專利名稱：C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽-1類似物及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新型的C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽-I類似物；本發(fā)明同時(shí)涉及一種該內(nèi)嗎啡肽-I類似物的制備方法及其在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在1997年，美國(guó)都蘭大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)家Zadina和他的同事們通過免疫組化篩選肽庫的辦法，從牛腦中分離并且提純得到了對(duì)于μ阿片受體有著很高選擇性與親和 性的配體(見 Zadina, J. Ε. ; Hackler , L. ; Ge, L. J. ; Kastin , A. J. A potent andselective endogenous agonist for the μ -opiate receptor. Nature . 1997, 386:499-502)。該配體被稱作是內(nèi)源性阿片肽，其結(jié)構(gòu)目前發(fā)現(xiàn)的有兩種，它們分別為內(nèi)嗎啡肽-I (Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2)和內(nèi)嗎啡肽-2(Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2)。然而有研究表明，內(nèi)嗎啡肽-2有著天然的弱的治療學(xué)特性，其鎮(zhèn)痛效能要比內(nèi)嗎啡肽-I的低，并且副作用也比內(nèi)嗎啡肽-I的大。Peter等人也發(fā)現(xiàn)，在離體酶解穩(wěn)定性方面，內(nèi)嗎啡肽_2的穩(wěn)定性沒有內(nèi)嗎啡妝_1 的好(見Peter A, Toth G, Tomboly C，Laus G, Tourwe D. Liquid chromatographicstudy of the enzymatic degradation of endomorphins, with identification byelecteospray ionization mass spectrometry,;1999，846:39-48)。在治療疼痛中，與嗎啡鎮(zhèn)痛能力相當(dāng)?shù)陌⑵愭?zhèn)痛藥物起著至關(guān)重要的作用，特別是對(duì)于重度疼痛中的治療始終處于不能替代的地位。最重要的是，內(nèi)嗎啡肽還對(duì)神經(jīng)疼痛有顯著的治療效果；同時(shí)內(nèi)嗎啡肽在有效的鎮(zhèn)痛藥物濃度下其副作用會(huì)更小。但是，這些阿片類的藥物不能進(jìn)入到臨床上使用，因?yàn)榘⑵愃幬飳?duì)有疼痛的病人會(huì)產(chǎn)生非常多的副作用，這些副作用包括以下幾個(gè)方面便秘，成癮，耐受，嘔吐，和呼吸抑制等。還有幾個(gè)內(nèi)嗎啡肽不能成為臨床藥物的原因是，內(nèi)嗎啡肽鎮(zhèn)痛時(shí)間比較短，酶解穩(wěn)定性比較差，通過BBB的能力很弱以及口服無藥效等等。因此，通過對(duì)內(nèi)嗎啡肽-I進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，在盡量不降低或提高其親和活力的前提下，提高酶解穩(wěn)定性和血腦屏障通透能力，從而得到外周給藥產(chǎn)生高效鎮(zhèn)痛活性的內(nèi)嗎啡肽-I類似物成為近年研究的方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽-I類似物——四肽化合物Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-Phe (4-N02)-NH。本發(fā)明的另一目的是提供一種C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽-I類似物的制備方法；
本還有一個(gè)目的，就是提供一種C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽-I類似物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。(一)內(nèi)嗎啡肽-I類似物本發(fā)明C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽-I類似物(命名為[GAGPNH2]-EM-I)，是在內(nèi)嗎啡肽-I的N端用胍基化修飾，在內(nèi)嗎啡肽-I的2、3位Pro-Typ被D-Ala-Gly替換，4位Phe苯環(huán)對(duì)位用氨基化修飾。其具體結(jié)構(gòu)式如下
權(quán)利要求
1.一種C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽-I類似物，其結(jié)構(gòu)式如下
2.如權(quán)利要求I所述C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽類似物的制備方法，包括以下工藝步驟(1)Boc-Phe (4-N02) -NH2 的合成 將叔丁氧羰基保護(hù)的對(duì)硝基苯丙氨酸充分溶解于四氫呋喃中，加入叔丁氧羰基保護(hù)的對(duì)硝基苯丙氨酸摩爾量I. (Tl. 5倍的I-羥基苯并三唑，攪拌使其完全溶解，待溶液的顏色變成紅褐色后，再加入叔丁氧羰基保護(hù)的對(duì)硝基苯丙氨酸摩爾量Γ4倍量的N，N-二異丙基乙胺，攪拌反應(yīng)12 36小時(shí)，旋蒸除去四氫呋喃后溶解于水中，乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次用檸檬酸、飽和的碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，得到的白色固體，即為 Boc-Phe (4-N02) -NH2 ； (2)單芐氧羰基化的脒基吡唑鹽酸鹽的合成 將脒基吡唑鹽酸鹽完全溶解于二氯甲烷中，加入脒基吡唑鹽酸鹽摩爾量2飛倍量的芐氧羰基氯，攪拌反應(yīng)1(Γ30分鐘，再加入脒基吡唑鹽酸鹽摩爾量:Γ8倍量的三乙胺，于(T5°C下攪拌反應(yīng)廣3小時(shí)，升溫至室溫，攪拌1(Γ20小時(shí)，旋蒸除去二氯甲烷，用乙酸乙酯萃取，用飽和的氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，濃縮，重結(jié)晶，得到的白色固體即為單芐氧羰基化的脒基吡唑鹽酸鹽； (3)雙芐氧羰基化的脒基吡唑鹽酸鹽的合成 在惰性氣體保護(hù)下，于(T5°C下，將氫化鈉充分溶解于四氫呋喃中，依次加入單芐氧羰基化的脒基吡唑鹽酸鹽、芐氧羰酰琥珀酰亞胺，攪拌反應(yīng)3(Γ48小時(shí)，用冰水猝滅，旋蒸除去四氫呋喃后，用乙酸乙酯萃取，依次用檸檬酸、飽和的碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，濃縮，得到油狀混合物，油狀混合物經(jīng)純化，得到雙芐氧羰基化的脒基吡唑鹽酸鹽晶體； (4)芐氧羰基化的酪氨酸羧基端的活化 于(Γ5 V下，將芐氧羰基保護(hù)的酪氨酸溶解于四氫呋喃中，加入芐氧羰基保護(hù)的酪氨酸摩爾量廣3倍的N-羥基琥珀酰亞胺和芐氧羰基保護(hù)的酪氨酸摩爾量f 3倍的N，N’ -二環(huán)己基碳二亞胺，攪拌使其充分溶解，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1(Γ20分鐘，升溫至室溫，反應(yīng)12 18小時(shí)，抽濾，除去生成的二環(huán)己基脲，得到活化濾液； (5)接肽反應(yīng) 將Cbz保護(hù)的酪氨酸摩爾量廣4倍的丙氨酸溶于飽和碳酸氫鈉溶液中，再將上述得到的活化濾液加入其中，于(T5°C下攪拌反應(yīng)2(Γ60分鐘，升溫至室溫，反應(yīng)12 18小時(shí)；旋蒸除去四氫呋喃，用乙酸乙酯萃取，除去有機(jī)相，保留水相；于獷51下調(diào)ρΗ=2飛，然后用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次用質(zhì)量濃度5 10%的檸檬酸水溶液、飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，得到淡黃色的油狀液體；柱層析分離，得到無色的油狀物，即為氮端的二肽化合物； (6)H-Tyr-D-Ala-OH 的而成 將氮端的二肽化合物溶于無水甲醇中，加入活性鈀碳，室溫?cái)嚢柘?，通氫氣反?yīng)O. 5 2h;真空抽濾除去活性鈀碳，減壓濃縮，得無色油狀物即為二肽化合物H-Tyr-D-Ala-OH ； (7)Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-OH 的合成 將步驟(3)合成的雙芐氧羰基化的脒基吡唑鹽酸鹽，步驟(6)合成的H-Tyr-D-Ala-OH以1:廣1:3的摩爾比加入到N-N-二甲基甲酰胺中，再加入雙芐氧羰基化的脒基吡唑鹽酸鹽摩爾量4 8倍的三乙胺，于(T5°C下攪拌反應(yīng)25 35分鐘，升溫至室溫，反應(yīng)48^96小時(shí)；用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次用5 10%的檸檬酸水溶液、飽和的食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，得到淡黃色油狀液體；柱層析分離，得到無色油狀物，即為Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-OH ；(8)Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-OH 的合成 于 0 5°C下，將 Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-OH溶解于四氫呋喃中，加入 Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-OH摩爾量廣3倍的N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺，攪拌使其充分溶解，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1(Γ20分鐘，升溫至室溫，反應(yīng)12 18小時(shí)，抽濾，除去生成的二環(huán)己基脲，得到活化濾液； 將Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-OH摩爾量廣4倍的甘氨酸溶于飽和碳酸氫鈉溶液中，再將上述活化濾液加入其中，于(T5°C下攪拌反應(yīng)2(Γ60分鐘，升溫至室溫，反應(yīng)12 18小時(shí)；旋蒸除去四氫呋喃，用乙酸乙酯萃取，除去有機(jī)相，保留水相；于0 51下調(diào)ρΗ=2飛，然后用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次用質(zhì)量濃度5 10%的檸檬酸水溶液、飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，得到淡黃色的油狀液體；柱層析分離，得到無色的油狀物，即為氮端的三肽化合物Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-OH ； (9 )脫Boc-Phe (4-N02) -NH2氨基酸的叔丁氧羰基 于(T5°C下，將步驟(I)合成的氨基酸Boc-Phe (4_N02)-NH2溶于二氯甲烷，之后加入氨基酸Boc-Phe (4-N02) -NH2摩爾量2飛倍量的三氟乙酸，攪拌反應(yīng)O. 5^2小時(shí)，濃縮，得到白色的固體，用乙醚結(jié)晶，得到白色固體，即為氨基酸H-Phe (4-N02) -NH2 ；(10)Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-Phe (4-N02)-NH2 的合成 于0 5 V下，將Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-OH溶解于四氫呋喃中，加入Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-OH摩爾量f 3倍的N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺，攪拌使其充分溶解，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1(Γ20分鐘，升溫至室溫，反應(yīng)12 18小時(shí)，抽濾，除去生成的二環(huán)己基脲，得到活化濾液；將 Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-OH 摩爾量 f 4 倍的氨基酸 H-Phe (4_N02) -NH2 溶于飽和碳酸氫鈉溶液中，再將上述活化濾液加入其中，于(T5°C下攪拌反應(yīng)2(Γ60分鐘，升溫至室溫，反應(yīng)12 18小時(shí)；旋蒸除去四氫呋喃，用乙酸乙酯萃取，然后用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次用質(zhì)量濃度5 10%的檸檬酸水溶液、飽和碳酸氫鈉溶液,飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥，濃縮，得到淡黃色的油狀液體；柱層析分離，得到白色固體，即為四肽化合物Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-Phe (4-N02) -NH2 ；(11)⑶-Tyr-D- Ala-Gly-Phe (4_NH2) -NH2 的合成 將四肽化合物Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-Phe (4_N02) -NH2溶于無水甲醇中，加入活性鈀碳，室溫?cái)嚢柘?，通氫氣反?yīng)O. 5^2h ;真空抽濾除去活性鈀碳，減壓濃縮，得白色護(hù)體即為四肽化合物 Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-Phe (4_N02) -NH。
3.如權(quán)利要求2所述C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽類似物的制備方法，其特征在于步驟(2)所述重結(jié)晶工藝為先用乙酸乙酯溶解白色固體，再用石油醚或環(huán)己烷進(jìn)行結(jié)晶，靜置，過濾。
4.如權(quán)利要求2所述C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽類似物的制備方法，其特征在于步驟(3)所述油狀混合物的純化工藝為將油狀混合物用二氯甲烷溶解，以石油醚與乙酸乙酯以6:廣3:1的體積比混合也為展開劑，柱層析分離，得到無色塊狀晶體。
5.如權(quán)利要求2所述C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽類似物的制備方法，其特征在于步驟(5)所述柱層析分離的展開劑體系為石油醚、乙酸乙酯，冰醋酸以(30 60) : (60 110) : I體積比的混合液。
6.如權(quán)利要求2所述C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽類似物的制備方法，其特征在于步驟(6)所述活性鈀碳的加入量為氮端的二肽化合物或四肽化合物質(zhì)量的25% 30% ;所述活性鈀碳中鈀的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10 20%。
7.如權(quán)利要求2所述C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽類似物的制備方法，其特征在于步驟(7)所述淡黃色油狀液體的柱層析分離工藝為先用乙酸乙酯與石油醚以1:廣1:4體積比混合的展開劑過硅膠柱，再用石油醚、乙酸乙酯、冰醋酸以(3 8) : (Γ3):1的體積比混合的展開劑沖柱。
8.如權(quán)利要求2所述C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽類似物的制備方法，其特征在于步驟(10)所述淡黃色的油狀液體的柱層析分離方法先用乙酸石油醚與乙酯以1Γ4:1體積比混合的展開劑過硅膠柱，再用乙酸乙酯的展開劑沖柱。
9.如權(quán)利要求I所述C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽-I類似物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種C端苯丙氨酸對(duì)位氨基化修飾的內(nèi)嗎啡肽-1類似物，是在內(nèi)嗎啡肽-1的N端用胍基化修飾，在內(nèi)嗎啡肽-1的2、3位的Pro-Typ被D-Ala-Gly替換，4位Phe苯環(huán)對(duì)位用氨基化修飾通過液相合成法合成了內(nèi)嗎啡肽-1的新型類似物[GAGPNH2]-EM-1。通過放射配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，離體酶解穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，溫浴甩尾鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)對(duì)該類似物進(jìn)行了一系列的生理學(xué)和藥理學(xué)活性鑒定，結(jié)果表明本發(fā)明的類似物較其母體具有跟高的親和能力和更好的酶解穩(wěn)定性，以及更強(qiáng)的血腦屏障通透能力強(qiáng)，并且副作用低。因此，以其為活性物質(zhì)，用于制備臨床鎮(zhèn)痛藥物，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P29/00GK102659920SQ20121014774
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者梁媛, 王一青, 王銳 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)