治療劑量和/或治療方案。
藥物基因組學(xué)涉及由于藥物處置改變和染病個體的不正常反應(yīng)而產(chǎn)生的藥物反應(yīng)中的臨床顯著性固有偏差。參見例如Eichelbaum，M.等(1996)Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23(10-11)983-985和Linder，M.W.等(1997)Clin.Chem.43(2)254-266。一般來說，能夠區(qū)別兩類藥物遺傳因素。
遺傳因素以改變藥物作用于機體(改變藥物作用)的單因素傳遞，或者遺傳因素以改變機體作用于藥物(改變藥物代謝)的單因素傳遞。這些藥物遺傳因素或者可以罕有的遺傳缺陷出現(xiàn)，或者可以天然的多態(tài)性出現(xiàn)。例如，葡萄糖-6-磷酸氨基肽酶缺陷(G6PD)是一種常見遺傳性酶病，其重要臨床并發(fā)癥是在攝入氧化藥物(抗瘧藥、磺胺、鎮(zhèn)痛藥、硝基呋喃)和食用蠶豆后出現(xiàn)溶血。
一種鑒定預(yù)測藥物反應(yīng)的基因的藥物基因組方法稱為“全基因組相關(guān)”，主要依靠由已知基因相關(guān)標記組成的高分辨率人類基因組圖譜(例如由人類基因組上60,000-100,000個多態(tài)或可變位點組成的“雙等位”基因標記圖譜，它們每個都具有兩個變異體)。這種高分辨率基因圖譜可與參與II/III期藥物實驗的統(tǒng)計學(xué)上數(shù)量顯著的患者每一個的基因組圖譜對比，以鑒定與觀察到的特定藥物反應(yīng)或副作用相關(guān)的標記?；蛘?，這種高分辨率圖譜可產(chǎn)生自人類基因組中幾千萬已知單核苷酸多態(tài)性(SNP)的組合。本文使用的“SNP”是一種常見的發(fā)生在DNA主鏈中的單個核苷酸堿基改變。例如，每1000個DNA堿基可出現(xiàn)一個SNP。SNP可能參與疾病進程，但絕大多數(shù)可能與疾病無關(guān)。給定基于出現(xiàn)所述SNP的基因圖譜，可根據(jù)其各個基因組中SNP的具體模式將個體分類為多個遺傳類別。按照這種方式，考慮到遺傳相似不同個體共同特征，對這些不同類型的遺傳相似個體制定不同治療方案。
或者，可使用一種稱為“候選基因方案”的方法鑒別預(yù)測藥物反應(yīng)的基因。按照此方法，如果已知編碼藥物靶(例如本發(fā)明的PSGL-1蛋白)的基因，則可相當(dāng)輕易的鑒定出人群中該基因的所有常見變異體，并可判定一種基因相對于另一種基因是否與特定藥物反應(yīng)相關(guān)。
作為一個說明性的實施方案，藥物代謝酶的活性是藥物作用的強度和長度的主要決定因素。藥物代謝酶(例如N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2(NAT2)和細胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)遺傳多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)解釋了某些患者為什么沒有獲得預(yù)期的藥效或在攝入標準和安全劑量藥物后顯示出過大藥物反應(yīng)和嚴重毒性。這些多態(tài)性在人群中表現(xiàn)為兩種表型強代謝者(EM)和弱代謝者(PM)。PM率在不同人群存在差異。例如，編碼CYP2D6的基因高度多態(tài)性，已在PM中鑒定出幾種突變，這些突變都導(dǎo)致功能性CYP2D6缺失。CYP2D6和CYP2C19的弱代謝者在接受標準劑量時相當(dāng)頻繁地經(jīng)歷過大藥物反應(yīng)和副作用。如果代謝物是活性治療部分，則根據(jù)對其CYP2D6形成的代謝物嗎啡介導(dǎo)的可待因止痛作用證實，PM沒有顯示出治療反應(yīng)。另一極端是所謂的超強代謝者，它們對標準劑量沒反應(yīng)。近來，已識別出超強代謝的分子基礎(chǔ)是源于CYP2D6基因擴增。
或者，可使用一種稱為“基因表達模式”的方法鑒定預(yù)測藥物反應(yīng)的基因。例如，給藥(例如本發(fā)明的PSGL-1分子或P-選擇蛋白拮抗劑)動物的基因表達可給出一種指示，即與毒性相關(guān)的基因途徑是否已經(jīng)開啟。
由一種以上的上述藥物基因組方案產(chǎn)生的信息可用于確定用于預(yù)防或治療性治療患者的合適劑量和治療方案。這種知識當(dāng)應(yīng)用于給藥和藥物選擇時可避免副反應(yīng)或治療失敗，因此在用P-選擇蛋白活性調(diào)節(jié)藥物治療、預(yù)防或減輕由缺血和/或再灌注損傷引起的組織或器官損傷時增強了治療和預(yù)防效率。
V.篩選測定本發(fā)明提供鑒定調(diào)節(jié)劑的方法(本文也稱為“篩選測定”)，即鑒定結(jié)合PSGL-1蛋白的侯選物或測試化合物或藥物(例如肽、肽類似物、小分子、核酶或PSGL-1反義分子)對PSGL-1表達或PSGL-1活性具有刺激或抑制作用，或者對PSGL-1靶分子(例如P-選擇蛋白或E-選擇蛋白)的表達或活性具有刺激或抑制作用，或者對表達PSGL-1靶分子的細胞(例如內(nèi)皮細胞和活化血小板)有作用(例如抑制細胞遷移或粘附)。使用本文所述測定鑒定的化合物可有效治療、預(yù)防或減輕由缺血后再灌注引起的組織或器官損傷。
侯選/測試化合物包括例如1)肽，例如可溶性肽，包括Ig-尾融合肽和隨機肽文庫成員(參見例如Lau，K.S.等(1991)Nature35482-84；Houghten，R.等(1991)Nature 35484-86)和由D-和/或L-構(gòu)型氨基酸組成的組合化學(xué)衍生分子文庫；2)磷酸肽(例如隨機和部分簡并性定向磷酸肽文庫成員，參見例如Songyang，Z.等(1993)Cell72767-778)；3)抗體(例如多克隆、單克隆、人源化、抗獨特型、嵌合和單鏈抗體以及抗體的Fab、F(ab′)2、Fab表達文庫片段和表位結(jié)合片段)；和4)小有機和無機分子(例如得自組合和天然產(chǎn)物文庫的分子)。
可使用本領(lǐng)域已知組合文庫方法中眾多方案的任一種獲得本發(fā)明的測試化合物，這些方案包括生物文庫、空間可尋址并行固相或溶液相文庫、需要重疊合法的合成文庫法；‘一珠一化合物’文庫法和使用親和層析選擇的合成文庫法。生物文庫法限于肽文庫，而其它4種方案適用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文庫(Lan，K.S.(1997)Anticancer Drug Des.12145)。
分子文庫合成方法的實例在本領(lǐng)域可見于例如DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A906909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111422；Zuckermann等(1994)J.Med.Chem.372678；Cho等(1993)Science2611303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；和Gallop等(1994)J.Med.Chem.371233。
化合物文庫可存在于溶液中(例如Houghten(1992)Biotechnoques13412-421)或在珠上(Lam(1991)Nature35482-84)、芯片(Fodor(1993)Nature364555-556)、細菌(Lander USP5,223,409)、孢子(LadnerUSP′409)、質(zhì)粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869)或噬菌體(Scott和Smith(1990)Science249386-390；Devlin(1990)Science249404-406；Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA876378-6382；Felici(1991)J.Mol.Biol.222301-310；Ladner同上)當(dāng)中。
可用于鑒定PSGL-1活性或P-選擇蛋白活性調(diào)節(jié)化合物的測定包括使用51Cr-標記細胞(例如白細胞)的細胞粘附測定(如例如Kennedy等(2000)Br J Pharmacology 130(1)95所述)以及細胞遷移測定，例如血小板、嗜中性粒細胞和白細胞遷移(如例如Kogaki等(1999)Cardiovascular Res43(4)968)和Bengtsson等(1999)Scand J Clin LabInvest59(6)439所述)。
一方面，一種測定是細胞型測定，其中表達PSGL-1蛋白或其生物活性部分的細胞據(jù)認為涉及P-選擇蛋白(例如SEQ ID NO2的氨基酸殘基42-60)或E-選擇蛋白的結(jié)合，使該細胞與測試化合物接觸，測定測試化合物調(diào)節(jié)PSGL-1活性的能力。在一個優(yōu)選實施方案中，PSGL-1蛋白的生物活性部分包括能夠與P-選擇蛋白相互作用或抑制P-選擇蛋白介導(dǎo)的細胞粘附的結(jié)構(gòu)域或基序。可通過監(jiān)測例如細胞粘附或細胞遷移測定測試化合物調(diào)節(jié)PSGL-1活性的能力。所述細胞例如可以是哺乳動物來源，例如內(nèi)皮細胞或白細胞。
還可以測定測試化合物調(diào)節(jié)PSGL-1結(jié)合底物的能力或測試化合物結(jié)合PSGL-1的能力。例如可通過使PSGL-1底物與放射性同位素或酶標記偶聯(lián)，使得PSGL-1底物與PSGL-1的結(jié)合可通過檢測復(fù)合物中標記的PSGL-1底物測定，來測定測試化合物調(diào)節(jié)PSGL-1結(jié)合底物的能力。或者，可使PSGL-1偶聯(lián)放射性同位素或酶標記，以監(jiān)測測試化合物調(diào)節(jié)復(fù)合物中PSGL-1與PSGL-1底物結(jié)合的能力。例如可通過使測試化合物與放射性同位素或酶標記偶合，使得測試化合物與PSGL-1的結(jié)合可通過檢測復(fù)合物中標記的PSGL-1化合物測定，來測定測試化合物結(jié)合PSGL-1的能力。例如，可用125I、35S、14C或3H直接或間接標記PSGL-1底物，通過直接記數(shù)放射性發(fā)射或通過閃爍記數(shù)檢測同位素?；蛘撸捎美缋备^氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光素酶酶標記化合物，并通過測定合適底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化檢測酶標記。
測定化合物與PSGL-1相互作用的能力而不標記任何作用物也屬于本發(fā)明的范圍。例如，可使用微生理功能測定儀檢測化合物與PSGL-1的相互作用，而不標記化合物或PSGL-1(McConnell，H.M.等(1992)Science2571906-1912)。本文使用的“微生理功能測定儀”(例如細胞傳感器)是一種分析儀器，使用光尋址電位傳感器(LAPS)檢測細胞酸化其環(huán)境的速率。酸化速率的改變可用于指示化合物與PSGL-1之間的相互作用。
在再另一個實施方案中，本發(fā)明的測定是一種無細胞測定，其中PSGL-1蛋白或其生物活性部分(例如能夠結(jié)合P-選擇蛋白的PSGL-1蛋白片段)與測試化合物接觸，并測定測試化合物結(jié)合PSGL-1或其生物活性部分的能力或調(diào)節(jié)(例如刺激或抑制)其活性的能力。優(yōu)選用于本發(fā)明測定的PSGL-1蛋白的生物活性部分包括參與和非PSGL-1分子相互作用的片段，例如具有高表面概率得分的片段?？扇缟纤鲋苯踊蜷g接測定測試化合物與PSGL-1蛋白的結(jié)合。還可以使用實時生物分子相互作用分析(BIA)(Sjolander，S.和Urbaniczky，C.(1991)Anal.Chem.632338-2345；Szabo等(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5699-705)之類的技術(shù)測定PSGL-1蛋白結(jié)合測試化合物的能力。本文使用的“BIA”是一種實時研究生物特異性反應(yīng)的技術(shù)，沒有對任何反應(yīng)物進行標記(例如BIAcore)。表面胞質(zhì)共振(SPR)光學(xué)現(xiàn)象的改變可用于指示生物分子間的實時反應(yīng)。
在本發(fā)明上述測定方法的一個以上的實施方案中，對PSGL-1或P-選擇蛋白進行固定化可能比較理想，便于分離復(fù)合與未復(fù)合形式的一種或兩種蛋白，以及便于該測定的自動化?？稍谌魏芜m于包含反應(yīng)物的容器中完成測試化合物與PSGL-1蛋白的結(jié)合或在有或沒有測試化合物的情況下PSGL-1蛋白與P-選擇蛋白的相互作用。所述容器的實例包括微量滴定板、試管和微量離心管。在一個實施方案中，可提供加入結(jié)構(gòu)域以允許一種或兩種蛋白結(jié)合基質(zhì)的融合蛋白。例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/PSGL-1融合蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/靶融合蛋白可吸附到谷胱甘肽瓊脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍化微量滴定板上，然后與測試化合物混合或測試化合物和未吸附靶蛋白或PSGL-1蛋白混合，混合物在有助于形成復(fù)合物的條件下(例如在生理條件的鹽和pH下)溫育。溫育后，洗滌所述珠或微量滴定板，以去除任何未結(jié)合的組分，對于珠來說基質(zhì)是固定的，例如如上所述直接或間接測定形成的復(fù)合物?；蛘撸蓪?fù)合物由基質(zhì)上解離下來，使用標準技術(shù)測定PSGL-1結(jié)合水平或活性水平。
還可以在本發(fā)明的篩選測定中使用其它在基質(zhì)上固定蛋白的技術(shù)。例如，可使用生物素和鏈霉抗生物素綴合物固定PSGL-1蛋白或P-選擇蛋白分子。可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)(例如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)由生物素-NHS(N-羥基-琥珀酰亞胺)制備生物素化PSGL-1蛋白或P-選擇蛋白，并固定在包被鏈霉抗生物素的96孔板(Pierce Chemicals)的孔中?；蛘?，可將與PSGL-1蛋白或P-選擇蛋白反應(yīng)但不阻礙PSGL-1蛋白與其靶分子結(jié)合的抗體衍生化至板的孔中，通過抗體綴合捕獲孔中的未結(jié)合靶蛋白或PSGL-1蛋白。除了上述那些用于GST固定化復(fù)合物的方法以外，檢測所述復(fù)合物的方法還包括使用與PSGL-1蛋白或P-選擇蛋白反應(yīng)的抗體免疫檢測復(fù)合物，以及依靠檢測與PSGL-1蛋白或P-選擇蛋白相關(guān)的酶活性的酶聯(lián)測定。
本發(fā)明的再另一方面，PSGL-1蛋白或其片段(例如能夠結(jié)合P-選擇蛋白或E-選擇蛋白的片段)可在雙雜交測定或三雜交測定中用作“餌蛋白”(參見例如美國專利第5,283,317號；Zervos等(1993)Cell72223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel等(1993)Biotechniques14920-924；Iwabuchi等(1993)Oncogene81693-1696；和Brent WO94/10300)，以鑒定其它結(jié)合或作用于PSGL-1并影響PSGL-1活性的蛋白(“PSGL-1結(jié)合蛋白”或“PSGL-1-bp”)的蛋白。所述PSGL-1結(jié)合蛋白還有可能作為例如PSGL-1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游元件參與由PSGL-1蛋白或PSGL-1靶蛋白傳播的信號?；蛘?，所述PSGL-1結(jié)合蛋白可能為PSGL-1抑制劑。
雙雜交系統(tǒng)基于大多數(shù)由分開的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和活化結(jié)構(gòu)域組成的轉(zhuǎn)錄因子的模塊化特性。簡單來說，所述測定利用兩種不同的DNA構(gòu)建物。在一個構(gòu)建物中，編碼PSGL-1蛋白的基因與編碼已知轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因(例如GAL-4)融合。在另一個構(gòu)建物中，來自DNA序列文庫的編碼未知蛋白(“捕獲物”或“樣品”)的DNA序列融合編碼已知轉(zhuǎn)錄因子活化結(jié)構(gòu)域的基因。如果“餌”和“捕獲物”蛋白能夠在體內(nèi)相互作用形成PSGL-1依賴性復(fù)合物，則所述轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和活化結(jié)構(gòu)域緊密相鄰。這種靠近使得與轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)位點有效連接的報告基因(例如LacZ)轉(zhuǎn)錄。可以檢測報告基因的表達，并可分離包含功能性轉(zhuǎn)錄因子的細胞集落，用其獲得編碼PSGL-1蛋白互作蛋白的克隆基因。
另一方面，本發(fā)明涉及本文所述的兩個或多個測定的組合。例如，可使用細胞型測定或無細胞測定鑒定調(diào)節(jié)藥物，并例如可用動物模型(例如缺血動物模型，如中風(fēng)動物模型)體內(nèi)證實所述藥物調(diào)節(jié)P-選擇蛋白配體拮抗劑活性的能力。缺血和再灌注動物模型包括本文描述的那些模型，以及至少例如Sarabi等(2001)Exp.Neurol.170(2)283-9；Descheerder等(2001)J.Am.Soc.Echocardiogr14(7)691-7；Ohara等(2001)Gene Trer.8(11)837；和Dammers等(2001)Br.J.Surg.88(6)816-24描述的那些模型。
而且，如本文描述鑒定的PSGL-1調(diào)節(jié)劑(例如反義PSGL-1核酸分子、PSGL-1特異性抗體或小分子)可在動物模型中用于測定用所述調(diào)節(jié)劑治療的效力、毒性或副作用?；蛘?，如本文描述鑒定的PSGL-1調(diào)節(jié)劑可在動物模型中用于測定所述調(diào)節(jié)劑的作用機制。
本發(fā)明由以下的實施例進一步闡述，這些實施例不構(gòu)成限制作用。整個本申請中提及的所有參考文獻、專利和已公開專利申請的內(nèi)容以及附圖和序列表都通過引用結(jié)合到本文中。
實施例實施例1P-選擇蛋白配體蛋白融合該實施例描述了二聚體P-選擇蛋白配體融合蛋白(本文也稱為rPSGL-Ig)的生產(chǎn)。構(gòu)建編碼信號肽、PACE切割位點和成熟P-選擇蛋白配體序列的前47個氨基酸的cDNA，其中所述成熟P-選擇蛋白配體序列與人IgG1的成熟Fc區(qū)在天然Fc序列的His224融合。cDNA構(gòu)建物的序列以SEQ ID NO3公告。融合點是位于核苷酸261的新NotI位點。由所述cDNA構(gòu)建物編碼的氨基酸序列以SEQ ID NO4公告。編碼的融合蛋白的成熟氨基酸序始于SEQ ID NO4的氨基酸42開始。Fc區(qū)部分的突變是天然Fc序列的Leu234和Gly237變?yōu)锳la。
實施例2可溶性P-選擇蛋白拮抗劑(RPSGL-IG)對減輕缺血/再灌注腦損傷的有效性該實施例描述了檢測可溶性重組P-選擇蛋白拮抗劑(rPSGL-Ig)在缺血動物模型中對減輕缺血/再灌注腦損傷的有效性的研究結(jié)果。該動物模型的結(jié)果有可能預(yù)示在人類中的結(jié)果。
材料和方法在250-300克重的Sprague-Dawley大鼠頭蓋嵌入透明窗。在開窗當(dāng)日，用戊巴比妥(40mg/kg，腹膜注射)麻醉大鼠。在誘導(dǎo)缺血前使大鼠恢復(fù)至少4天。所有大鼠在缺血前的晚上都禁食。用氯胺酮(100mg/ml.)和甲苯噻嗪(20mg/ml)的1∶1混合物以0.1ml/100g體重的劑量肌肉注射誘發(fā)麻醉。使用由Koizumi等開發(fā)的技術(shù)(由Belayev，L等(1996)Stroke 27(9)1616-22描述的用于大腦中動脈短暫梗塞的方法改進)產(chǎn)生局部缺血。將縫線經(jīng)頸外動脈引入內(nèi)頸動脈中?？p線保持在該處達30或120分鐘，然后拆除。為確保每個大鼠的大腦中動脈都完全梗塞，在放置縫線前后監(jiān)測體感誘發(fā)電位(SSEP)。僅選取縫線處于原位時表現(xiàn)出誘發(fā)反應(yīng)喪失的大鼠。大腦溫度保持在37℃。
每個研究中大鼠都分為治療和未治療兩組。在第一個研究中，治療動物在拆除大腦中動脈的縫線前1分鐘靜脈給予rPSGL-Ig(1mg/kg)。在第二個研究中，它們在缺血前接受4mg/kg的所述藥物。未治療動物靜脈接受等體積的載體代替所述藥物。使用上照顯微鏡活體內(nèi)顯微檢測頭蓋表面。使用中密度濾光片降低光強度和避免光毒性。使用連接Genisyl影像增強器的CCD照相機將微血管床視頻影像傳送至磁帶錄像機。使用影像增強器使我們記錄視頻影像，同時組織接觸的光強度低。光照強度直接影響白細胞滾動和粘附。使用20X水浸沒式透鏡放大微血管床。選擇20-45μm的毛細血管后微靜脈進行觀察。在血管分支點下游200μm獲得檢測結(jié)果。分析錄下的小靜脈的白細胞滾動和粘附情況。
在研究結(jié)束時，用戊巴比妥麻醉大鼠并去頭?？焖偃∠麓竽X并放置于冷(4℃)鹽水中，以便于切片。制作5個冠狀切片。然后將每個冠狀切片浸入2％的2，3，5-三苯基鹽酸四唑鎓鹽酸鹽溶液中。于黑暗中用該溶液溫育切片(37℃30分鐘)，然后在10％磷酸緩沖的甲醛中固定。固定后的切片放置在解剖顯微鏡下并拍照。5個切片的每一個都對喙部和尾側(cè)拍照。圖象由Seattle Filmworks(Seattle，WA，USA)進行數(shù)字化處理，用計算機分析梗塞面積。
結(jié)果結(jié)果顯示，rPSGL-Ig趨向于減弱短暫缺血后大腦表面上小靜脈中白細胞的滾動。小靜脈中白細胞的滾動在大腦中動脈梗塞30分鐘后的再灌注過程中選定用于檢測的全部時間段都趨向于下降(參見圖1)。梗塞120分鐘后，再灌注60分鐘后滾動趨向于下降(參見圖2)。這至少部分是由于剪切率的差別。
梗塞的30分鐘持續(xù)時間不足以對大腦產(chǎn)生確實的梗死。大腦中動脈梗塞120分鐘在未治療大鼠中引起大約32％的同側(cè)大腦半球梗塞。通過在再灌注前1分鐘給予rPSGL-Ig明顯降低了這種梗塞的面積(達到大約26％的同側(cè)大腦半球)。在一個單獨的大鼠組別中，在梗塞前以4次劑量給予rPSGL-Ig。盡管這些大鼠的梗塞面積比再灌注過程中接受較低劑量的大鼠稍微低一些(22％)，但結(jié)果沒有顯著不同。
這些結(jié)果表明，P-選擇蛋白的表達對缺血和/或再灌注損傷是一個重要影響因素。這些結(jié)果還表明，rPSGL-Ig干擾白細胞在短暫缺血后順著大腦皮層小靜脈滾動。用P-選擇蛋白拮抗劑(例如rPSGL-Ig)在缺血前或再灌注過程中封閉P-選擇蛋白有效降低由短暫缺血引起的腦損傷程度。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能識別或僅僅使用常規(guī)實驗?zāi)軌虼_定許多與本文描述的本發(fā)明具體實施方案等同的方案。這些等同方案包含在以下的權(quán)利要求書中。
序列表<110>Genetics Institute，LLCTemple University<120>缺血后白細胞-內(nèi)皮細胞相互作用的調(diào)節(jié)<130>8702.0099-00304<140>未指定<141>
<150>60/309,816<151>2001-08-03<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1649<212>DNA<213>人<400>1gccacttctt ctgggcccac gaggcagctg tcccatgctc tgctgagcac ggtggtgcca 60tgcctctgca actcctcctg ttgctgatcc tactgggccc tggcaacagc ttgcagctgt 120gggacacctg ggcagatgaa gccgagaaag ccttgggtcc cctgcttgcc cgggaccgga 180gacaggccac cgaatatgag tacctagatt atgatttcct gccagaaacg gagcctccag 240aaatgctgag gaacagcact gacaccactc ctctgactgg gcctggaacc cctgagtcta 300ccactgtgga gcctgctgca aggcgttcta ctggcctgga tgcaggaggg gcagtcacag 360agctgaccac ggagctggcc aacatgggga acctgtccac ggattcagca gctatggaga 420tacagaccac tcaaccagca gccacggagg cacagaccac tccactggca gccacagagg 480cacagacaac tcgactgacg gccacggagg cacagaccac tccactggca gccacagagg 540cacagaccac tccaccagca gccacggaag cacagaccac tcaacccaca ggcctggagg 600cacagaccac tgcaccagca gccatggagg cacagaccac tgcaccagca gccatggaag 660cacagaccac tccaccagca gccatggagg cacagaccac tcaaaccaca gccatggagg 720cacagaccac tgcaccagaa gccacggagg cacagaccac tcaacccaca gccacggagg 780cacagaccac tccactggca gccatggagg ccctgtccac agaacccagt gccacagagg 840ccctgtccat ggaacctact accaaaagag gtctgttcat acccttttct gtgtcctctg 900ttactcacaa gggcattccc atggcagcca gcaatttgtc cgtcaactac ccagtggggg 960ccccagacca catctctgtg aagcagtgcc tgctggccat cctaatcttg gcgctggtgg 1020
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權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或減輕患者腦缺血后再灌注損傷的方法，該方法包括給予有效量的一種組合物，該組合物含有P-選擇蛋白拮抗劑或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者患中風(fēng)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述再灌注損傷為皮質(zhì)梗塞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述P-選擇蛋白拮抗劑為抗P-選擇蛋白配體抗體或其片段。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述P-選擇蛋白拮抗劑為可溶性PSGL-1蛋白或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述可溶性PSGL-1蛋白為人PSGL-1。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述可溶性PSGL-1蛋白為重組蛋白。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述可溶性PSGL-1蛋白包含免疫球蛋白的Fc部分。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述免疫球蛋白為人IgG1。
10.權(quán)利要求5的方法，其中所述可溶性PSGL-1蛋白為重組人PSGL-Ig融合蛋白。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述片段包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸42至氨基酸60。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述片段包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸42至氨基酸88。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述片段包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸42至氨基酸118。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述片段包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸42至氨基酸189。
15.權(quán)利要求10的方法，其中所述片段包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸42至氨基酸310。
16.權(quán)利要求4的方法，其中所述可溶性PSGL-1蛋白包含SEQID NO2的氨基酸42至氨基酸88的氨基酸序列，該序列以其C末端和免疫球蛋白的Fc部分融合。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述可溶性PSGL-1蛋白還包含免疫球蛋白的Fc部分。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者為人。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述P-選擇蛋白拮抗劑在再灌注前給予患者。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述P-選擇蛋白拮抗劑與有效量的一種或多種粘附分子抑制劑聯(lián)合給予患者。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述P-選擇蛋白拮抗劑在再灌注過程中給予患者。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述P-選擇蛋白拮抗劑與有效量的一種或多種粘附分子抑制劑聯(lián)合給予患者。
23.一種預(yù)防或減輕患者腦缺血后梗塞的方法，該方法包括給予有效量的一種組合物，該組合物含有P-選擇蛋白拮抗劑或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段。
24.一種預(yù)防或減輕患者中風(fēng)后腦損傷的方法，該方法包括給予有效量的一種組合物，該組合物含有P-選擇蛋白拮抗劑或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段。
25.一種抑制患者大腦再灌注后細胞與血管粘附的方法，該方法包括給予有效量的一種組合物，該組合物含有P-選擇蛋白拮抗劑或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述細胞為白細胞。
27.一種抑制患者大腦再灌注后細胞與細胞粘附的方法，該方法包括給予有效量的一種組合物，該組合物含有P-選擇蛋白拮抗劑或其具有P-選擇蛋白配體活性的片段。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述細胞為白細胞和血小板。
全文摘要
本發(fā)明涉及減輕或預(yù)防由缺血(例如中風(fēng))后再灌注引起的組織或器官(例如大腦)損傷的方法和組合物。本發(fā)明還提供通過給予P－選擇蛋白拮抗劑在患者中降低由缺血和/或再灌注引起的梗塞面積的方法和組合物。本發(fā)明還提供通過給予可溶性P－選擇蛋白配體或其片段、抗P－選擇蛋白配體抗體或抗P－選擇蛋白抗體調(diào)節(jié)(例如減弱)患者中的白細胞滾動、胞間粘附和細胞與血管粘附的方法。本發(fā)明還提供鑒定能夠減輕或預(yù)防由缺血性疾病和再灌注損傷引起的組織或器官損傷的化合物的方法。
文檔編號A61P9/00GK1561225SQ02819345
公開日2005年1月5日 申請日期2002年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月3日
發(fā)明者M·J·埃皮希默, R·G·肖布, R·圖馬 申請人:遺傳研究所公司, 聯(lián)邦高等教育系統(tǒng)坦普爾大學(xué)