專(zhuān)利名稱(chēng)：使用甲酰-甘氨酸生成酶(fge)對(duì)多種硫酸酯酶缺乏癥和其它病癥進(jìn)行診斷和治療的制作方法
使用甲酰-甘氨酸生成酶(FGE)對(duì)多種硫酸酯酶缺乏癥和其它病癥進(jìn)行診斷和治療
本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)?00480006490. 0，申請(qǐng)日2004年02月10日的同名申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。發(fā)明領(lǐng)域
此發(fā)明涉及診斷和治療多種硫酸酯酶缺乏癥(MSD)以及其它硫酸酯酶缺乏癥的方法和組合物。更特異地，本發(fā)明涉及被分離的調(diào)節(jié)硫酸酯酶翻譯后修飾的分子。這類(lèi)修飾為硫酸酯酶的正確功能所必需。
發(fā)明背景
硫酸酯酶是高度保守的基因家族的成員，共享廣泛的序列同源性(Franco，B. 等，Cell，1995，81:15-25;Parenti, G.等，Curr. Opin. Gen. Dev.，1997，7:386-391)，高度的結(jié)構(gòu)類(lèi)似性(Bond, C. S.等，Structure, 1997，5:277-289; Lukatela, G.等，Biochemistry, 1998, 37:3654-64)，和獨(dú)特的為硫酸酯斷裂所必需的翻譯后修飾(Schmi dt, B.等，Ce 11， 1995，82:271-278; Selmer, T.等，Eur. J. Biochem.，1996，238:341-345)。翻譯后修飾包括對(duì)保守的半胱氨酸(在真核細(xì)胞中)或絲氨酸(在某些原核細(xì)胞中)殘基在Ce處的氧化，得到L-Ca-甲酰甘氨酸(也叫做FGly，2-氨基-3-氧代丙酸)，其中醛基代替了側(cè)鏈的硫代甲基基團(tuán)。醛基是硫酸酯酶催化位點(diǎn)的必需部分，很可能作為醛水合物起作用。成對(duì)的羥基之一在硫酸酯斷裂時(shí)接受硫酸基團(tuán)，導(dǎo)致共價(jià)硫酸化的酶中間物的形成。其它羥基是隨后的硫酸基團(tuán)消去和醛基再生所需要的。此修飾在初生硫酸酯酶多肽輸入期間或間隔很短時(shí)間之后發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并被圍繞著將被修飾的半胱氨酸(或絲氨酸)殘基的短線性序列所調(diào)控。此高度保守序列是六肽L/V-C(S)-X-P-S-R(SEQ ID NO:32)，出現(xiàn)在所有真核細(xì)胞硫酸酯酶的N末端區(qū)域,并最頻繁地在殘基X上攜帶輕基或硫輕基(Dierks, T.等，Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A.，1997，94:11963-11968)。
迄今為止，已在人體中鑒別出13個(gè)硫酸酯酶基因。它們編碼具有不同底物專(zhuān)一性和亞細(xì)胞定位如溶酶體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的酶。這些基因中的四種ARSC，ARSD, ARSEjPARSF (分別編碼芳基硫酸酯酶C，D，E和F)，位于相同的染色體區(qū)域(Xp22. 3)內(nèi)。 它們共享顯著的序列類(lèi)似性和幾乎相同的基因組組織方式，說(shuō)明它們來(lái)源于在進(jìn)化中近來(lái)才發(fā)生的復(fù)制事件(Franco B 等，Cell, 1995，81:15-25;Meroni G 等，Hum Mol Genet, 1996,5:423-31)。
由單獨(dú)硫酸酯酶活性的缺乏所引起的至少八種人單基因疾病的鑒定，強(qiáng)調(diào)了硫酸酯酶在人體代謝中的重要性。這些病癥中的大部分是溶酶體存貯病，其中，表型結(jié)果源于被儲(chǔ)存物質(zhì)的類(lèi)型和組織分布。在它們中，有五種不同類(lèi)型的因硫酸酯酶對(duì)粘多糖分解代謝作用的缺乏而引起的粘多糖病(MPS類(lèi)型II, IIIA, HID, IVA和VI) (Neufeld和 Muenzer，2001，The mucopolysaccharidoses,In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease，C. R. Scriverj A. L. Beaudetj W. S. Sly, D. Valle, B. Childs, K. W. Kinzler 和 B. Vogelstein 編，New Yor k:Mc Graw-Hi ll，pp. 3421-3452)，和以腦硫脂在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中儲(chǔ)存并引起嚴(yán)重和漸進(jìn)性神經(jīng)退化為特征的異常染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(MLD)。兩種另外的人類(lèi)疾病由非溶酶體硫酸酯酶缺乏引起。這些包括X-連鎖的魚(yú)鱗病，因類(lèi)固醇硫酸酯酶(STS/ARSC)缺乏而引起的皮膚病；和點(diǎn)狀軟骨發(fā)育不全，由芳基硫酸酯酶E(ARSE)缺乏引起的影響骨和軟骨的疾病。硫酸酯酶也牽涉到藥物誘導(dǎo)的人畸形綜合癥，例如Warfarin胚胎病，由懷孕期間在宮內(nèi)暴露于殺鼠靈而抑制ARSE活性所引起。
在引起人興趣的人類(lèi)單基因疾病中，多種硫酸酯酶缺乏癥(MSD)是所有硫酸酯酶活性同時(shí)有缺陷。因此，此嚴(yán)重的多系統(tǒng)性疾病的表型結(jié)合了在單獨(dú)硫酸酯酶缺乏中所觀察到的特征。來(lái)自多種硫酸酯酶缺乏癥患者的細(xì)胞即使以編碼人硫酸酯酶的cDNAs轉(zhuǎn)染之后也缺乏硫酸酯酶活性，暗示所有硫酸酯酶活性所需要的普遍機(jī)制的存在(Rommerskirch 和 von Figura, Proc. Natl. Acad. Sc1.，USA, 1992，89:2561-2565)。硫酸酯酶的翻譯后修飾被發(fā)現(xiàn)在多種硫酸酯酶缺乏癥患者中有缺陷，暗示此疾病由基因的突變所引起，該基因牽涉到半胱氨酸至甲酰甘氨酸的轉(zhuǎn)化機(jī)制(Schmidt，B.等，Cell，1995，82:271-278)。盡管存在強(qiáng)烈的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)興趣，以鑒別此基因?yàn)槟繕?biāo)的努力卻被多種硫酸酯酶缺乏癥患者的稀有性和隨之帶來(lái)的缺乏合適的家族病例而無(wú)法完成遺傳圖譜繪制所妨礙。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供診斷和治療多種硫酸酯酶缺乏癥(MIM 272200)及治療其它硫酸酯酶缺乏癥的方法和組合物。更特異地，已鑒別出編碼甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的基因，此酶負(fù)責(zé)發(fā)生于硫酸酯酶的獨(dú)特的翻譯后修飾(形成L-Ca-甲酰甘氨酸；也叫做FGly和/或2-氨基-3-氧代丙酸)，該翻譯后修飾為硫酸酯酶功能所必需。已發(fā)現(xiàn)，出乎意料的是FGE基因中的突變導(dǎo)致受試者中的多種硫酸酯酶缺乏癥(MSD)的發(fā)展。也發(fā)現(xiàn)，出乎意料的是FGE 增強(qiáng)了硫酸酯酶的活性，包括但不限于，艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1 ，HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和HSulf-6。考慮到這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的分子可用于診斷和治療多種硫酸酯酶缺乏癥以及其它硫酸酯酶缺乏癥。
在多種硫酸酯酶缺乏癥的診斷中應(yīng)用本發(fā)明的分子的方法被提供。
另外，為調(diào)節(jié)硫酸酯酶上FGly形成的目的而在體內(nèi)或體外應(yīng)用這些分子的方法， 治療與這種修飾相關(guān)的病癥的方法，和對(duì)制備治療多種硫酸酯酶缺乏癥及其它硫酸酯酶缺乏癥的藥學(xué)制劑有用的組合物，也被提供。
本發(fā)明因此在幾個(gè)方面包括調(diào)節(jié)硫酸酯酶上FGly形成的多肽，分離的編碼那些多肽的核酸，它們的功能修飾物和變體，它們的有用的片段，以及與其相關(guān)的治療、診斷和研究的方法、組合物與工具。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，選自下列的分離的核酸分子被提供(a)與SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列所組成的分子在嚴(yán)格條件下雜交的核酸分子，該核酸分子編碼具有 Ca-甲酰甘氨酸生成活性的甲酰甘氨酸生成酶(FGE) ；(b)與(a)的核酸分子在密碼子序列上因遺傳密碼簡(jiǎn)并性而有所區(qū)別的核酸分子；和(c) (a)或(b)的互補(bǔ)鏈。在一定的實(shí)施方案中，分尚的核酸分子包括SEQ ID NO:1所不的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，分尚的核酸分子由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或其片段組成。
本發(fā)明的另一方面提供分離的選自下列的核酸分子(a)SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的獨(dú)特(unique)片段，和(b) (a)的互補(bǔ)鏈，條件是(a)中的獨(dú)特片段包括了不與某些序列相同的連續(xù)核苷酸序列，所述某些序列選自(I)與SEQ ID NO. 4和/或SEQ ID NO. 4的核苷酸20-1141相同的序列，和(2) (I)中核酸分子的互補(bǔ)鏈。在任何前述的實(shí)施方案中，互補(bǔ)鏈指全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。
在一個(gè)實(shí)施方案中，連續(xù)核苷酸序列選自(I)至少兩個(gè)不與序列組完全相同的連續(xù)核苷酸，(2)至少三個(gè)不與序列組完全相同的連續(xù)核苷酸，(3)至少四個(gè)不與序列組完全相同的連續(xù)核苷酸，(4)至少五個(gè)不與序列組完全相同的連續(xù)核苷酸，(5)至少六個(gè)不與序列組完全相同的連續(xù)核苷酸，和(6)至少七個(gè)不與序列組完全相同的連續(xù)核苷酸。
在另一實(shí)施方案中，片段大小選自至少8個(gè)核苷酸，10個(gè)核苷酸，12個(gè)核苷酸，14個(gè)核苷酸，16個(gè)核苷酸，18個(gè)核苷酸，20個(gè)核苷酸，22個(gè)核苷酸，24個(gè)核苷酸，26 個(gè)核苷酸，28個(gè)核苷酸，30個(gè)核苷酸，40個(gè)核苷酸，50個(gè)核苷酸，75個(gè)核苷酸，100個(gè)核苷酸，200個(gè)核苷酸，1000個(gè)核苷酸和其間的每一整數(shù)長(zhǎng)度。
根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供包含上述核酸分子的表達(dá)載體和以該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供表達(dá)內(nèi)源FGE基因的活化形式的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)源FGE基因的活化通過(guò)同源重組發(fā)生。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，分離的多肽被提供。分離的多肽被前述的本發(fā)明核酸分子所編碼。在某些實(shí)施方案中，分離的多肽被SEQ ID NO:1的核酸編碼，產(chǎn)生出具有SEQ ID N0:2序列和Ca-甲酰甘氨酸生成活性的多肽。在其它的實(shí)施方案中，分離的多肽也許是前述的片段或變體，其長(zhǎng)度足以代表人基因組中獨(dú)特序列并且是具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的多肽，條件是該片段包括不與任何被具有SEQ ID NO. 4的核酸序列所編碼的序列相同的連續(xù)氨基酸的序列。在另一實(shí)施方案中，上述多肽分子的免疫源性片段被提供。免疫源性片段也許具有也許不具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，分離的結(jié)合多肽被提供，其選擇性地與前述的本發(fā)明核酸分子所編碼的多肽結(jié)合。優(yōu)選分離的結(jié)合多肽選擇性地結(jié)合包含SEQ ID N0:2序列的多肽、其片段或?qū)儆诜蛛x的具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的多肽家族而在本文其它部分所述的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的結(jié)合多肽包括抗體和抗體片段(如Fab，F(xiàn) (ab) 2，F(xiàn)d和包括了與FGE多肽選擇性結(jié)合的CDR3區(qū)域的抗體片段)。在一定的實(shí)施方案中，抗體是人抗體。在某些實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。在某一實(shí)施方案中，抗體是多克隆抗血清。 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗體是人源化的。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗體是嵌合的。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的分離的多肽的家族被提供。每一所述多肽從氨基端到羧基端包含(a)氨基端亞結(jié)構(gòu)域I ;亞結(jié)構(gòu)域2 ;包含35到 45個(gè)氨基酸的羧基端亞結(jié)構(gòu)域3，而其中亞結(jié)構(gòu)域3與選自SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52， 54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的多肽的亞結(jié)構(gòu)域3具有至少約75%的同源性和大致相同的長(zhǎng)度。在重要的實(shí)施方案中，亞結(jié)構(gòu)域2含有120到140個(gè)氨基酸。在進(jìn)一步的重要實(shí)施方案中，亞結(jié)構(gòu)域2中至少5%的氨基酸是色氨酸。在某些實(shí)施方案中， 亞結(jié)構(gòu)域 2 與選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64 ，66，68，70，72，74，76 ，和78的多肽的結(jié)構(gòu)域2之間具有至少50%的同源性。在一定的實(shí)施方案中，每一多肽的亞結(jié)構(gòu)域 3 與選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的多肽的亞結(jié)構(gòu)域3具有介于約80%和約100%之間的同源性。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，用于測(cè)定某一受試者中的FGE表達(dá)水平的方法被提供。方法包括測(cè)量來(lái)自某一受試者的測(cè)試樣本中的FGE表達(dá)以確定FGE在受試者中的表達(dá)水平。在一定的實(shí)施方案中，測(cè)得的測(cè)試樣本中的FGE表達(dá)與對(duì)照樣本(含有已知FGE表達(dá)水平)中的FGE表達(dá)進(jìn)行比較。表達(dá)被定義成FGE mRNA表達(dá)，F(xiàn)GE多肽表達(dá)，或如本文其它部分所定義的FGE的Ca-甲酰甘氨酸生成活性。多種方法能用于測(cè)量表達(dá)。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案包括用于測(cè)量mRNA表達(dá)的PCR和RNA印跡，作為測(cè)量FGE多肽表達(dá)的試劑的FGE 單克隆抗體或FGE多克隆抗血清，以及測(cè)量FGE Ca-甲酰甘氨酸生成活性的方法。
在一定的實(shí)施方案中，測(cè)試樣本例如活檢樣本和生物液體如血液被用作測(cè)試樣本。FGE在某一受試者的測(cè)試樣本中的表達(dá)與對(duì)照樣本中的FGE表達(dá)比較。
根據(jù)本發(fā)明另一方面，用于鑒別在調(diào)節(jié)分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性中有用的物質(zhì)的方法被提供。方法包括(a)將具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的分子與候選物質(zhì)接觸，(b)測(cè)量該分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性，和(c)將測(cè)得的該分子Ca-甲酰甘氨酸生成活性與對(duì)照進(jìn)行比較以確定候選物質(zhì)是否調(diào)節(jié)分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性，其中該分子是具有選自 SEQ ID NO:1, 3，4，45，47, 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73， 75，77，和80-87的核苷酸序列的核酸分子，或其表達(dá)產(chǎn)物(例如，具有選自SEQ ID NO. 2, 5 ，46，48，50, 52，54，56，58，60, 62，64，66，68，70, 72，74，76，和 78 的序列的肽)。在一定的實(shí)施方案中，對(duì)照是在缺乏候選物質(zhì)的條件下測(cè)得的該分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，在受試者中診斷多種硫酸酯酶缺乏癥的方法被提供。方法包括將生物樣本與試劑接觸，所述生物樣本來(lái)自被懷疑具有多種硫酸酯酶缺乏癥的受試者，所述試劑特異結(jié)合選自下面的分子(i)具有SEQ ID NO: 1，3，或4核苷酸序列的FGE 核酸分子，(ii)核酸分子(i)的表達(dá)產(chǎn)物，或(iii) ( )的表達(dá)產(chǎn)物的片段；以及測(cè)量結(jié)合的試劑數(shù)量并由此確定所述核酸分子或其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)是否異常，異常表達(dá)表明受試者患有多種硫酸酯酶缺乏癥。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，用于對(duì)特征為核酸分子或其表達(dá)產(chǎn)物的異常表達(dá)的病癥進(jìn)行診斷的方法被提供。方法包括將來(lái)自受試者的生 物樣本與試劑接觸，其中所述試劑特異結(jié)合所述核酸分子、其表達(dá)產(chǎn)物或其表達(dá)產(chǎn)物的片段；并測(cè)量結(jié)合的試劑數(shù)量并由此確定所述核酸分子或其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)是否異常，異常表達(dá)表明具有所述病癥，其中所述核酸分子具有SEQ ID NO:1核苷酸序列而所述病癥是多種硫酸酯酶缺乏癥。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，用于在受試者中測(cè)量特征為核酸分子或其表達(dá)產(chǎn)物的異常表達(dá)的多種硫酸酯酶缺乏癥的方法被提供。方法包括對(duì)來(lái)自患者的樣本監(jiān)測(cè)選自下面的參數(shù)(i)具有SEQ ID NO:1, 3，4的核苷酸序列的核酸分子或具有來(lái)源于FEG基因組位點(diǎn)的序列的核酸分子，(ii)所述核酸分子編碼的多肽，(iii)來(lái)源于所述多肽的肽，和(iv)選擇性結(jié)合所述多肽或肽的抗體，將它們作為對(duì)受試者中的多種硫酸酯酶缺乏癥的測(cè)定。在某些實(shí)施方案中，樣本是如前述實(shí)施方案任一項(xiàng)所描述的生物液體或組織。在一定的實(shí)施方案中，監(jiān)測(cè)步驟包括將樣本與選自下面的可檢測(cè)的試劑接觸(a)在嚴(yán)格條件下與(i)中的核酸分子選擇性雜交的分離的核酸分子，(b)選擇性結(jié)合(ii)中的多肽或(iii)中的肽的抗體，和(c)與(iv)中的抗體結(jié)合的多肽或肽。抗體、多肽、肽或核酸能用放射性標(biāo)記或酶進(jìn)行標(biāo)記。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，方法進(jìn)一步包含檢驗(yàn)樣品中的肽。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，試劑盒被提供。試劑盒包含包裝，包裝包含選擇性結(jié)合前述 FGE的分離的核酸或其表達(dá)產(chǎn)物的任一種的試劑，和用于與測(cè)量值比較的對(duì)照，此測(cè)量值為所述試劑與前述FGE的分離的核酸或其表達(dá)產(chǎn)物的任一種結(jié)合的測(cè)量值。在某些實(shí)施方案中，對(duì)照是用于與測(cè)量值比較的預(yù)定值。在一定的實(shí)施方案中，對(duì)照包含前述FGE的分離的核酸的任一種的表達(dá)產(chǎn)物的表位。在一種實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包含選擇性結(jié)合選自下面的多肽的第二試劑艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶，硫酸胺酶(sulfamidase)，N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1 ，HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和HSulf-6，或其肽段，和用于與所述第二試劑結(jié)合到所述多肽或其肽段的測(cè)量值進(jìn)行比較的對(duì)照。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，治療多種硫酸酯酶缺乏癥的方法被提供。方法包括對(duì)需要這種治療的受試者施用調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的試劑，用量為治療受試者的多種硫酸酯酶缺乏癥的有效量。在某些實(shí)施方案中，方法進(jìn)一步包含某一試劑的共施用，所述試劑選自編碼艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C， 芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1, HSulf-2, HS ulf-3, HSulf-4, HSulf-5,或HSulf-6的核酸分子，該核酸分子的表達(dá)產(chǎn)物，和該核酸分子的表達(dá)產(chǎn)物的片段。在一定的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的試劑是本發(fā)明的分離的核酸分子(例如如權(quán)利要求1-8所要求的核酸分子或具有選自SEQ ID NO:1, 3，4 ，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87 的序列的核酸)。在重要的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的試劑是本發(fā)明的肽(例如，如權(quán)利要求 11-15，19，20 所要求的肽，或具有選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64， 66，68，70，72，74，76，和78的序列的肽)。調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的試劑可通過(guò)表達(dá)內(nèi)源和/或外源FGE核酸分子的細(xì)胞產(chǎn)生。在重要的實(shí)施方案中，內(nèi)源FGE核酸分子可被活化。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，用于在受試者中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括施用本發(fā)明的分離的FGE核酸分子(例如，權(quán)利要求1-8的核酸分子，或具有選自 SEQ ID NO:1, 3，4，45，47, 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87的序列的核酸)，和/或其表達(dá)產(chǎn)物到受試者中，用量為在受試者中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，用于治療患多種硫酸酯酶缺乏癥的受試者的方法被提供。方法包括對(duì)需要這種治療的受試者施用調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的試劑，用量為 在受試者中增Wca-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的試劑是本發(fā)明的有義核酸(例如，權(quán)利要求1-8的核酸分子，或具有選自 SEQ ID NO:1, 3，4，45，47, 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87 的序列的核酸)。在一定的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的試劑是本發(fā)明的分離的多肽(例如，權(quán)利要求11-15，19，20的多肽或具有選自SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52， 54，56，58，60, 62，64，66，68，70, 72，74，76，和 78 的序列的肽)。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，用于在細(xì)胞中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括將細(xì)胞與本發(fā)明的分尚的核酸分子接觸(例如，權(quán)利要求1_8的核酸分子,或具有選自 SEQ ID NO:1, 3，4，45，47, 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87的序列的核酸)，或其表達(dá)產(chǎn)物，用量為在細(xì)胞中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。在重要的實(shí)施方案中，方法包括活化內(nèi)源FGE基因以在細(xì)胞中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，藥物組合物被提供。組合物包含治療多種硫酸酯酶缺乏癥的藥學(xué)有效量的某種試劑，該試劑含有本發(fā)明的分離的核酸分子(例如，權(quán)利要求1-8 中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，具有選自SEQ ID NO:1, 3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，6 3，65，67，69，71，73，75，77，和80-87序列的FGE核酸分子)，或其表達(dá)產(chǎn)物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，用于鑒別在治療多種硫酸酯酶缺乏癥中有用的候選物質(zhì)的方法被提供。方法包括測(cè)定一套核酸分子在細(xì)胞或組織中的表達(dá)，條件是缺乏候選物質(zhì)時(shí)，允許該套核酸分子的最初量的表達(dá)，其中該套核酸分子包含至少一種選自下面的核酸分子(a)嚴(yán)格條件下與由SEQ ID N0:1所示核苷酸序列組成的分子雜交并編碼具有匕-甲酰甘氨酸生成活性(FGE)的多肽的核酸分子，(b)遺傳密碼簡(jiǎn)并性引起的在密碼子序列中與(a)或(b)中核酸分子不同的核酸分子，(c)具有選自SEQ ID NO: 1，3，4，45，47，49，51 ，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87 的序列的核酸分子，和(d) (a)或 (b)或(C)的互補(bǔ)鏈，將細(xì)胞或組織與候選物質(zhì)接觸并探測(cè)該套核酸分子表達(dá)的測(cè)試量，其中在候選物質(zhì)存在的條件下表達(dá)的測(cè)試量相對(duì)于表達(dá)最初量的增加表明候選物質(zhì)在治療多種硫酸酯酶缺乏癥中有用。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，制備在治療多種硫酸酯酶缺乏癥和/或其它硫酸酯酶缺乏癥中有用的藥劑的方法被提供。
根據(jù)本發(fā)明又 一方面，固相核酸分子陣列被提供。陣列基本上由固定于固相基質(zhì)的一套核酸分子、其表達(dá)產(chǎn)物或其片段(或是核酸的或是多肽分子的)組成，每一核酸分子編碼選自下面的多肽SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74 ，76，和78，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HS ulf-4, HSulf-5,和HSulf-6。在某些實(shí)施方案中，固相陣列進(jìn)一步包含至少一種對(duì)照核酸分子。在一定的實(shí)施方案中，該套核酸分子包含至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或甚至至少五種核酸分子，每一種選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66 ，68，70，72，74，76，和78，艾杜糖醛酸_2_硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺_6_硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶 C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-l，HSulf-2， HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和 HSulf-6。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，用于在受試者中治療硫酸酯酶缺乏癥的方法被提供。 方法包括對(duì)需要這種治療的受試者施用已根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)出的硫酸酯酶，用量為在受試者中治療硫酸酯酶缺乏癥的有效量，而此硫酸酯酶缺乏癥不是多種硫酸酯酶缺乏癥。在重要的實(shí)施方案中，通過(guò)已與調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的試劑接觸的細(xì)胞產(chǎn)生硫酸酯酶。在一定的實(shí)施方案中，硫酸酯酶缺乏癥包括但不限于粘多糖病II (MPS II;Hunter綜合癥)，粘多糖病IIIA (MPS IIIA; Sanfilippo綜合癥A)，粘多糖病VIII (MPS VIII)，粘多糖病 IVA(MPS IVA;Morquio 綜合癥 A),粘多糖病 VI (MPS VI;Maroteaux-Lamy 綜合癥)，異常染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(MLD)，X-連鎖的隱性點(diǎn)狀軟骨發(fā)育不全1，或X-連鎖的魚(yú)鱗病(類(lèi)固醇硫酸酯酶缺乏癥)。在一定的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的試劑可以是本發(fā)明的核酸分子或肽。在一種實(shí)施方案中，硫酸酯酶和調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的試劑在同一細(xì)胞中共表達(dá)。硫酸酯酶和/或調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的試劑可以是內(nèi)源性或外源性的來(lái)源。如果是內(nèi)源性來(lái)源，它可被活化(例如，通過(guò)在本領(lǐng)域中已知的合適的位置插入強(qiáng)啟動(dòng)子和/或其它元件)。如果是外源性的，其表達(dá)可被表達(dá)載體上的元件所驅(qū)動(dòng)，或它可靶向于細(xì)胞基因組中合適的位置以允許其被增強(qiáng)的表達(dá)(例如，強(qiáng)啟動(dòng)子下游)。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，藥物組合物被提供。組合物包含治療硫酸酯酶缺乏癥的藥學(xué)有效量的某種試劑，該試劑含有本發(fā)明的分離的核酸分子或其表達(dá)產(chǎn)物，及藥學(xué)上可接受的載體。
根據(jù)本發(fā)明更進(jìn)一步的方面，用于在細(xì)胞中增加硫酸酯酶活性的方法被提供。方法包括將表達(dá)硫酸酯酶的細(xì)胞與本發(fā)明的分離的核酸分子(例如，權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，具有選自 SEQID NO:1, 3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65， 67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的FGE核酸分子)或其表達(dá)產(chǎn)物(例如，權(quán)利要求 11-15，19，20 的多肽，或具有選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，6 8，70，72，74，76，和78的序列的肽)接觸，用量為在細(xì)胞中增加硫酸酯酶活性的有效量。細(xì)胞可表達(dá)內(nèi)源性和/或外源性的硫酸酯酶。在重要的實(shí)施方案中，內(nèi)源性的硫酸酯酶被活化。在一定的實(shí)施方案中，硫酸酯酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf -1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和 / 或 HSulf-6。在一定的實(shí)施方案中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，藥物組合物被提供。組合物包含治療硫酸酯酶缺乏癥的藥學(xué)有效量的被細(xì)胞產(chǎn)生的硫酸酯酶，和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述細(xì)胞已與包含本發(fā)明的分離的核酸分子(例如，權(quán)利要求1-8中的，或具有選自SEQ ID NO:1, 3，4，45，47，49， 51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87 的序列的核酸分子)，或其表達(dá)產(chǎn)物(例如，選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76， 和78的肽)的試劑接觸。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，分離的人FGE基因的變體等位基因(其編碼變體FGE多肽) 被提供。分離的變體等位基因包含某一氨基酸序列，該氨基酸序列在SEQ ID NO:2中至少包含一個(gè)變異，其中這至少一個(gè)變異包含MetlArg;MetlVal; Leu20Phe; Serl55Pro; Alal77 Pro;Cys218Tyr;Arg224Trp;Asn259IIe;Pro266Leu;Ala279Val;Arg327Stop;Cys336Arg;Ar g345Cys; Ala348Pro; Arg349Gln; Arg`349Trp; Arg349Trp; Ser359Stop;或其組合。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，分離的人類(lèi)變體FGE多肽被提供。分離的人類(lèi)變體FGE多肽包含某一氨基酸序列，該氨基酸序列在SEQ ID NO: 2中至少含有一個(gè)變異，其中這至少一個(gè)變異包含:Met IArg; Met IVa ; Leu20Phe; Ser 155Pro; Alal77Pro; Cys218Tyr; Arg224Trp; A sn259Ile;Pro266Leu;Ala279Val;Arg327Stop;Cys336Arg;Arg345Cys;Ala348Pro;Arg349G In; Arg349Trp; Arg349Trp; Ser359Stop;或其組合。
以前述任何人類(lèi)變體FGE多肽為免疫原的抗體也被提供。這類(lèi)抗體包括多克隆抗體、單克隆、嵌合的抗體，也可被進(jìn)行可探測(cè)性的標(biāo)記?？商綔y(cè)性的標(biāo)記也許包含放射性元素，熒光化學(xué)物或酶。
根據(jù)本發(fā)明又一方面，產(chǎn)生硫酸酯酶的細(xì)胞被提供，其中被細(xì)胞產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的比率得到增加。細(xì)胞包含(i)表達(dá)增強(qiáng)的硫酸酯酶，和(ii)表達(dá)增強(qiáng)的甲酰甘氨酸生成酶，其中被細(xì)胞產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的比率(即，硫酸酯酶的比活性)相對(duì)于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的細(xì)胞產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的比率至少增加5%。在一定的實(shí)施方案中，被細(xì)胞產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的比率相對(duì)于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的細(xì)胞產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的比率，增加 了至少 10%, 15%, 20%, 50%, 100%, 200%, 500%, 1000%。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，在受試者中治療硫酸酯酶缺乏癥的改進(jìn)方法被提供。 方法包括以在受試者中治療硫酸酯酶缺乏癥的有效量對(duì)需要這種治療的受試者施用硫酸酯酶，其中硫酸酯酶與有效增加硫酸酯酶比活性的量的甲酰甘氨酸生成酶接觸。在重要的實(shí)施方案中，硫酸酯酶選自艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶 C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-l，HSulf-2， HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和HSulf-6。在一定的實(shí)施方案中，甲酰甘氨酸生成酶被權(quán)利要求 1-8 的核酸分子或具有選自 SEQ ID NO:1, 3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65， 67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的核酸所編碼。在某些實(shí)施方案中，甲酰甘氨酸生成酶是權(quán)利要求 11-15，19，20 的肽，或是具有選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，6 O, 62，64，66，68，70，72，74，76，和 78 的序列的肽。
本發(fā)明的這些和其它目標(biāo)將被進(jìn)一步結(jié)合本發(fā)明詳細(xì)描述進(jìn)行詳述。
序列簡(jiǎn)述
SEQ ID NO:1是人FGE cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 2是人FGE cDNA(SEQ ID NO:1)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO: 3是編碼SEQ ID NO: 2的多肽的人FGE cDNA的核苷酸序列(即，SEQ ID NO:1 的核苷酸 20-1141)。
SEQ ID NO:4 是 G enBank Acc. No. AK075459 的核苷酸序列。
SEQ ID N0:5是SEQ ID N0:4翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列，一未命名的具有 GenBank Acc. No. BACl 1634 的蛋白產(chǎn)物。
SEQ ID NO: 6 是人艾杜糖醛酸 _2_ 硫酸酯酶 cDNA (GenBank Acc. No. M58342)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 7是人艾杜糖醛酸_2_硫酸酯酶cDNA (SEQ ID NO: 6)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO:8 是人硫酸胺酶 cDNA(GenBank Acc. No. U30894)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 9是人硫酸胺酶cDNA (SEQ ID NO: 8)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID N0:10是人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶cDNA(GenBank Acc. No. U06088) 的核苷酸序列。SEQ ID吣11是人^乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶00嫩(5￡0 ID N0:10)的翻譯產(chǎn) 物的預(yù)期氨基酸序列。SEQ ID N0:12是人N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶cDNA(GenBank Acc. No. Z12173) 的核苷酸序列。SEQ ID吣13是人^乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶00嫩(5￡0 ID N0:12)的翻譯產(chǎn) 物的預(yù)期氨基酸序列。SEQ ID N0:14是人芳基硫酸酯酶A cDNA (GenBank Acc. No. X52151)的核苷酸序 列。SEQ ID而15是人芳基硫酸酯酶AcDNA(SEQ ID N0:14)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基 酸序列。SEQ ID而16是人芳基硫酸酯酶8 cDNA (GenBank Acc. No. J05225)的核苷酸序 列。SEQ ID而:17是人芳基硫酸酯酶8 cDNA(SEQ ID N0:16)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基 酸序列。SEQ ID N0:18是人芳基硫酸酯酶C cDNA (GenBank Acc. No. J04964)的核苷酸序 列。SEQ ID而:19是人芳基硫酸酯酶CcDNA(SEQ ID N0:18)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基 酸序列。SEQ ID而:20是人芳基硫酸酯酶D cDNA (GenBank Acc. No. X83572)的核苷酸序 列。SEQ ID而:21是人芳基硫酸酯酶D cDNA(SEQ ID N0:20)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基 酸序列。SEQ ID而:22是人芳基硫酸酯酶E cDNA (GenBank Acc. No. X83573)的核苷酸序 列。SEQ ID而:23是人芳基硫酸酯酶E cDNA(SEQ ID N0:22)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基 酸序列。SEQ ID N0:24是人芳基硫酸酯酶F cDNA (GenBank Acc. No. X97868)的核苷酸序 列。SEQ ID而:25是人芳基硫酸酯酶GcDNA(SEQ ID N0:24)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基 酸序列。SEQ ID N0ツ6是人芳基硫酸酯酶G cDNA (GenBank Acc.No.BC012375)的核苷酸序 列。SEQ ID而:27是人芳基硫酸酯酶G(5￡0 ID N0:26)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序 列。SEQ ID N0J8iHSulf-l cDNA(GenBank Acc.No.AY101175)的核苷酸序列。SEQ ID N0:29iHSulf-l cDNA(SEQ ID N0:28)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。SEQ ID N0:30iHSulf-2 cDNA(GenBank Acc.No.AY101176)的核苷酸序列。
SEQIDN0:31是HSulf-2 cDNA(SEQ ID NO:30)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQIDNO: 32是出現(xiàn)于硫酸酯酶的高度保守的六肽L/V-FGly-X-P-S-R。
SEQIDNO: 33是合成的FGly形成底物；其一級(jí)序列是來(lái)源于人芳基硫酸酯酶A。
SEQIDNO: 34是混雜寡肽 PVSLPTRSCAALLTGR。
SEQIDNO: 35是 Ser69 寡肽 PVSLSTPSRAALLTGR。
SEQIDNO: 36是人FGE-特異性引物1199nc。
SEQIDNO: 37是人FGE-特異性正向引物lc。
SEQIDNO: 38是人FGE-特異性反向引物1182c。
SEQIDNO: 39是包含EcoRI位點(diǎn)的人5’ -FGE-特異性引物。
SEQIDNO: 40是HA-特異性引物。
SEQIDNO: 41是c-myc-特異性引物。
SEQIDNO: 42是RGS-His6-特異性引物。
SEQIDNO: 43是來(lái)自人FGE制備物的胰蛋白酶解寡肽SQNTPDSSASNLGFR。
SEQIDNO: 44是來(lái)自人FGE制備物的胰蛋白酶解寡肽MVPIPAGVFTMGTDDPQIK。
SEQIDNO: 45I 是人 FGE2 平行進(jìn)化同源物(paralog) (GenBank G1:24308053)的核苷酸序列。
SEQIDNO:46是人FGE2平行進(jìn)化同源物(SEQ ID NO:45)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQIDNO:47是小鼠FGE平行進(jìn)化同源物(GenBank 61:26344956)的核苷酸序列。
SEQIDNO:48是小鼠FGE平行進(jìn)化同源物(SEQ ID NO:47)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQIDN0:49 是小鼠 FGE 定向進(jìn)化同源物(ortholog)(GenBank G1:22122361)的核苷酸序列。
SEQIDN0:50是小鼠FGE定向進(jìn)化同源物(SEQ ID NO:49)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQIDNO: 51是果蠅FGE定向進(jìn)化同源物(GenBank 61:20130397)的核苷酸序列。
SEQIDNO:52是果蠅FGE定向進(jìn)化同源物(SEQ ID N0:51)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQIDNO:53是蚊子FGE定向進(jìn)化同源物(GenBank 61:21289310)的核苷酸序列。
SEQIDNO:54是蚊子FGE定向進(jìn)化同源物(SEQ ID NO:53)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQIDNO:55是密切相關(guān)的S. coelicolor FGE定向進(jìn)化同源物(GenBank61:21225812)的核苷酸序列。
SEQ ID勵(lì)56是5.(^^11。010『FGE定向進(jìn)化同源物(SEQ ID NO:55)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQIDNO:57是密切相關(guān)的C. efficiens FGE定向進(jìn)化同源物(GenBankG1:25028125)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:58 是 C. efficiens FGE 定向進(jìn)化同源物(SEQ ID NO:57)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO:59 是 N. aromaticivorans FGE 定向進(jìn)化同源物(GenBank G1:23108562)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:60 是 N. aromaticivorans FGE 定向進(jìn)化同源物(SEQ ID NO: 59)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID勵(lì):61是]\110衍FGE定向進(jìn)化同源物(GenBank 61:13474559)的核苷酸序列。
SEQ ID N0:62是M. loti FGE定向進(jìn)化同源物(SEQ ID N0:61)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID N0:63 是 B. fungorum FGE 定向進(jìn)化同源物(GenBank 61:22988809)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:64是B. fungorum FGE定向進(jìn)化同源物(SEQ ID NO:63)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID N0:65 是 S.meliloti FGE 定向進(jìn)化同源物(GenBank G1: 16264068)的核苷酸序列。
SEQ ID N0:66是S.meliloti FGE定向進(jìn)化同源物(SEQ ID NO:65)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID N0:67是微顫菌屬物種FGE定向進(jìn)化同源物(GenBank G1: 14518334)的核苷酸序列。
SEQ ID N0:68是微顫菌屬物種FGE定向進(jìn)化同源物(SEQ ID NO:67)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO: 69 是 P. putida KT2440FGE 定向進(jìn)化同源物(GenBank G1:26990068)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 70 是 P. putida KT2440 FGE 定向進(jìn)化同源物(SEQ ID NO:69)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO: 71 是 R. metal lidurans FGE 定向進(jìn)化同源物(GenBank G1:22975289)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 72 是 R. metal lidurans FGE 定向進(jìn)化同源物(SEQ ID NO: 71)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID勵(lì):73是卩.11^廳FGE定向進(jìn)化同源物(GenBank 61:23132010)的核苷酸序列。
SEQ ID勵(lì):74是？.1^1^皿8 FGE定向進(jìn)化同源物(SEQ ID NO:73)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO:75 是 C. crescentus CB15 FGE 定向進(jìn)化同源物(GenBank G1:16125425)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:76 是 C. crescentus CB15 FGE 定向進(jìn)化同源物(SEQ ID NO:75)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID NO:77 是 M. tuberculosis Ht37Rv FGE 定向進(jìn)化同源物(GenBank G1:15607852)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 78 是 M. tuberculosis Ht37Rv FGE 定向進(jìn)化同源物(SEQ ID NO: 77)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQ ID N0:79是出現(xiàn)在FGE定向進(jìn)化同源物和平行進(jìn)化同源物的亞結(jié)構(gòu)域3的高度保守六肽。
SEQ ID NO:80 是具有 GenBank Acc. No. :CA379852 的 FGE 定向進(jìn)化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID N0:81 是具有 GenBank Acc. No. :AI721440 的 FGE 定向進(jìn)化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:82 是具有 GenBank Acc. No. :BJ505402 的 FGE 定向進(jìn)化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:83 是具有 GenBank Acc. No. :BJ054666 的 FGE 定向進(jìn)化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:84 是具有 GenBank Acc. No. :AL892419 的 FGE 定向進(jìn)化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:85 是具有 GenBank Acc. No. :CA064079 的 FGE 定向進(jìn)化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:86 是具有 GenBank Acc. No. :BF189614 的 FGE 定向進(jìn)化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:87 是具有 GenBank Acc. No. :AV609121 的 FGE 定向進(jìn)化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQIDNO:88 是 HSulf-3cDNA核苷酸序列.
SEQIDNO:89 是 HSulf-3cDNA(SEQ ID NO :88)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQIDNO:90 是 HSulf-4cDNA核苷酸序列.
SEQIDNO:91 是 HSulf-4cDNA(SEQ ID NO :90)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQIDNO:92 是 HSulf-5cDNA核苷酸序列.
SEQIDNO:93 是 HSulf-5cDNA(SEQ ID NO :92)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
SEQIDNO:94 是 HSulf-6cDNA核苷酸序列.
SEQIDN0:95 是 HSulf-6c DNA(SEQ ID NO:94)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列。
附圖簡(jiǎn)述


圖1:在缺乏(A)或存在(B)來(lái)自牛睪丸微粒體的可溶性抽提物的條件下培育后的P23的MALD1-T0F質(zhì)譜圖示。
圖2:來(lái)源于人FGE和PFAM-DU F323種子的21種蛋白的排列的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。
圖3:人和鼠FGE基因位點(diǎn)的組織。外顯子顯示為以盒子和亮盒子(鼠的位點(diǎn)) 表示。內(nèi)含子線上的數(shù)字指出了以kb表示的內(nèi)含子大小。
圖4:顯示FGE表達(dá)質(zhì)粒pXM G.1. 3結(jié)構(gòu)圖的圖表。
圖5:柱狀圖描述以FGE表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的36F細(xì)胞中的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶活性。
圖6:柱狀圖描述以FGE表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的36F細(xì)胞中的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶比活性。
圖7:柱狀圖描述以FGE表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的36F細(xì)胞中的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶生產(chǎn)。
圖8:描述以FGE表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的30C6細(xì)胞中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性。
圖9:描述了囊括本發(fā)明的特征的試劑盒。
發(fā)明詳述
本發(fā)明包括對(duì)編碼甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的基因的發(fā)現(xiàn)，此酶負(fù)責(zé)發(fā)生在硫酸酯酶上的對(duì)硫酸酯酶功能必需的獨(dú)特翻譯后修飾形成L-Ca-甲酰甘氨酸(a. k. a. FGly和 /或2-氨基-3-氧代丙酸)。已發(fā)現(xiàn)，出人意料地，F(xiàn)GE基因中的突變引起受試者中的多種硫酸酯酶缺乏癥(MSD)的發(fā)展。也已發(fā)現(xiàn)，出人意料地，F(xiàn)GE增強(qiáng)硫酸酯酶的活性，包括但不限于，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶 D,芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4 ,HSulf-5,和 HSulf-6,及在申請(qǐng)?zhí)枮?20030073118, 20030147875, 20030148920, 20030162 279和20030166283的U. S.臨時(shí)申請(qǐng)中所述的硫酸酯酶(其內(nèi)容被清楚地整合在本文中)。 考慮到這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的分子可用于診斷和/或治療多種硫酸酯酶缺乏癥，以及其它硫酸酯酶缺乏癥的治療。
在診斷多種硫酸酯酶缺乏·癥中應(yīng)用本發(fā)明的分子的方法被提供。
此外，為了對(duì)硫酸酯酶上FGly的形成進(jìn)行調(diào)節(jié)的目的而在體內(nèi)或體外應(yīng)用這些分子的方法，治療與這種修飾相關(guān)的病癥的方法，及在制備用于治療多種硫酸酯酶缺乏癥及其它硫酸酯酶缺乏癥的治療性制劑中有用的組合物也被提供。
本發(fā)明因此在幾個(gè)方面中包括調(diào)節(jié)硫酸酯酶上的FGly的形成的多肽，編碼這些多肽的分離的核酸，前述的功能性修飾物和變體，前述的有用片段，以及治療、診斷和研究的方法、組合物和與其相關(guān)的工具。
“Ca-甲酰甘氨酸生成活性”指分子在底物上形成FGly或增強(qiáng)FGly形成的能力。底物也許是如本文其它部分所述的硫酸酯酶，或合成的寡肽(參見(jiàn)，例如SEQ ID NO: 33，和實(shí)施例)。底物優(yōu)選包含SEQ ID NO: 32的保守六肽[L/V-C (S) -X-P-S-R]。 分析FGly形成的方法如本領(lǐng)域中(參見(jiàn)，例如Dierks, T.等，Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. , 1997,94:11963-11968),和本文其它部分(參見(jiàn)，例如實(shí)施例)所描述。在本文中所用的“分子”包含“核酸”和“多肽”。FGE分子能在體內(nèi)和體外形成FGly，或增強(qiáng)/增加 FGly的形成。
在本文中所用的“增強(qiáng)(或“增加”)”Ca_甲酰甘氨酸生成活性，典型地指增加FGE 和/或它編碼的多肽表達(dá)。增加的表達(dá)指增加(即，到可探測(cè)的程度)本發(fā)明任意核酸 (如本文其它部分所描述的FGE核酸)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，既然上調(diào)任何這些過(guò)程將導(dǎo)致基因(核酸)所編碼多肽的濃度/數(shù)量的增加。增強(qiáng)(或增加)Ca-甲酰甘氨酸生成活性也指防止或抑制FGE的降解(例如通過(guò)增加的泛素化作用)、下調(diào)等，所述降解和下調(diào)導(dǎo)致例如相對(duì)于對(duì)照被增加的或穩(wěn)定的FGE分子t1/2 (半衰期)。下調(diào)或減少的表達(dá)指基因和/或它編碼的多肽減少的表達(dá)。通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的任何適合的方法例如核酸雜交或抗體探測(cè)方法，分別探測(cè)基因(例如FGE)mRNA水平或基因所編碼的多肽的蛋白表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照的增加或是減少，可直接測(cè)定基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)。FGE基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)也能通過(guò)探測(cè)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的變化而間接測(cè)定。
在本文中所用的“表達(dá)”指核酸和/或多肽表達(dá)，以及多肽分子的活性(例如分子的匕-甲酰甘氨酸生成活性)。
本發(fā)明的一個(gè)方面包括對(duì)編碼FGE的cDNA的克隆。根據(jù)本發(fā)明的FGE是包含SEQ ID NO:1的核酸分子的分尚的核酸分子,并編碼具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的多肽。人 FGE cDNA的序列以SEQ ID NO:1而出現(xiàn)，此cDNA編碼的蛋白產(chǎn)物的預(yù)期氨基酸序列以SEQ ID NO:2 出現(xiàn)。
在本文中所用的受試者是哺乳動(dòng)物或非人類(lèi)的哺乳動(dòng)物。在所有實(shí)施方案中，人 FGE和人受:試者都是優(yōu)選。
本發(fā)明因此在一個(gè)方面包括分離的FGE多肽，編碼此多肽的cDNA，前述的功能性修飾物和變體，前述的有用片段，以及與其相關(guān)的診斷和治療。
在本文中所用的關(guān)于核酸的術(shù)語(yǔ)“分離的”表示(i)在體外通過(guò)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)所擴(kuò)增的；(ii)通過(guò)克隆所重組性地產(chǎn)生的；(iii)如通過(guò)切斷和凝膠分離所純化的；或(iv)通過(guò)例如化學(xué)合成所合成。分離的核酸是容易通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)操作的類(lèi)型。因此，包含在一定載體中的核苷酸序列被認(rèn)為是分離的，其中所述載體的5’和3’限制性位點(diǎn)已知或者其聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物序列已被公開(kāi)，但在其天然宿主中以其天然狀態(tài)存在的核酸不是分離的。分離的核酸可被充分純化，但不必這樣。 例如，在克隆或表達(dá)載體內(nèi)的分離的核酸不純，這在于它在其寄生的細(xì)胞中也許只包含很少百分比的物質(zhì)。然而，這種核酸是分離的，如本文中所用的術(shù)語(yǔ)一樣，因?yàn)樗菀淄ㄟ^(guò)本領(lǐng)域中一般技術(shù)人員所知道的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被操作。
在本文中所用的關(guān)于多肽的術(shù)語(yǔ)“分離的”表示從其天然環(huán)境中被以充分純的形式分開(kāi)以至于它可被操作于或用于本發(fā)明的任一目的。因此，“分離的”表示純度足以a) 用于生產(chǎn)和/或分離抗體，(ii)用作分析中的試劑，(iii)用于測(cè)序，(iv)用作治療等。
根據(jù)本發(fā)明，編碼具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的FGE多肽的分離的核酸分子包括(a)核酸分子,其在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:1的核酸所組成的分子雜交并編碼具有(。_甲酰甘氨酸生成活性的FGE多肽，(b) (a)的刪除、添加和置換物，其編碼各自的具有 Ca-甲酰甘氨酸生成活性的FGE多肽，(c)因?yàn)檫z傳密碼簡(jiǎn)并性而與(a)或(b)的核酸分子在密碼子序列中不同的核酸分子，和(d) (a), (b)或(C)的互補(bǔ)鏈。在本文中所用的“互補(bǔ)鏈”包括“(a)，(b)或(C)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈或100%的互補(bǔ)鏈”。
也具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的本發(fā)明的FGE核酸的同源物和等位基因也被本發(fā)明所包含。本文所述的同源物，包括本文其它部分所鑒別的分子(參見(jiàn)例如SEQ ID NOs:4, 5，45-78，和80-87)即定向進(jìn)化同源物和平行進(jìn)化同源物。進(jìn)一步的，同源物能依照本發(fā)明的指導(dǎo)以及傳統(tǒng)技術(shù)所鑒別。既然本文所述的FGE同源物全都具有(。_甲酰甘氨酸生成活性，它們能與人FGE分子在本發(fā)明的所有方面中互換性使用。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是那些編碼FGE多肽并在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:1的編碼區(qū)所組成的核酸分子雜交的核酸序列。在重要的實(shí)施方案中，如在此所用的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”指本領(lǐng)域所熟悉的參數(shù)。對(duì)核酸，被稱(chēng)為嚴(yán)格的雜交條件典型的是在低離子強(qiáng)度和恰好低于DNA雜交復(fù)合物熔點(diǎn)(Tm)(典型地，低于雜交物Tm約3° C)的溫度下。更高的嚴(yán)格性限定了探針序列和靶之間更專(zhuān)一的相關(guān)性。核酸雜交中所用的嚴(yán)格條件在本領(lǐng)域中眾所周知，可在匯編這類(lèi)方法的參考文獻(xiàn)中找到，例如Molecular Cloning A Laboratory Manual, J. Sambrook等編，Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,1989,或 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等編，John Wiley & Sons, Inc. , New York. “嚴(yán)格條件”的實(shí)例是在6xSSC中于65° C下雜交。另一嚴(yán)格條件的實(shí)例是在雜交緩沖液中于65° C下雜交， 雜交緩沖液由3. 5xSSC, O. 02%Ficoll, O. 02%聚乙烯吡咯烷酮，O. 02%牛血清白蛋白，2. 5mM NaH2PO4 [pH7]，O. 5%SDS, 2mM EDTA 組成(SSC 是 0. 15M 氯化鈉 /0. 15M 檸檬酸鈉，pH7; SDS 是十二烷基硫酸鈉；而EDTA是乙二胺四乙酸)。雜交之后，轉(zhuǎn)上DNA的膜在2xSSC中于室溫下清洗，然后在最高68°C的溫度下于O. lxSSC/0.1xSDS中清洗。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，雜交水溶液的使用的替代是雜交甲酰胺溶液的使用。應(yīng)用例如50%甲酰胺溶液和42° C，嚴(yán)格的雜交條件能因此被實(shí)現(xiàn)。有其它能被應(yīng)用的條件、試劑等，并將導(dǎo)致類(lèi)似的嚴(yán)格程度。技術(shù)人員將熟悉這類(lèi)條件，因此它們不在這里給出。然而，需要被理解的是，技術(shù)人員將能以允許清晰鑒別本發(fā)明FGE核酸的同源物和等位基因的方式操控條件。技術(shù)人員也將熟悉對(duì)于細(xì)胞和之后將被常規(guī)分離的這類(lèi)分子的表達(dá)庫(kù)進(jìn)行篩選，然后再分離相關(guān)的核酸分子和序列的方法。
一般地，同源物和等位基因典型地將分別與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2具有至少40%核苷酸同一性和/或至少50%氨基酸同一性,在某些情況下將具有至少50%核苷酸同一'I"生和/或至少65%氨基酸同一'丨生,而在其它情況下將具有至少60%核苷酸同一'丨生和/ 或至少75%氨基酸同一性。在進(jìn)一步的情形中，同源物和等位基因典型地將分別與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2具有至少90%, 95%或甚至99%的核苷酸同一性和/或至少95%, 98% 或甚至99%的氨基酸同一'丨生。同一'丨生可應(yīng)用多種由NCBI (Bethesda, Maryland)開(kāi)發(fā)的公開(kāi)可得的軟件工具計(jì)算得到。示例的工具包括Altschul SF等的啟發(fā)式算法(J M ol Biol, 1990, 215:403-410),也稱(chēng)為 BLAST。Pairwise 和 ClustalW 比對(duì)(BL0SUM30 矩陣設(shè)置)以及Kyte-Doolittle水療分析可應(yīng)用公開(kāi)(EMBL, Heidelberg, Germany)和商業(yè)(例如來(lái)自 Oxford Molecular Group/Genetics Computer Group, Madison, WI 的 MacVector 序列分析軟件)的類(lèi)型而獲得。前述核酸的Watson-Crick互補(bǔ)鏈也被本發(fā)明所包括。
在對(duì)FGE相關(guān)基因如FGE的同源物和等位基因的篩選中，Southern印跡可應(yīng)用前述條件以放射性探針來(lái)完成。對(duì)DNA最終轉(zhuǎn)移上去的膜進(jìn)行清洗之后，此膜可放置到X-射線膠片或磷成像平板(phosphoimager plate)以探測(cè)放射性信號(hào)。
在此給定關(guān)于全長(zhǎng)人FGE cDNA克隆的指導(dǎo)，則對(duì)應(yīng)于人FGE基因的其它哺乳動(dòng)物序列如小鼠cDNA克隆可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)菌落雜交技術(shù)從cDNA庫(kù)中分離。
本發(fā)明也包括含有天然物質(zhì)中出現(xiàn)的那些密碼子的替代物的簡(jiǎn)并核酸。例如，絲氨酸殘基被密碼子TCA，AGT, TCC, TCG, TCT和AGC編碼。因此，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員將很明白，任何絲氨酸編碼核苷酸三聯(lián)體可被用于在體內(nèi)或體外指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成裝置，以將絲氨酸殘基整合進(jìn)入正在延伸的FGE多肽。類(lèi)似地，編碼其它氨基酸殘基的核苷酸序列三聯(lián)體包括但不限于CCA，CCC, CCG和CCT (脯氨酸密碼子);CGA, CGC, CGG, CGT, AGA和AGG (精氨酸密碼子)；ACA, ACC, ACG和ACT (蘇氨酸密碼子)；AAC和AAT (天冬酰胺密碼子)；及ATA，ATC 和ATT(異亮氨酸密碼子)。其它氨基酸殘基可類(lèi)似地被若干核苷酸序列編碼。因此，本發(fā)明包括與生物學(xué)上分離的核酸在密碼子序列中因遺傳密碼簡(jiǎn)并性而有所不同的簡(jiǎn)并核酸。
本發(fā)明也提供分離的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3或其互補(bǔ)鏈的獨(dú)特片段。獨(dú)特片段是這樣的類(lèi)型，它是更大的核酸的“標(biāo)志”。例如，獨(dú)特片段長(zhǎng)度足以確保其精確序列無(wú)法在人基因組中位于上述FGE核酸(及人的等位基因)之外的分子中找到。那些本領(lǐng)域中的一般技術(shù)人員可不必應(yīng)用常規(guī)之外的程序來(lái)測(cè)定片段是否在人基因組中是獨(dú)特的。然而， 獨(dú)特片段排除完全由選自SEQ ID N0:4和/或其它如本申請(qǐng)的申請(qǐng)日以前發(fā)表過(guò)的序列的核苷酸序列所組成的片段。
完全由前述GenBank保藏庫(kù)描述的序列所組成的片段不包括任何對(duì)于本發(fā)明序列而言獨(dú)特的核苷酸。因此，根據(jù)本發(fā)明的獨(dú)特片段必須包含除那些GenBank保藏庫(kù)中的確切序列或其片段之外的核苷酸序列。區(qū)別可以是相對(duì)于GenBank序列的添加、刪除或置換，或可以是完全不同于GenBank序列的序列。
獨(dú)特片段能在Southern和Northern印跡分析中用作探針以鑒別這類(lèi)核酸,或能用于如那些采用PCR的擴(kuò)增分析。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，大探針如200，250，300或更多的核苷酸優(yōu)選用于一定的應(yīng)用如Southern和Northern印跡,而更小的片段將優(yōu)選用于例如PCR。獨(dú)特片段也能被用于產(chǎn)生融合蛋白，以產(chǎn)生抗體或測(cè)定如實(shí)施例中證明的多肽片段的結(jié)合或產(chǎn)生免疫分析組分。同樣地，獨(dú)特片段可被用于產(chǎn)生例如在抗體制備、免疫分析或治療應(yīng)用中有用的FGE多肽非融合片段。獨(dú)特片段進(jìn)一步地可被用作反義分子以抑制 FGE核酸和多肽各自的表達(dá)。
如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)到的一樣，獨(dú)特片段的大小將依賴(lài)于其遺傳密碼中的保守性。因此，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3的部分區(qū)域和互補(bǔ)鏈將需要更長(zhǎng)的節(jié)段來(lái)實(shí)現(xiàn)獨(dú)特，而其它的只需要短節(jié)段，典型的是長(zhǎng)12和32個(gè)核苷酸之間(例如12，13，14，15，16 ，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31 和 32 堿基)或更長(zhǎng)，長(zhǎng)到公開(kāi)序列的全長(zhǎng)。如上述所提及的，此公開(kāi)內(nèi)容傾向于包含每一序列的每一片段，起點(diǎn)在第一核苷酸、 第二核苷酸等等，直到離末端剩下8個(gè)核苷酸，而終點(diǎn)在從第8、9、10核苷酸等等開(kāi)始直到恰好最后一個(gè)核苷酸的任何位置(前提為序列是如上述的獨(dú)特片段)。事實(shí)上SEQ ID NO:1 區(qū)域的以核苷酸I開(kāi)始而在核苷酸1180終止或SEQ ID NO 3區(qū)域的以核苷酸I開(kāi)始而在核苷酸1122終止的任何節(jié)段或其互補(bǔ)鏈，長(zhǎng)度為20或更多核苷酸都將是獨(dú)特的。本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)選擇這類(lèi)序列的方法(一般是基于獨(dú)特片段選擇性區(qū)分目的序列與人類(lèi)基因組中其它序列的能力)很精通，雖然可以進(jìn)行體外的證實(shí)性的雜交和序列分析。
如上述所提及的，本發(fā)明包含選擇性結(jié)合編碼FGE多肽的核酸分子以減少FGE活性的反義寡核苷酸。
在本文中所用的術(shù)語(yǔ)“反義寡核苷酸”或“反義”描述一定的寡核苷酸，該寡核苷酸是在生理?xiàng)l件下與包含特定基因的DNA或該基因的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交，而因此抑制該基因的轉(zhuǎn)錄和/或該mRNA的翻譯的寡核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸，修飾后的寡核糖核苷酸，或 修飾后的寡脫氧核糖核苷酸。反義分子被設(shè)計(jì)成與靶基因或轉(zhuǎn)錄物雜交以干擾靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到反義寡核苷酸的確切長(zhǎng)度和它與其目標(biāo)互補(bǔ)的程度將依賴(lài)于所選的特異靶，包括靶的序列和構(gòu)成那一序列的特定堿基。優(yōu)選反義寡核苷酸被構(gòu)建和安排成在生理?xiàng)l件下選擇性地與靶結(jié)合，即相對(duì)于靶細(xì)胞中的任何其它序列在生理?xiàng)l件下更充分地與靶序列雜交?；赟EQ ID NO:1或基于等位基因或同源基因組和/或cDNA序列，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員能容易地挑選和合成出大量合適的反義分子中的任何類(lèi)型以根據(jù)本發(fā)明而應(yīng)用。為了具有充分的選擇性和充分有能力進(jìn)行抑制，這類(lèi)反義寡核苷酸應(yīng)包含與靶互補(bǔ)的至少10個(gè)和更多連續(xù)堿基，優(yōu)選至少15個(gè)，雖然在某些情形中長(zhǎng)度短至7個(gè)堿基的修飾后的寡核苷酸被成功用作反義寡核苷酸(Wagner 等，Nat. Med, 1995，1(11) : 1116-1118; Nat. Biotech.，1996，14:840-844)。最優(yōu)選的是，反義寡核苷酸包含20 - 30個(gè)堿基的互補(bǔ)序列。雖然對(duì)基因或mRNA轉(zhuǎn)錄物任何區(qū)段反義的寡核苷酸可被選出，在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸對(duì)應(yīng)于N端或5’上游位點(diǎn)例如翻譯起點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)或啟動(dòng)子位點(diǎn)。此外，3’ -非翻譯區(qū)可被反義寡核苷酸所祀向。對(duì)mRNA拼接位點(diǎn)的靶向也在本領(lǐng)域中應(yīng)用，但如果替代性的mRNA拼接發(fā)生，則可能不是那么被優(yōu)選。此外，反義物優(yōu)選祀向于不希望出現(xiàn)mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)(參見(jiàn),例如Sainio等，Cell Mol. Neurobiol. 14(5) :439-457, 1994)和不希望出現(xiàn)蛋白結(jié)合的位點(diǎn)。最后，雖然SEQ ID No:1 公開(kāi)了 cDNA序列，本領(lǐng)域中的一般技術(shù)人員可容易地得到對(duì)應(yīng)于此序列的基因組DNA。因此，本發(fā)明也提供與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的基因組DNA互補(bǔ)的反義寡核苷酸。類(lèi)似地，等位基因或同源FGE cDNAs和基因組DNAs的反義物也能應(yīng)用，而不需要過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。
在一組實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義寡核苷酸可由“天然”脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，或它們的任意組合所組成。也就是，一種天然核苷酸的5’末端和另一天然核苷酸的 3’末端可通過(guò)核苷間的磷酸二酯鍵共價(jià)連接，如在天然系統(tǒng)中的一樣。這些寡核苷酸可通過(guò)領(lǐng)域內(nèi)認(rèn)可的方法制備，所述方法可人工或通過(guò)自動(dòng)合成儀而實(shí)施。它們也可通過(guò)載體被重組性地產(chǎn)生。
然而，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義寡核苷酸也可包括“修飾后的”寡核苷酸。也就是，寡核苷酸可通過(guò)許多不會(huì)阻止它們雜交至其目標(biāo)但增強(qiáng)它們的穩(wěn)定性或靶向性或者增強(qiáng)它們的治療效力的方式被修飾。
在本文中所用的術(shù)語(yǔ)“修飾后的寡核苷酸”描述這樣的寡核苷酸，其中⑴其核苷酸中的至少兩個(gè)通過(guò)合成性的核苷間連接而共價(jià)連接(即，一個(gè)核苷酸5’末端和另一核苷酸3’末端之間除磷酸二酯鍵之外的連接)和/或(2)通常不與核酸連接的化學(xué)基團(tuán)已被共價(jià)附著到寡核苷酸。優(yōu)選的合成性核苷間連接是硫代磷酸酯，烷基膦酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸酯，燒基硫代硫酸酯(alkylphosphonothioates),氨基磷酸酯，氨基甲酸酯， 碳酸酯，磷酸三酯，acetamidates,羧甲基酯和肽。
術(shù)語(yǔ)“修飾后的寡核苷酸”也包括具有被共價(jià)修飾的堿基和/或糖的寡核苷酸。例如，修飾后的寡核苷酸包括具有已在除3’位置羥基和5’位 置磷酸基之外的位置共價(jià)附著到低分子量有機(jī)基團(tuán)的糖骨架的寡核苷酸。因此修飾后的寡核苷酸可包括2’-O-烷基化核糖基團(tuán)。此外，修飾后的寡核苷酸可包括糖，例如代替核糖的阿拉伯糖。本發(fā)明因此涉及含有修飾后的反義分子與藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑，所述反義分子與編碼FGE多肽的核酸互補(bǔ)并在生理?xiàng)l件下雜交。反義寡核苷酸可作為藥物組合物的一部分被施用。這類(lèi)藥物組合物可包括與任何本領(lǐng)域中已知的生理性和/或藥學(xué)上可接受的標(biāo)準(zhǔn)載體組合的反義寡核苷酸。組合物應(yīng)是消毒過(guò)的，并以適合對(duì)患者施用的單位重量或體積而含有藥學(xué)有效量的反義寡核苷酸。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”表示不干擾活性成分的生物活性的效力的非毒性物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“生理上可接受的”指與生物系統(tǒng)如細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官相容的非毒性物質(zhì)。載體的特征將依賴(lài)于施用途經(jīng)。生理上和藥學(xué)上可接受的載體包括本領(lǐng)域眾所周知的稀釋劑、填充物、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定物、增溶劑和其它物質(zhì)。
本發(fā)明也包括在細(xì)胞中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的方法。在重要的實(shí)施方案中，這通過(guò)應(yīng)用載體(“表達(dá)載體”和/或“靶向載體”)而完成。
在本文中所用的“載體”可以是多種某類(lèi)核酸中的任何類(lèi)型，所需序列可通過(guò)限制和連接而插入所述核酸以在不同遺傳環(huán)境間運(yùn)輸或在宿主細(xì)胞中表達(dá)。載體典型地由DNA 組成，雖然RNA載體也可用。載體包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒和病毒基因組?？寺≥d體是能在宿主細(xì)胞中復(fù)制，并進(jìn)一步以一個(gè)或更多核酸內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)為特征的類(lèi)型，載體能以可測(cè)方式在所述核酸內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)處被切斷，所需DNA序列可連接進(jìn)入所述位點(diǎn)處而使得新重組載體保持其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的能力。在質(zhì)粒的情形中，所需序列的復(fù)制可因?yàn)橘|(zhì)粒在宿主菌內(nèi)增加拷貝數(shù)目而發(fā)生很多次，或在宿主通過(guò)有絲分裂而復(fù)制之前在每一宿主中恰好單獨(dú)一次。在噬菌體的情形中，復(fù)制可在裂解期期間主動(dòng)發(fā)生或在溶原期被動(dòng)發(fā)生?！氨磉_(dá)載體”是這樣的類(lèi)型，所需DNA序列(例如SEQ ID NO: 3的FGE cDNA)通過(guò)限制和連接插入其中而使得所需DNA序列被可操作性地連接于調(diào)節(jié)序列并可表達(dá)為RNA轉(zhuǎn)錄物。載體可進(jìn)一步包含一個(gè)或更多適合用于鑒別細(xì)胞已被或未被載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的標(biāo)記序列。標(biāo)記包括，例如增加或減少對(duì)抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白的編碼基因，其活性通過(guò)本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)分析可測(cè)的酶(例如β-半乳糖苷酶或堿性磷酸酶) 的編碼基因，及可視性地影響轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、宿主、菌落或菌斑的表型(如綠色熒光蛋白) 的基因。
“靶向載體”是典型地含有一定靶向性結(jié)構(gòu)/序列的類(lèi)型，所述靶向性結(jié)構(gòu)/序列用于例如在內(nèi)源性基因中(例如，在外顯子和/或內(nèi)含子序列內(nèi))，內(nèi)源性基因啟動(dòng)子序列中，或內(nèi)源性基因啟動(dòng)子序列上游插入調(diào)節(jié)序列。在另一實(shí)施例中，靶向載體可包含目的基因(例如SEQ ID NO:1的cDNA所編碼的)和對(duì)基因靶向于基因組中優(yōu)選位置所需的其它序列(例如，轉(zhuǎn)錄活躍位置如無(wú)關(guān)基因的內(nèi)源啟動(dòng)子下游)。靶向性構(gòu)建體和載體的構(gòu)建在 U. S. Patents 5，641，670和6，270, 989中詳細(xì)描述，其被清楚地整合在本文中作為參考。
事實(shí)上，任何能被異源性DNA或RNA轉(zhuǎn)化并能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)或保存的細(xì)胞(原核或真核)，可被用在本發(fā)明的實(shí)踐中。實(shí)施例包括細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌，昆蟲(chóng)細(xì)胞，和哺乳動(dòng)物如人、小鼠、倉(cāng)鼠、豬、山羊、靈長(zhǎng)類(lèi)等的細(xì)胞。它們可以是原代或次級(jí)細(xì)胞株(其在培養(yǎng)中顯示有限數(shù)目的平均群體倍增而不是永久的)和永久的細(xì)胞系(其在培養(yǎng)中顯示明顯的無(wú)限壽命)。原代和次級(jí)細(xì)胞包括，例如，成纖維細(xì)胞，角質(zhì)化細(xì)胞，上皮細(xì)胞 (例如乳腺上皮細(xì)胞，腸上皮細(xì)胞)，內(nèi)皮細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，血液的組成成分(例如淋巴細(xì)胞，骨髓細(xì)胞)，肌肉細(xì)胞和這些體細(xì)胞類(lèi)型的前體包括胚胎干細(xì)胞。 在細(xì)胞將被在基因治療中應(yīng)用時(shí)，原代細(xì)胞優(yōu)選從施予操作后的細(xì)胞的個(gè)體中獲得。然而，原代細(xì)胞能從相同物種的供體(而不是受體)獲得。可與本發(fā)明的DNA構(gòu)建物和方法一起應(yīng)用的永久的人細(xì)胞系實(shí)例包括但不限于HT-1080細(xì)胞(ATCC CCL 121) ,HeLa細(xì)胞和 HeLa 細(xì)胞衍生物(ATCC CCL 2，2.1 和 2. 2)，MCF-7 乳腺癌細(xì)胞(ATCC BTH 22)，K-562 白血`病細(xì)胞(ATCC CCL 243)，KB 癌細(xì)胞(ATCC CCL 17)，2780AD 卵巢癌細(xì)胞(Van der Blick, A. Μ.等，Cancer Res, 48:5927-5932 (1988)，Raji 細(xì)胞(ATCC CCL 86)，WiDr 結(jié)腸腺癌細(xì)胞(ATCC CCL 218)，SW620 結(jié)腸腺癌細(xì)胞(ATCC CCL 227)，Jurkat 細(xì)胞(ATCC TIB 152) ,Namalwa 細(xì)胞(ATCC CRL1432)，HL-60 細(xì)胞(ATCC CCL 240) ,Daudi 細(xì)胞(ATCC CCL 213), RPMI 8226 細(xì)胞(ATCC CCL 155)，U_937 細(xì)胞(ATCC CRL 1593)，Bowes 黑色素瘤細(xì)胞 (ATCC CRL 9607)，W1-38VA13 亞系 2R4 細(xì)胞(ATCC CLL 75.1),和 M0LT-4 細(xì)胞(ATCC CRL 1582)，CHO細(xì)胞，和COS細(xì)胞，以及通過(guò)人細(xì)胞和另一物種細(xì)胞融合而產(chǎn)生的異雜交瘤細(xì)胞。次級(jí)人成纖維細(xì)胞株，如W1-38(ATCC CCL 75)和MRC-5 (ATCC CCL 171)也可被應(yīng)用。 對(duì)可在實(shí)踐本發(fā)明的方法中應(yīng)用的細(xì)胞類(lèi)型的進(jìn)一步討論，在U. S. Patents 5，641，670和 6，270，989中被描述。無(wú)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)也可代替細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞被保存在本領(lǐng)域已知的條件下，這將引起FGE蛋白或其功能性片段的表達(dá)。應(yīng)用所述方法，表達(dá)的蛋白可從細(xì)胞裂解物或細(xì)胞上清中純化。根據(jù)此方法制得的蛋白質(zhì)能被制成藥學(xué)上有用的配劑，并通過(guò)本領(lǐng)域中已知的傳統(tǒng)藥學(xué)途徑而遞送至人或非人的動(dòng)物(例如口服，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，鼻內(nèi)，氣管內(nèi)或皮下)。如本文其它部分所描述的，重組細(xì)胞可以是永生化的、原代的或次級(jí)的細(xì)胞，優(yōu)選人的細(xì)胞。來(lái)自其它物種的細(xì)胞的應(yīng)用可在一定的情形中是合意的，所述情形為非人細(xì)胞有利于在所產(chǎn)生的非人FGE在藥學(xué)上有用的情況下的蛋白產(chǎn)生的目的。
在本文中所用的編碼序列和調(diào)控序列，當(dāng)它們以將編碼序列的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄置于調(diào)控序列的影響或控制之下的方式而共價(jià)連接時(shí)，被表述成“可操作性地”連接。如果期望編碼序列被翻譯成功能性蛋白質(zhì)，而假如5’調(diào)控序列中的啟動(dòng)子的誘導(dǎo)導(dǎo)致編碼序列的轉(zhuǎn)錄，并且兩個(gè)DNA序列間的連接(I)不會(huì)導(dǎo)致移碼突變的引入，(2)不會(huì)干擾啟動(dòng)子區(qū)域指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄的能力，或(3)不會(huì)干擾相應(yīng)的RNA轉(zhuǎn)錄物被翻譯成為蛋白的能力，則兩個(gè) DNA序列被表述成“可操作性地”連接。因此，如果啟動(dòng)子區(qū)域能影響那一 DNA序列的轉(zhuǎn)錄從而所得的轉(zhuǎn)錄物可被翻譯成所期望的蛋白或多肽，則啟動(dòng)子區(qū)域?qū)⒖刹僮餍缘剡B接編碼序列。
基因表達(dá)所需的調(diào)控序列的精確本質(zhì)可在物種或細(xì)胞類(lèi)型間變動(dòng)，但將一般性地包括，如所必需的，于轉(zhuǎn)錄和翻譯各自啟動(dòng)有關(guān)的5’非轉(zhuǎn)錄和5’非翻譯序列，如TATA盒， 加帽序列，CAAT序列和類(lèi)似物。尤其是，這類(lèi)5’非轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列將包括包含對(duì)可操控性連接的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制的啟動(dòng)子序列的啟動(dòng)子區(qū)域。調(diào)控序列也可包括所期望的增強(qiáng)子序列或上游激動(dòng)子序列。本發(fā)明的載體可隨意包括5’前導(dǎo)或信號(hào)序列。對(duì)合適載體的選擇和設(shè)計(jì)是在本領(lǐng)域一般技術(shù)人員的能力和指導(dǎo)之內(nèi)。
包含所有表達(dá)必需的元件的表達(dá)載體可商業(yè)性地獲得，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。參見(jiàn)，例如 Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。細(xì)胞通過(guò)編碼 FGE 多妝或其片段或變體的異源性DNA (RNA)被引入而基因工程化。那一 DNA (RNA)被置于轉(zhuǎn)錄元件的可操作性控制之下，以允許異源DNA在 宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)mRNA的優(yōu)選系統(tǒng)例如包含選擇標(biāo)記如給予G418 抗性的基因(其促進(jìn)對(duì)穩(wěn)定性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的選擇)和人細(xì)胞巨化病毒(CMV)增強(qiáng)子-啟動(dòng)子序列的pRc/CMV(可從Invitrogen, Carlsbad, CA得到)。此外，適合在靈長(zhǎng)類(lèi)和犬類(lèi)細(xì)胞系中進(jìn)行表達(dá)的類(lèi)型有pCEP4載體(Invitrogen, Carlsbad, CA),其包含促進(jìn)質(zhì)粒作為多拷貝的染色體外元件而保存的EB病毒(EBV)復(fù)制起點(diǎn)。另一表達(dá)載體是包含多肽延伸因子Ia的啟動(dòng)子的PEF-BOS質(zhì)粒，其有效刺激了體外的轉(zhuǎn)錄。質(zhì)粒被 Mishizuma 和 Nagata(Nuc. Acids Res. 18:5322, 1990)描述，而其在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用已得到公開(kāi)，例如，Demoulin(Mol. Cell. Biol. 16:4710-4716，1996)。又一優(yōu)選的表達(dá)載體是Stratford-Perricaudet所述的腺病毒，其El和E3蛋白有缺陷(J. Clin.1nvest. 90:626-630, 1992)。腺病毒作為Adeno. PlA重組體的應(yīng)用被Warnier等所公開(kāi)，用于在小鼠皮內(nèi)注射以得到抗PlA的免疫化(Int. J. Cancer, 67:303-310, 1996)。
本發(fā)明也包括所謂的表達(dá)試劑盒，其允許技術(shù)人員制備所期望的表達(dá)載體或載體。這類(lèi)表達(dá)試劑盒至少包括每一前面討論的編碼序列的單獨(dú)部分。其它成分可按需要添加，只要前面提到的所需的序列被包括在內(nèi)。
也應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明包含上述的包含表達(dá)FGE cDNA序列的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞和細(xì)胞系的應(yīng)用，這些細(xì)胞是原核(例如大腸桿菌)或真核性(例如CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，酵母表達(dá)系統(tǒng)和在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒)的。尤其有用的是哺乳動(dòng)物細(xì)胞如人，小鼠， 倉(cāng)鼠，豬，山羊，靈長(zhǎng)動(dòng)物等的細(xì)胞。它們可以是多種組織類(lèi)型，包括如本文其它部分所描述的原代細(xì)胞和永生化的細(xì)胞系。具體實(shí)例包括HT-1080細(xì)胞，CHO細(xì)胞，樹(shù)狀細(xì)胞，U293 細(xì)胞，外周血白細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，和昆蟲(chóng)細(xì)胞。本發(fā)明也允許細(xì)胞和動(dòng)物中的FGE基因“敲除”的構(gòu)建，為研究FGE活性的某些方面提供材料。
本發(fā)明也提供被前述FGE核酸編碼的分離的多肽(包括完整蛋白和部分蛋白)，也包括SEQ ID N0:2的多肽和其獨(dú)特片段。這類(lèi)多肽可用于，例如，單獨(dú)或作為融合蛋白的部分去產(chǎn)生作為免疫分析成分的抗體。多肽可以是從生物樣本包括組織或細(xì)胞勻漿中分離的，也可是在多種原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中重組性表達(dá)的，所述重組性表達(dá)通過(guò)構(gòu)建適合于表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體，將表達(dá)載體引入表達(dá)系統(tǒng)，及分離重組性表達(dá)的蛋白而完成。短多肽，包括抗原性肽(如被MHC分子呈遞在細(xì)胞表面以進(jìn)行免疫識(shí)別的)也能應(yīng)用已良好建立的肽合成方法化學(xué)合成。
一般而言，F(xiàn)GE多肽的獨(dú)特片段具有如上述討論的與核酸相關(guān)的獨(dú)特片段的特征和特性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，獨(dú)特片段的大小將依賴(lài)于一定的因素，例如片段是否組成了保守蛋白結(jié)構(gòu)域的一部分。因此，SEQ ID N0:2的部分區(qū)域?qū)⑿枰L(zhǎng)的片段以保證獨(dú)特，而其它的只需要短片段，典型的是在5和12個(gè)氨基酸之間(例如5，6，7,8,9, 10，11 和12氨基酸長(zhǎng)或者更多，包括每一整數(shù)直到全長(zhǎng)，287個(gè)氨基酸長(zhǎng))。
多肽的獨(dú)特片段優(yōu)選保持明顯的多肽功能能力的那些片段。可被保持在多肽的獨(dú)特片段中的功能能力包括與抗體的相互作用、與其它多肽或其片段的相互作用，與其它分子的相互作用等。一種重要的活性是作為鑒別多肽的標(biāo)簽而起作用的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員很精通于選擇獨(dú)特氨基酸序列的方法，典型的是基于獨(dú)特片段從非家族成員中選擇性識(shí)別出目的序列的能力。片段的序列與那些數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比較即是所需的。
本發(fā)明包括上述FGE多肽的變體。在本文中所用的FGE多肽的“變體”是包含一種或更多對(duì)FGE多肽一級(jí)氨基酸序列的修飾的多肽。創(chuàng)造FGE多肽變體的修飾，典型的 是被施加給編碼FGE多肽的核酸，可包括刪除、點(diǎn)突變、截?cái)?、氨基酸置換和氨基酸或非氨基酸部分的添加，以1)減少或消除FGE多肽的活性；2)增強(qiáng)FGE多肽的性質(zhì)，如表達(dá)系統(tǒng)中的蛋白穩(wěn)定性或蛋白-配體結(jié)合的穩(wěn)定性；3)對(duì)FGE多肽提供新活性或性質(zhì)，如抗原性表位的添加或可探測(cè)部分的添加；或4)提供與FGE多肽受體或其它分子的相等或更好的結(jié)合。替代性地，修飾可直接施加給多肽，如通過(guò)切斷，連接分子的添加，可探測(cè)部分如生物素的添加，脂肪酸的添加和類(lèi)似的方式。修飾也包括包含全部或部分FGE氨基酸序列的融合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)熟悉預(yù)測(cè)蛋白序列變化對(duì)蛋白構(gòu)象的影響的方法，并能因此根據(jù)已知方法而“設(shè)計(jì)” FGE多肽的變體。這種方法的一個(gè)實(shí)例被Dahiyat和Mayo在 Science278:82-87，1997中描述，其中蛋白質(zhì)可被重新設(shè)計(jì)。此方法能被應(yīng)用于已知的蛋白，以?xún)H改變多肽序列的一部分。通過(guò)應(yīng)用Dahiyat和Mayo的計(jì)算方法，具體的FGE多肽的變體可得到提議和被測(cè)試以測(cè)定變體是否保持了所期望的構(gòu)象。
變體可包括被專(zhuān)一修飾的FGE多肽，所述修飾是為了改變多肽的與其生理活性無(wú)關(guān)的特征。例如，半胱氨酸殘基能被置換或刪除以防止不必要的二硫鍵連接。類(lèi)似地，一定的氨基酸可被改變以通過(guò)消除表達(dá)系統(tǒng)中由蛋白酶作用的蛋白水解而增強(qiáng)FGE多肽的表達(dá)(例如存在KEX2蛋白酶活性的酵母表達(dá)系統(tǒng)中的雙堿性氨基酸殘基)。
編碼FGE多肽的核酸的突變優(yōu)選保存編碼序列的氨基酸閱讀框，并優(yōu)選不在核酸中創(chuàng)造出很可能雜交以形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)例如發(fā)卡或環(huán)結(jié)構(gòu)能對(duì)變體多肽的表達(dá)有害。
突變可通過(guò)選擇氨基酸置換或多肽編碼核酸中選定位置的隨機(jī)突變而發(fā)生。變體多肽隨后得到表達(dá)，并進(jìn)行對(duì)一種或更多活性的檢測(cè)，以測(cè)定哪個(gè)突變?yōu)樽凅w多肽提供了期望的性質(zhì)。進(jìn)一步的對(duì)多肽的氨基酸序列而言沉默的突變可提供給變體(或非變體的 FGE多肽)，但其提供在特定宿主中優(yōu)選的翻譯密碼子，或改變mRNA的結(jié)構(gòu)以，例如，增強(qiáng)穩(wěn)定性和/或表達(dá)。優(yōu)選的在例如大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等中的核酸翻譯密碼子，對(duì)本領(lǐng)域中的一般技術(shù)人員而言眾所周知。其它突變也可提供給FGE基因或cDNA克隆的非編碼序列以增強(qiáng)多肽的表達(dá)。
技術(shù)人員將意識(shí)到保 守氨基酸置換可發(fā)生在FGE多肽中以提供功能等同的前述多肽的變體，即，變體保持FGE多肽的功能能力。在本文中所用的“保守氨基酸置換”指不顯著改變?nèi)?jí)結(jié)構(gòu)和/或多肽活性的氨基酸置換。變體可根據(jù)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的改變多肽序列的方法而制備，并包括那些在匯編這類(lèi)方法的參考文獻(xiàn)中找到的類(lèi)型，例如 Molecular Cloning A Laboratory Manual, J. Sambrook 等編，Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989,或 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等編，John Wiley & Sons, Inc. , New York。示例性的FGE多肽的功能等同性變體包括對(duì)SEQ ID NO:2的保守氨基酸置換。保守氨基酸置換包括發(fā)生在下列組群內(nèi)部氨基酸中間的置換(a)M，I，L，V; (b)F, Y,ff; (c) K, R,H; (d)A,G; (e)S,T; (f)Q,N;和(g)E，D.
因此FGE多肽的功能等同的變體，即，保持天然FGE多肽功能的FGE多肽的變體被本發(fā)明所涉及。FGE多肽氨基酸序列中產(chǎn)生功能等同性變體的保守氨基酸置換，典型地是通過(guò)編碼FGE多肽的核酸(SEQ ID NOs:1, 3)的改變所提供。這類(lèi)置換可通過(guò)多種本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的方法而得到。例如，氨基酸置換可通過(guò)PCR導(dǎo)向突變，根據(jù)Kunkel的方法(KunkeI, Proc. Nat. Acad. Sc1. U. S. A. 82:488-492，1985)的定點(diǎn)突變，或編碼 FGE 多肽的基因的化學(xué)合成而得到。FGE多肽的功能等同片段的活性能通過(guò)將編碼改變后的FGE多肽的基因克隆進(jìn)細(xì)菌或哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，將載體引入合適的宿主細(xì)胞，表達(dá)改變后的FGE 多肽，和測(cè)試在本文中公開(kāi)的FGE多肽的功能能力(例如Ca-甲酰甘氨酸生成活性等)，而得到測(cè)試。
在本文中所述的發(fā)明具有許多應(yīng)用，其中的一部分在本文其它部分被描述。首先， 本發(fā)明允許對(duì)FGE多肽的分離。技術(shù)從業(yè)人員眾所周知的多種方法能被用于得到分離的 FGE分子。多肽可從天然產(chǎn)生多肽的細(xì)胞中通過(guò)層析方式或免疫識(shí)別而純化。替代性地，表達(dá)載體可被引入細(xì)胞以引起多肽的產(chǎn)生。在另一方法中，mRNA轉(zhuǎn)錄物可被微注射或另外地被引入細(xì)胞以引起被編碼的多肽的產(chǎn)生。FGE mRNA在無(wú)細(xì)胞抽提物如網(wǎng)織紅細(xì)胞降解系統(tǒng)中的翻譯也可被用于產(chǎn)生FGE多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可容易地遵循已知的分離FGE多肽的方法。這些包括但不限于免疫層析，HPLC，大小排阻層析，離子交換層析和免疫親和層析。
在一定的實(shí)施方案中，本發(fā)明也提供來(lái)源于FGE多肽的“顯性失活”多肽。顯性失活多肽是蛋白質(zhì)的失活變體，其通過(guò)與細(xì)胞機(jī)制相互作用而從活性蛋白與細(xì)胞機(jī)制的相互作用中取代了活性蛋白，或與活性蛋白競(jìng)爭(zhēng)，而減小了活性蛋白的效應(yīng)。例如，與配體結(jié)合但不會(huì)轉(zhuǎn)導(dǎo)響應(yīng)于配體結(jié)合的信號(hào)的顯性失活受體能減小配體表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)。同樣地，與靶蛋白正常相互作用但不磷酸化靶蛋白的顯性失活催化惰性激酶，能減少靶蛋白響應(yīng)于細(xì)胞信號(hào)的磷酸化。類(lèi)似地，結(jié)合到基因調(diào)控區(qū)域的啟動(dòng)子位置但不增加基因轉(zhuǎn)錄的顯性失活轉(zhuǎn)錄因子能通過(guò)占據(jù)啟動(dòng)子結(jié)合位置而不增加轉(zhuǎn)錄來(lái)減小正常轉(zhuǎn)錄因子的效應(yīng)。
顯性失活多肽在細(xì)胞中表達(dá)的最終結(jié)果是活性蛋白質(zhì)的功能的減少。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員能評(píng)估顯性失活蛋白變體的潛力，并用標(biāo)準(zhǔn)突變技術(shù)創(chuàng)造一種或更多顯性失活變體蛋白。參見(jiàn)，例如 U. S. Patent No. 5，580，723 和 Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。技術(shù)人員隨后能測(cè)試經(jīng)誘變的蛋白群體的選定活性的減少和/或?qū)@種活性的保持力。其它類(lèi)似的用于創(chuàng)造和測(cè)試蛋白的顯性失活變體的方法對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員將是很顯然的。
FGE cDNA的分離也使技術(shù)人員可能診斷以FGE異常表達(dá)為特征的疾病。這些方法包括測(cè)定FGE基因和/或源于其的FGE多肽的表達(dá)。在前者的情形下，這類(lèi)測(cè)定能通過(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)的核酸測(cè)定分析而進(jìn)行，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，或如下面作為例子的采用標(biāo)記性雜交探針的分析。在后者的情形下，這類(lèi)測(cè)定能通過(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)的(應(yīng)用例如結(jié)合到分泌出的 FGE蛋白的抗體的)免疫分析而進(jìn)行。優(yōu)選的可根據(jù)本發(fā)明診斷的疾病是多種硫酸酯酶缺乏癥。
本發(fā)明也包括分離的肽結(jié)合試劑，所述試劑，例如，可以是具有選擇性結(jié)合到FGE 多肽的能力的抗體或抗體片段(“結(jié)合性多肽”)。抗體包括根據(jù)傳統(tǒng)方法制備的多克隆和單克隆抗體。在一定的實(shí)施方案中，本發(fā)明排除了與SEQ ID N0:4的核酸所編碼的多肽 結(jié)合的結(jié)合性試劑(例如抗體)。
值得注意的是，如本領(lǐng)域中眾所周知的，只有抗體分子的一小部分，即抗原互補(bǔ)位，涉及抗體與其表位的結(jié)合(參見(jiàn)，一般地，Clark, ff. R. (1986)The Experimental Foundations of Modern Tmmunologv Wiley & Sons, Inc. , New York;Roitt,1. (1991) Essential Tmmunol ogv. 7th Ed. , Blackwell Scientific Publications, Oxford)。例如， pFc’和Fe區(qū)域是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的效應(yīng)子但不涉及抗原結(jié)合。pFc’區(qū)域已被酶切掉的抗體或產(chǎn)生時(shí)不含pFc’區(qū)域的抗體，它們被稱(chēng)為F(ab’)2片段，保持了完整抗體的兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。類(lèi)似地，F(xiàn)e區(qū)域已被酶切掉的抗體或產(chǎn)生時(shí)不含F(xiàn)e區(qū)域的抗體，它們被稱(chēng)為Fab片段，保持了完整抗體分子的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步地，F(xiàn)ab片段由共價(jià)結(jié)合的抗體輕鏈和被表示為Fd的抗體重鏈的一部分所組成。Fd片段是抗體專(zhuān)一性的主要決定因素(單一 Fd片段可與多達(dá)10條的不同輕鏈相連而不改變抗體專(zhuān)一性)，并且Fd片段在分離后保持表位一結(jié)合能力。
如本領(lǐng)域中眾所周知的，在抗體的抗原結(jié)合部分內(nèi)部有直接與抗原表位相互作用的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDRs)，也有保持抗體結(jié)合部位三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)架區(qū)域(FRs)(參見(jiàn)，一般地，Clark, 1986;Roitt, 1991)。在IgG免疫球蛋白重鏈Fd片段和輕鏈中，有通過(guò)三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)域(⑶Rl到⑶R3)分別分開(kāi)的四個(gè)構(gòu)架區(qū)域(FRl到FR4)。⑶Rs尤其是⑶R3區(qū)域，更尤其是重鏈CDR3，很大程度上對(duì)抗體專(zhuān)一性負(fù)責(zé)。
現(xiàn)在在本領(lǐng)域中已很好地認(rèn)識(shí)到，哺乳動(dòng)物抗體的非CDR區(qū)域可被同種或異種特異性抗體的類(lèi)似區(qū)域所替代，而保持原始抗體的表位專(zhuān)一性。這在制備和應(yīng)用“人源化”抗體中表現(xiàn)得最清晰，其中非-人⑶Rs共價(jià)連接到人FR和/或Fc/pFc’區(qū)域以產(chǎn)生功能抗體。參見(jiàn)，例如 U. S. patents 4，816，567，5，225，539，5，585，089，5，693，762 和 5，859，205。 因此，例如，PCT國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 92/04381教授了人源化的鼠類(lèi)RSV抗體的生產(chǎn)和應(yīng)用，其中至少鼠FR區(qū)域的一部分被人源性的FR區(qū)域所取代。這類(lèi)抗體，包括具有抗原結(jié)合能力的完整抗體的片段，經(jīng)常被表示成“嵌合的”抗體。
因此，正如對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員而言是很明白的，本發(fā)明也提供 F(ab，)2，F(xiàn)ab, Fv和Fd片段；其中Fe和/或FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3 區(qū)域已被同源的人或非-人序列所取代的嵌合的抗體；其中FR和/或CDRl和/或CDR2和 /或輕鏈CDR3區(qū)域已經(jīng)被同源的人或非序列所取代的嵌合F(ab’ )2片段抗體；其中FR和 /或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)域已被同源的人或非-人序列所取代的嵌合的 Fab片段抗體；以及其中FR和/或CDRl和/或CDR2區(qū)域已被同源的人或非-人序列所取代的嵌合的Fd片段抗體。本發(fā)明也包括所謂的單鏈抗體。
因此，本發(fā)明包括與FGE多肽專(zhuān)一結(jié)合的多種大小和類(lèi)型的多肽，及FGE多肽與其結(jié)合伴侶的復(fù)合物。這些多肽也可由抗體技術(shù)之外的其它來(lái)源得來(lái)。例如，這類(lèi)多肽結(jié)合試劑能由簡(jiǎn)并肽庫(kù)而提供，所述簡(jiǎn)并肽庫(kù)可很容易以溶液、以固定的形式作為細(xì)菌鞭毛肽展示庫(kù)或噬菌體展示庫(kù)而制備。也可制備含有一個(gè)或更多氨基酸的肽組合文庫(kù)。文庫(kù)能進(jìn)一步由肽和非肽的合成部分合成。
噬菌體展示能在鑒別根據(jù)本發(fā)明而有用的結(jié)合肽中特別有效。簡(jiǎn)而言之，可應(yīng)用傳統(tǒng)程序制備顯示4到約80個(gè)氨基酸殘基插入物的噬菌體庫(kù)(應(yīng)用例如ml3，fd，或λ噬菌體)。插入物可代表，例如，完全的降解物或有偏差的陣列。然后可挑選噬菌體承載性插入物，其結(jié)合到FGE多肽或FGE和結(jié)合伴侶的復(fù)合物。此過(guò)程可通過(guò)復(fù)選結(jié)合到FGE多肽或復(fù)合物的噬菌體的幾個(gè)循環(huán)而重復(fù)。重復(fù)的循環(huán)導(dǎo)致承載特定序列的噬菌體的富集。DNA 序列分析可以進(jìn)行，以鑒別所表達(dá)多肽的序列。結(jié)合FGE多肽或復(fù)合物的序列的最小線性部分可被測(cè)定。應(yīng)用含有插入物的偏差性的庫(kù)，可重復(fù)這些程序，所述插入物包含最小線性部分的一部分或 全部外加一個(gè)或更多附加的其上游或下游的簡(jiǎn)并殘基。酵母雙雜交篩選方法也可用于鑒別結(jié)合到FGE多肽的多肽。因此，本發(fā)明的FGE多肽或其片段或FGE與結(jié)合伴侶的復(fù)合物能被用于篩選肽庫(kù)，包括噬菌體展示庫(kù)，以鑒別和選擇本發(fā)明FGE多肽的肽結(jié)合伴侶。這類(lèi)分子能用于，如所述的，篩選分析，純化方案，對(duì)FGE功能的直接干擾，及其它對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員而言很顯然的目的。
FGE多肽或其片段也能用于分離它們的天然結(jié)合伴侶。對(duì)結(jié)合伴侶的分離可根據(jù)眾所周知的方法完成。例如，分離的FGE多肽能被附著于某一基質(zhì)，然后被懷疑含有FGE結(jié)合伴侶的溶液可應(yīng)用到基質(zhì)上。如果FGE多肽的結(jié)合伴侶在溶液中存在，那么它將結(jié)合到基質(zhì)固著的FGE多肽。之后結(jié)合伴侶可被分離出。充當(dāng)FGE結(jié)合伴侶的其它蛋白質(zhì)可通過(guò)類(lèi)似方法分離出，而不需要過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。優(yōu)選的結(jié)合伴侶是硫酸酯酶。
本發(fā)明也提供測(cè)量FGE在受試者中表達(dá)水平的方法。這可通過(guò)首先得到來(lái)自受試者的測(cè)試樣本而完成。測(cè)試樣本可以是組織或生物液體。組織包括腦，心臟，血清，乳房，結(jié)腸，膀胱，子宮，前列腺，胃，睪丸，卵巢，胰，垂體腺，腎上腺，甲狀腺，唾液腺，乳腺，腎，肝，腸，脾，胸腺，血管，骨髓，氣管，和肺。在一定的實(shí)施方案中，測(cè)試樣本源自心臟和血管組織,生物液體包括血液，唾液和尿。創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性技術(shù)都能用于獲得這類(lèi)樣本，并在本領(lǐng)域中被很好地記載。在分子水平上，應(yīng)用本發(fā)明在此所述的產(chǎn)物和可在匯編這類(lèi)方法的參考文獻(xiàn)中找到的本領(lǐng)域眾所周知的方案,PCR和Northern印跡都能用于測(cè)定FGE mRNA的水平。在蛋白質(zhì)水平上，應(yīng)用多克隆或單克隆抗FGE血清結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)免疫分析，F(xiàn)GE表達(dá)可被測(cè)定。優(yōu)選的方法將會(huì)把測(cè)得的測(cè)試樣本的FGE表達(dá)水平與對(duì)照進(jìn)行比較。對(duì)照可包括已知量的核酸探針、FGE表位(如FGE表達(dá)產(chǎn)物)，或來(lái)自具有對(duì)照或“正?！彼紽GE表達(dá)的受試者的類(lèi)似測(cè)試樣本。
FGE多肽優(yōu)選重組性產(chǎn)生，雖然這類(lèi)蛋白可從生物抽提物中分離出。重組性產(chǎn)生的FGE多肽包括含有FGE蛋白與另一多肽的融合物的嵌合的蛋白質(zhì)，所述多肽例如能提供或增強(qiáng)蛋白一蛋白結(jié)合、序列專(zhuān)一性核酸結(jié)合(如GAL4)，增強(qiáng)FGE多肽在分析條件下的穩(wěn)定性，或提供可探測(cè)性的部分例如綠色熒光蛋白。融合到FGE多肽或片段的多肽也可提供易于探測(cè)融合蛋白的手段，例如通過(guò)免疫識(shí)別或通過(guò)熒光標(biāo)記。
本發(fā)明也在產(chǎn)生非人的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中有用。在本文中所用的“非人的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物” 包括具有整合在生殖系細(xì)胞和/或體細(xì)胞中的一種或更多的外生性核酸分子的非人的動(dòng)物。因此轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括通過(guò)同源重組而具有純合或雜合基因斷裂的“敲除的”動(dòng)物，具有游離或染色體整合的表達(dá)載體的動(dòng)物等。敲除動(dòng)物能通過(guò)應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的胚胎干細(xì)胞的同源重組而制得。重組可應(yīng)用例如本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的cre/lox系統(tǒng)或其它重組酶系統(tǒng)而促進(jìn)。在一定的實(shí)施方案中，重組酶系統(tǒng)本身是條件性地表達(dá)，例如在一定組織或細(xì)胞類(lèi)型中，在一定胚胎或胚胎后發(fā)育階段，因增加或減弱表達(dá)的化合物或類(lèi)似物質(zhì)的加入而被誘導(dǎo)。一般地，在這類(lèi)系統(tǒng)中應(yīng)用的條件表達(dá)載體應(yīng)用多種可賦予所期望的基因表達(dá)模式(例如時(shí)間或空間性的)的啟動(dòng)子。條件啟動(dòng)子也能可操縱性地連接到FGE核酸分子以受調(diào)節(jié)或條件性的方式增加FGE的表達(dá)。FGE活性或表達(dá)的反式-作用負(fù)調(diào)節(jié)子也能可操縱性地連接到上述的條件啟動(dòng)子。這類(lèi)反式-作用調(diào)節(jié)子包括反義FGE核酸分子，編碼顯性失活FGE分子的核酸分子，對(duì)FGE核酸專(zhuān)一的核酶分子，和類(lèi)似物。非人的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在用于對(duì)診斷或治療方法的生化或生理效應(yīng)進(jìn)行測(cè)試的實(shí)驗(yàn)中有用，所述診斷或治療方法針對(duì)以增加或減少FGE表達(dá)為 特征的病癥。其它應(yīng)用對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員而言是很顯然的。
本發(fā)明也涉及基因治療。完成離體基因治療的程序在U. S. Patent5, 399，346中概述，也顯示于該專(zhuān)利審查中所提交的文件，其所有內(nèi)容都是公開(kāi)可得的文件。一般地，它包括在體外將基因的功能拷貝引入到包含基因缺陷性拷貝的受試者的細(xì)胞中，將基因工程化的細(xì)胞回置到受試者中?；虻墓δ芸截愂翘幱谠试S基因在基因工程化細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件的可操作性控制下。許多轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)以及適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所熟知，其中的一部分在PCT申請(qǐng)W095/00654中被描述。應(yīng)用例如腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒， 皰疹病毒，和靶向的脂質(zhì)體之類(lèi)載體的體內(nèi)基因治療也根據(jù)本發(fā)明而涉及。
本發(fā)明進(jìn)一步提供鑒別試劑或引導(dǎo)化合物以得到在FGE或FGE片段依賴(lài)性細(xì)胞功能的水平上有活性的試劑的有效方法。這類(lèi)功能尤其包括與其它多肽或片段的相互作用。 一般地，篩選方法包括對(duì)干擾FGE活性(如Ca-甲酰甘氨酸生成活性)的化合物的分析，雖然增強(qiáng)FGE Ca-甲酰甘氨酸生成活性的化合物也能應(yīng)用該篩選方法而被分析。這類(lèi)方法能被適應(yīng)于自動(dòng)化的高產(chǎn)出的化合物篩選。靶指標(biāo)包括被FGE調(diào)節(jié)的細(xì)胞過(guò)程如Ca-甲酰甘氨酸生成活性。
多種對(duì)備選(藥理上的)試劑的分析被提供，包括標(biāo)記的體外蛋白質(zhì)一配體結(jié)合分析，電泳遷移改變分析，免疫分析，基于細(xì)胞的分析例如雙雜交或三雜交篩選，表達(dá)分析等。 轉(zhuǎn)染的核酸能編碼例如，組合肽庫(kù)或cDNA庫(kù)。便于這類(lèi)分析的試劑例如GAL4融合蛋白在本領(lǐng)域中眾所周知。可作為范例的基于細(xì)胞的分析包括，以編碼融合到GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的FGE多肽的核酸和編碼可操作性地連接到基因表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)(如一個(gè)或更多GAL4結(jié)合位點(diǎn))的報(bào)告基因的核酸而轉(zhuǎn)染細(xì)胞。報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的活化發(fā)生在FGE和報(bào)告融合多肽結(jié)合以例如激·活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)。之后，調(diào)節(jié)FGE多肽介導(dǎo)的細(xì)胞功能的試劑通過(guò)報(bào)告基因表達(dá)的變化而被探測(cè)。測(cè)定報(bào)告基因表達(dá)變化的方法在本領(lǐng)域中眾所周知。
方法中所用的FGE片段當(dāng)不是由轉(zhuǎn)染的核酸所產(chǎn)生時(shí)，作為分離的多肽加入到分析混合物中。FGE多肽優(yōu)選重組產(chǎn)生，雖然此多肽可從生物抽提物中分離。重組產(chǎn)生的FGE 多肽包括包含F(xiàn)GE蛋白與另一多肽的融合體的嵌合蛋白質(zhì)，另一多肽例如能提供或增強(qiáng)蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)結(jié)合、序列專(zhuān)一性核酸結(jié)合(如GAL4)、增強(qiáng)FGE多肽在分析條件下的穩(wěn)定性或提供可探測(cè)部分例如綠色熒光蛋白或Flag表位。
分析混合物包含能與FGE相互作用的天然的細(xì)胞內(nèi)FGE結(jié)合祀。當(dāng)天然FGE結(jié)合靶可用時(shí)，常常優(yōu)選應(yīng)用FGE結(jié)合靶的局部(例如肽-參見(jiàn)例如SEQ ID NO: 33的肽-或核酸片段)或類(lèi)似物(即，為分析目的而模擬天然結(jié)合靶的FGE結(jié)合性質(zhì)的試劑)，只要局部或類(lèi)似物提供分析中可測(cè)量的對(duì)FGE片段的結(jié)合親合性和強(qiáng)烈結(jié)合傾向。
分析混合物也包含候選物質(zhì)。典型地，多個(gè)分析混合物以不同試劑濃度平行進(jìn)行， 以得到對(duì)多種濃度的不同反應(yīng)。典型地，這些濃度中的某一個(gè)用作負(fù)對(duì)照，即，試劑的零濃度或在分析的探測(cè)極限之下的試劑濃度。候選物質(zhì)包括許多化學(xué)種類(lèi)，雖然它們典型的是有機(jī)化合物。優(yōu)選地，候選物質(zhì)是小分子有機(jī)化合物，即那些具有大于50然而小于約2500 的分子量的類(lèi)型，優(yōu)選小于約1000，而更優(yōu)選小于約500。候選物質(zhì)包含與多肽和/或核酸的結(jié)構(gòu)性相互作用所必需的功能化學(xué)基團(tuán)，并典型地包括至少一個(gè)氨基、羰基、羥基或羧基基團(tuán)，優(yōu)選至少兩個(gè)功能化學(xué)基團(tuán)，而更優(yōu)選至少三個(gè)功能化學(xué)基團(tuán)。候選物質(zhì)可包含被一種或更多上述確定的功能基團(tuán)所取代的環(huán)碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香或聚芳香結(jié)構(gòu)。候選物質(zhì)也可是生物分子例如肽，糖，脂肪酸，固醇，類(lèi)異戊二烯，嘌呤，嘧啶，上述物質(zhì)的衍生物或結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，或者其組合，以及類(lèi)似物質(zhì)。試劑是核酸的情形中，試劑典型地是DNA 或RNA分子，雖然在此所定義的修飾后的核酸也被涉及。
候選物質(zhì)從多種來(lái)源包括合成或天然化合物的庫(kù)得到。例如，對(duì)于多種有機(jī)化合物和生物分子的隨機(jī)和定向合成，有許多方式可用，包括隨機(jī)寡核苷酸的表達(dá)、合成性的有機(jī)組合庫(kù)、隨機(jī)肽段的噬菌體展示庫(kù)和類(lèi)似方式。替代性地，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物抽提物形式的天然化合物的庫(kù)唾手可得或易于產(chǎn)生。此外，天然和合成性產(chǎn)生的庫(kù)和化合物能通過(guò)傳統(tǒng)化學(xué)、物理和生化方式被修飾。進(jìn)一步地，已知的(藥理學(xué)上)試劑可進(jìn)行定向或隨機(jī)化學(xué)修飾例如?；瑹?，酯化，amidification,等，以產(chǎn)生試劑的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。
多種其它試劑也能被包括在混合物中。這些包括試劑例如鹽，緩沖劑，中性蛋白質(zhì)(例如白蛋白)，去污劑，等，其可被用于促進(jìn)最佳的蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)一核酸結(jié)合。這樣的試劑也可減少反應(yīng)成分的非專(zhuān)一性的或背景性的相互作用。其它改善分析效率的試劑如蛋白酶，抑制劑，核酸酶抑制劑，抗微生物劑和類(lèi)似物也可被應(yīng)用。
前述分析材料的混合物在由此確定的條件下培育，但對(duì)于候選物質(zhì)存在的情形中，F(xiàn)GE多肽特異性地與細(xì)胞結(jié)合靶、其部分或其類(lèi)似物結(jié)合。組分加入的順序，培育溫度， 培育時(shí)間和分析的其它參數(shù)可容易地確定。這類(lèi)實(shí)驗(yàn)只包括分析參數(shù)的最優(yōu)化，而不涉及分析的基本組成。培育溫度典型地是在4°C和40°C之間。培育時(shí)間優(yōu)選最小化以促進(jìn)快速、 高產(chǎn)出的篩選，而典型的是在O.1和10小時(shí)之間。
培育之后，F(xiàn)GE多肽與一種或更多結(jié)合靶的專(zhuān)一性結(jié)合的存在與否通過(guò)使用者可用的任何方便的方法而探測(cè)。對(duì)于非細(xì)胞結(jié)合類(lèi)型分析，分離步驟常被用于從未結(jié)合的組分中分離結(jié)合的組分。分離步驟可以多種方式完成。方便的是，組分中的至少一種在固相基質(zhì)上被固定，未結(jié)合組分可容易地從其中分離。固相基質(zhì)可由多種材料制成多種形式，例如微量滴定平板，微珠，計(jì)量棒(dipstick)，樹(shù)脂顆粒，等。優(yōu)選基質(zhì)被選擇成最大的信噪比，主要是最小化背景結(jié)合，以及使分離程序和成本簡(jiǎn)化。
分離可被多種因素影響，例如從庫(kù)中除去珠子或計(jì)量棒，清空或稀釋庫(kù)如微量滴定平板孔，以清洗溶液或溶劑清洗珠子，顆粒，層析柱或過(guò)濾器。分離步驟優(yōu)選包括多次漂洗或清洗。例如，當(dāng)固相基質(zhì)是微量滴定平板時(shí)，孔可典型地被包括培育混合物的那些不參與特異性結(jié)合的組分的清洗溶液清洗數(shù)次，所述組分如鹽，緩沖劑，去污劑，非專(zhuān)一性蛋白質(zhì)等。在固相基質(zhì)是磁珠的情形中，珠子可用清洗溶液清洗一次或更多，并用磁體而分罔出。
探測(cè)可以任何方便的方式被影響，以進(jìn)行基于細(xì)胞的分析例如雙雜交或三雜交篩選。與靶分子相互作用的FGE多肽的報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄分析所得到的轉(zhuǎn)錄物典型地編碼直接或間接可測(cè)的產(chǎn)物，例如半乳糖苷酶活性，熒光素酶活性，和類(lèi)似物。對(duì)于非細(xì)胞結(jié)合分析，組分的一種通常包含或被偶連到可探測(cè)的標(biāo)記。多種標(biāo)記都能用，例如那些提供直接探測(cè)的類(lèi)型(例如放射性，發(fā)光，視覺(jué)或電子密度等)，或提供間接探測(cè)的類(lèi)型(例如，表位標(biāo)簽如FLAG表位、酶標(biāo)簽如辣根過(guò)氧化物酶等)。標(biāo)記可被固著于FGE結(jié)合伴侶，或整合進(jìn)結(jié)合伴侶的結(jié)構(gòu)中。
多種方法可被用于探測(cè)標(biāo)記，這取決于標(biāo)記的天性和其它的分析組分。例如，當(dāng)固著到固相基質(zhì)時(shí)或從固相基質(zhì)分離之后，標(biāo)記可被探測(cè)。標(biāo)記可通過(guò)視覺(jué)或電子密度，放射性輻射，非放射性能量轉(zhuǎn)移等直接探測(cè)，或以抗體綴合物、鏈霉抗生物素-生物素綴合物等間接探測(cè)。探測(cè)標(biāo)記的方法在本領(lǐng)域中眾所周知。
本發(fā)明提供FGE專(zhuān)一`結(jié)合試劑，鑒別和生產(chǎn)這類(lèi)試劑的方法，及它們?cè)谠\斷、治療和藥物開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用。例如，F(xiàn)GE專(zhuān)一性藥理試劑在多種診斷和治療性應(yīng)用中有用，尤其是在疾病或疾病預(yù)后與改變的FGE結(jié)合特征相關(guān)的情形例如多種硫酸酯酶缺乏癥中。新的 FGE專(zhuān)一結(jié)合試劑包括FGE專(zhuān)一抗體，細(xì)胞表面受體，被例如雙雜交篩選的分析法所鑒別的其它天然細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外結(jié)合試劑，及被對(duì)化學(xué)庫(kù)的篩選所鑒別的非天然細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外結(jié)合試劑，和類(lèi)似物。
一般而言，F(xiàn)GE結(jié)合到特異分子的專(zhuān)一性通過(guò)結(jié)合平衡常數(shù)被測(cè)定。能選擇性結(jié)合FGE多肽的靶優(yōu)選具有至少約IO7M4的結(jié)合常數(shù)，更優(yōu)選至少約IO8M'而最優(yōu)選至少約 IO9M'多種基于細(xì)胞的和非細(xì)胞的分析可被用于證明FGE專(zhuān)一結(jié)合。基于細(xì)胞的分析包括單、雙和三雜交篩選，其中FGE介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄得到抑制或增加等的分析。非細(xì)胞分析包括FGE 蛋白結(jié)合分析、免疫分析等。其它對(duì)篩選結(jié)合FGE多肽的試劑有用的分析包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)和電泳遷移改變分析(EMSA)。
根據(jù)本方面的另一方面，鑒別在調(diào)節(jié)本發(fā)明的分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性中有用的試劑的方法被提供。方法包括(a)將具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的分子與候選物質(zhì)相接觸，(b)測(cè)量該分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性，和(c)將測(cè)得的分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性與對(duì)照比較以確定是否候選物質(zhì)調(diào)節(jié)分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性，其中分子是本發(fā)明的FGE核酸分子或其表達(dá)產(chǎn)物。“接觸”指具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的分子與候選物質(zhì)的直接和間接的接觸?！伴g接”接觸表示候選物質(zhì)通過(guò)第三者試劑(例如信使分子，受體等)對(duì)分子的匕-甲酰甘氨酸生成活性施加了其影響。在一定實(shí)施方案中，對(duì)照是在缺乏候選物質(zhì)時(shí)測(cè)得的分子Ca-甲酰甘氨酸生成活性。分析方法和候選物質(zhì)如前述有關(guān)FGE的實(shí)施方案中所述。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，診斷以核酸分子、其表達(dá)產(chǎn)物或其表達(dá)產(chǎn)物片段的異常表達(dá)為特征的疾病的方法被提供。方法包括將從受試者中分離的生物樣本與專(zhuān)一結(jié)合到核酸分子、其表達(dá)產(chǎn)物或其表達(dá)產(chǎn)物片段的試劑接觸，并測(cè)定作為疾病判定依據(jù)的試劑和核酸分子或表達(dá)產(chǎn)物之間的相互作用，其中核酸分子是根據(jù)本發(fā)明的FGE分子。疾病是多種硫酸酯酶缺乏癥。導(dǎo)致FGE分子異常表達(dá)的FGE基因中的突變引起下面的SEQ ID N0:2上的氨基酸改變MetlArg; MetlVal; Leu20Phe; Ser 155Pro; Alal77Pro; Cys218Tyr; Arg224Trp ;Asn259IIe;Pro266Leu;Ala279Val;Arg327Stop;Cys336Arg;Arg345Cys;Ala348Pro;Arg34 9Gln; Arg349Trp; Arg349Trp; Ser359Stop;或其組合。
在分子是核酸分子的情形中，這類(lèi)測(cè)定能通過(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)的核酸測(cè)定分析進(jìn)行，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或在本文中作為例子的以標(biāo)記性雜交探針進(jìn)行的分析。在分子是核酸分子表達(dá)產(chǎn)物或核酸分子表達(dá)產(chǎn)物片段的情形中，這類(lèi)測(cè)定能通過(guò)應(yīng)用例如結(jié)合到任何多肽表達(dá)產(chǎn)物的抗體的任何標(biāo)準(zhǔn)的免疫分析而進(jìn)行。
“異常表達(dá)”指FGE分子(核酸和/或多肽)相對(duì)于對(duì)照(即，相同分子在健康或 “正?！笔茉囌咧械谋磉_(dá))的減少的表達(dá)(表達(dá)不足)或增加的表達(dá)(過(guò)表達(dá))。在本文中所用的“健康受試者”，指根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有出現(xiàn)多種硫酸酯酶缺乏癥或具有發(fā)展多種硫酸酯酶缺乏癥的風(fēng)險(xiǎn)的受試者。健康受試者也沒(méi)有另外顯現(xiàn)出病癥。換句話(huà)說(shuō)，如果被醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)人員檢查，這類(lèi)受試者將被表征 為健康和不帶多種硫酸酯酶缺乏癥的癥狀。這些包括異常染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良和粘多糖病的特征，例如在幾種組織中的酸性粘多糖的量增加，輕微‘脂肪軟骨營(yíng)養(yǎng)不良’，快速神經(jīng)性衰退，尿中的腦硫脂和粘多糖的過(guò)量存在，增加的腦脊液蛋白和外周神經(jīng)中的髓磷脂的異染性退化。
本發(fā)明也提供新的試劑盒，其將被用于測(cè)量本發(fā)明的核酸和本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物的水平。
在某一實(shí)施方案中，試劑盒包含包裝，該包裝包含下列物質(zhì)選擇性結(jié)合任何前述 FGE的分離的核酸或其表達(dá)產(chǎn)物的試劑，及用于與所述試劑和任何前述FGE的分離的核酸或其表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合的測(cè)得值進(jìn)行比較的對(duì)照。在某些實(shí)施方案中，對(duì)照是用于與測(cè)得值比較的預(yù)先測(cè)定值。在一定實(shí)施方案中，對(duì)照包含任何前述FGE的分離的核酸的表達(dá)產(chǎn)物的表位。在某一實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包含選擇性結(jié)合選自下列的多肽的第二試劑艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶 E，芳基硫酸酯酶 F，芳基硫酸酯酶 G，HSulf-1，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4，HSulf-5，和 HSulf-6,或其肽段，和用于與所述第二試劑和所述多肽或其肽段的結(jié)合的測(cè)得值進(jìn)行比較的對(duì)照。
在核酸探測(cè)的情形中，用于擴(kuò)增本發(fā)明的核酸分子的引物對(duì)可被包括進(jìn)去。優(yōu)選的試劑盒將包括對(duì)照，例如已知量的核酸探針、表位(例如艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A， 芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和 HSulf-6，表達(dá)產(chǎn)物)或抗表位的抗體，以及指南或其它復(fù)印材料。在一定的實(shí)施方案中，復(fù)印材料能基于分析結(jié)果而表征發(fā)展硫酸酯酶缺乏狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)。試劑可按預(yù)先測(cè)定的量被包在容器中和/或被涂在小孔上，而試劑盒可包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，例如標(biāo)記好的免疫試劑(如標(biāo)記好的抗-1gG抗體)和類(lèi)似物。一種試劑盒是包好的用FGE蛋白涂層的聚苯乙烯微量滴定平板和含有標(biāo)記好的抗人 IgG抗體的容器。平板的小孔與例如生物液體接觸，清洗，然后與抗-1gG抗體接觸。之后探測(cè)標(biāo)記。體現(xiàn)本發(fā)明特征的試劑盒，通常以數(shù)字11指定，在圖25中顯示。試劑盒11包含下列主要元件包裝15，本發(fā)明的試劑17，對(duì)照試劑19和指南21。包裝15是用于盛含有本發(fā)明的試劑17的一個(gè)小瓶(或多個(gè)小瓶)，含有對(duì)照試劑19的一個(gè)小瓶(或多個(gè)小瓶)和指南21的類(lèi)似盒子的結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于修飾包裝15以適合個(gè)體的需要。
本發(fā)明也包含在受試者中治療多種硫酸酯酶缺乏癥的方法。方法包括對(duì)有這類(lèi)治療需要的受試者施用調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的試劑，用量為在受試者中有效增加 Ca-甲酰甘氨酸生成活性的量。在某些實(shí)施方案中，方法進(jìn)一步包含一定試劑的共施用，所述試劑選自編碼下列蛋白的核酸分子艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf -1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和HSulf-6 ;核酸分子的表達(dá)產(chǎn)物，和/或核酸分子的表達(dá)產(chǎn)物的片段。
在本文中所用的“調(diào)節(jié)核酸或多肽的表達(dá)的試劑”在本領(lǐng)域中已知，指有義和反義核酸，顯性失活核酸，多肽的抗體和類(lèi)似物。調(diào)節(jié)分子表達(dá)(和如本文中所述的，調(diào)節(jié)其活性)的任何試劑根據(jù)本發(fā)明有用。在一定實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的試劑是本發(fā)明的分離的核酸分子(例如SEQ ID NO. 3的核酸)。在重要的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的試劑是本發(fā)明的肽(例如SEQ ID NO. 2的肽)。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性的試劑是本發(fā)明的有義核酸。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，在受試者中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括對(duì)受試者施用本發(fā)明的分離的核酸分子和/或其表達(dá)產(chǎn)物，用量為在受試者中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，增加細(xì)胞中的Ca-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。 方法包括將細(xì)胞與本發(fā)明的分離的核酸分子(例如SEQ ID NO.1的核酸)，或其表達(dá)產(chǎn)物 (例如SEQ ID NO. 2的肽)接觸，用量為在細(xì)胞中有效增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的量。 在重要的實(shí)施方案中，方法包括激活內(nèi)源性的FGE基因以增加細(xì)胞中的Ca-甲酰甘氨酸生成活性。
在任何的前述實(shí)施方案中，核酸可被操作性地偶聯(lián)到指導(dǎo)真核細(xì)胞例如HT-1080 細(xì)胞內(nèi)的核酸分子表達(dá)的基因表達(dá)序列?！盎虮磉_(dá)序列”是任何調(diào)節(jié)性的核苷酸序列，例如啟動(dòng)子序列或啟動(dòng)子一增強(qiáng)子組合，其促進(jìn)它所可操作性地連接的核酸的有效轉(zhuǎn)錄和翻譯?；虮磉_(dá)序列可以是，例如，哺乳動(dòng)物或病毒的啟動(dòng)子如組成型或可誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子。 組成型的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子包括但不限于下列基因的啟動(dòng)子次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶 (HPTR),腺苷脫氨酶，丙酮酸激酶，a-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和其它組成型啟動(dòng)子?？勺鳛榉独脑谡婧思?xì)胞中組成性地發(fā)揮功能的病毒啟動(dòng)子包括，例如，來(lái)自猿猴病毒，乳頭狀瘤病毒，腺病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)，勞斯肉瘤病毒，細(xì)胞巨化病毒，莫洛尼氏白血病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)和其它逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動(dòng)子，和單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子。其它組成型啟動(dòng)子為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所知。作為本發(fā)明的基因表達(dá)序列而有用的啟動(dòng)子也包括可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子?？烧T導(dǎo)的啟動(dòng)子在誘導(dǎo)劑存在時(shí)被活化。例如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子在一定的金屬離子存在時(shí)被激活而增加轉(zhuǎn)錄和翻譯。其它可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所知。
一般而言，基因表達(dá)序列將包括(如果必要)分別涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯起始的5’非轉(zhuǎn)錄和5’非翻譯序列，例如TATA盒，加帽序列，CAAT序列和類(lèi)似物。尤其是，這類(lèi)5’非轉(zhuǎn)錄序列將包括啟動(dòng)子區(qū)域，所述啟動(dòng)子區(qū)域包括用于對(duì)可操作性連接的核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制的啟動(dòng)子序列。基因表達(dá)序列可選性地包括所期望的增強(qiáng)子序列或上游激活子序列。
優(yōu)選任何本發(fā)明的FGE核酸分子連接到允許核酸分子在特定細(xì)胞系的細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)的基因表達(dá)序列。允許核酸分子在細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)的序列，是在這類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型中選擇性地有活性從而引起核酸分子在這些細(xì)胞中表達(dá)的類(lèi)型。例如，突觸蛋白-1啟動(dòng)子能被用于在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)任何前述的本發(fā)明的核酸分子；而例如von Willebrand因子基因啟動(dòng)子能被用于在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)核酸分子。本領(lǐng)域中一般技術(shù)人員將能易于鑒別能在本發(fā)明的任何優(yōu)選細(xì)胞中表達(dá)核酸分子的替代性的啟動(dòng)子。
當(dāng)它們以將核酸編碼序列(例如，在FGE的情形中，SEQ ID NO. 3)的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯置于基因表達(dá)序列的影響或控制下這樣的方式而被共價(jià)連接時(shí)，核酸序列和基因表達(dá)序列被表述為“可操作性地連接”。如果期望核酸序列被翻譯成為功能性蛋白，并且如果在 5’基因表達(dá)序列中的啟動(dòng)子的誘導(dǎo)導(dǎo)致核酸序列的轉(zhuǎn)錄，且如果在兩個(gè)DNA序列之間的連接的本性不會(huì)(2)導(dǎo)致移碼突變的引入，(2)干擾啟動(dòng)子區(qū)域指導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄的能力，和 /或(3)干擾對(duì)應(yīng)的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物翻譯成為蛋白質(zhì)的能力時(shí)，兩個(gè)DNA序列被表述成可操作性地連接。因此，如果基因表達(dá)序列能影響核酸序列的轉(zhuǎn)錄以至于得到的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可被翻譯成為所期望的蛋白質(zhì)或多肽，則基因表達(dá)序列將被認(rèn)為可操作性地連接到核酸序列。
本發(fā)明的分子能單獨(dú)的或與載體(也見(jiàn)對(duì)于載體的更早的討論)一起被運(yùn)送到本發(fā)明優(yōu)選細(xì)胞類(lèi)型。按其最廣泛的含義(且與本文中其它部分對(duì)表達(dá)和靶向載體的描述一致)，“載體”是能促進(jìn)(1)分子到靶細(xì)胞的運(yùn)送，和/或⑵分子被靶細(xì)胞的吸取，的任何載體。優(yōu)選運(yùn)送載體以有所減少的降解運(yùn)輸分子到靶細(xì)胞中，所述有所減少的降解相對(duì)于載體缺乏時(shí)所產(chǎn)生的降解的程度而言。可選地，“靶向配體”能被附著于載體以選擇性地將載體運(yùn)送到其表面表達(dá)靶向配體的相關(guān)受體的細(xì)胞。以這種方式，載體(含有核酸或蛋白質(zhì)) 能被選擇性地運(yùn)送到神經(jīng)細(xì)胞。祀向的方法包括綴合，例如那些在Priest的U. S. Patent 5，391，723中所述的。另一眾所周知的靶向載體的實(shí)例是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體從Gibco BRL可商業(yè)性地獲得。生產(chǎn)靶向脂質(zhì)體的多種方法被發(fā)表。
一般而言，在本發(fā)明中有用的載體包括但不限于質(zhì)粒，噬菌粒，病毒，源于病毒或細(xì)菌來(lái)源的其它載體，所述其它載體已通過(guò)本發(fā)明核酸序列和能被附著到本發(fā)明的核酸序列的另外的核酸片段(例如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子)的插入或整合而被操作。病毒載體是載體的優(yōu)選類(lèi)型，包括但不限于來(lái)自下列病毒的核酸序列腺病毒；腺伴隨病毒；逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如鼠莫洛尼白血病毒；鼠哈維肉瘤病毒；鼠乳腺腫瘤病毒；勞斯肉瘤病毒；SV40-型病毒； 多瘤病毒；EB病毒；乳頭狀瘤病毒；皰疫病毒；牛痘病毒；脊髓灰質(zhì)炎病毒；和RNA病毒例如逆轉(zhuǎn)錄病毒。也能容易地采用沒(méi)有指出但在本領(lǐng)域中已知的其它載體。
對(duì)某些應(yīng)用特別優(yōu)選的病毒是腺伴隨病毒，一種雙鏈DNA病毒。腺伴隨病毒能感染廣泛的細(xì)胞類(lèi)型和物種，且能被工程化為復(fù)制缺陷型。它進(jìn)一步地具有優(yōu)點(diǎn)例如熱和脂溶劑穩(wěn)定性、在多種株系細(xì)胞包括造血細(xì)胞中的高轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率，和缺乏超感染抑制因此而允許多重系列的轉(zhuǎn)導(dǎo)。經(jīng)報(bào)道，腺伴隨病毒能以位點(diǎn)特異的方式整合進(jìn)人細(xì)胞DNA，從而將插入性基因突變的可能性和插入基因的表達(dá)的可變性最小化。此外，野生型腺伴隨病毒感染已在組織培養(yǎng)物中于缺乏選擇壓力的條件下存在超過(guò)100代，意味著腺伴隨病毒基因組整合是相對(duì)穩(wěn)定的事件。腺伴隨病毒也能以染色體外方式發(fā)揮功能。
一般而言，其它優(yōu)選的病毒載體基于非細(xì)胞病變性真核病毒，在這些病毒中非必需基因已被目的基因所替代。非細(xì)胞病變性病毒包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，其生命周期包括基因組病毒RNA到DNA的逆轉(zhuǎn)錄及隨后的前病毒整合到宿主細(xì)胞DNA中。腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒已被許可用于人基因治療的試驗(yàn)。一般而言，逆轉(zhuǎn)錄病毒是復(fù)制缺陷型(即，能指導(dǎo)所需蛋白的合成，但不能制造出感染性的顆粒)。這類(lèi)基因改變的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體具有對(duì)基因在體內(nèi)的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)的一般性用途。產(chǎn)生復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒的標(biāo)準(zhǔn)流程(包括步驟外源性遺傳物質(zhì)整合進(jìn)質(zhì)粒，質(zhì)粒對(duì)包裝細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染，重組性逆轉(zhuǎn)錄病毒通過(guò)包裝細(xì)胞系的產(chǎn)生，從組織培 養(yǎng)基中收集病毒顆粒和病毒顆粒對(duì)靶細(xì)胞的感染)在Kriegler，M.，“Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, , W. H. Freeman C. 0. , New York (1990)和 Murry, E. J. EcL “Methods in Molecular Biology, ”卷7，Humana Press Inc. , Cliffton, New Jersey(1991)中被提供。
另一優(yōu)選的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是源自鼠莫洛尼白血病毒的載體，如在Nabel，E. G.等，Science，1990，249:1285-1288中所述的。這些載體據(jù)報(bào)道對(duì)基因運(yùn)送到動(dòng)脈壁的所有三層(包括中間層)都有效。其它優(yōu)選載體在Flugelman等，Circulation,1992,85:1110-1117中公開(kāi)。另外的對(duì)運(yùn)送本發(fā)明的分子有用的載體在U. S. Patent No. 5，674，722 中被 Mulligan 等描述。
除前述載體外，其它傳送方法可被用于傳送本發(fā)明的分子到細(xì)胞例如神經(jīng)細(xì)胞， 肝，成纖維細(xì)胞，和/或血管內(nèi)皮細(xì)胞，并促進(jìn)在那里的吸收。
本發(fā)明的優(yōu)選的這類(lèi)運(yùn)送方法是膠態(tài)分散體系統(tǒng)。膠態(tài)分散體系統(tǒng)包括基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括水包油乳液，微囊，混合微囊，和脂質(zhì)體。本發(fā)明優(yōu)選的膠態(tài)系統(tǒng)是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是人造膜容器，其作為體內(nèi)或體外的運(yùn)送載體而有用。已有顯示，大小范圍在O. 2-4. Oym的單層容器(LUV)能包裹進(jìn)大的大分子。RNA，DNA和完整病毒粒子能被封裝在含水內(nèi)部，并以生物活性形式運(yùn)送到細(xì)胞中(Fraley等，Trends Biochem. Sc1.，1981,6:77)。為了脂質(zhì)體是有效的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，一種或更多的下列特征應(yīng)具備(I) 目的基因高效被封裝，而保持生活活性；(2)相對(duì)于非靶細(xì)胞的與靶細(xì)胞的優(yōu)選和牢固的結(jié)合；(3)囊泡的水內(nèi)容物到靶細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的高效運(yùn)送；和(4)遺傳信息的準(zhǔn)確和有效表達(dá)。
脂質(zhì)體可通過(guò)脂質(zhì)體到特異配體例如單克隆抗體，糖，糖脂，或蛋白質(zhì)的偶聯(lián)， 而靶向于特定組織，例如心肌或血管細(xì)胞壁。可對(duì)靶向脂質(zhì)體于血管壁有用的配體包括但不限于，仙臺(tái)病毒的病毒衣殼蛋白。此外，載體可偶聯(lián)到核靶向性肽上，其將定向核酸到宿主細(xì)胞核。
脂質(zhì)體可從Gibco BRL商業(yè)性地獲得，例如由陽(yáng)離子脂質(zhì)如N-[l-(2，3雙油氧基)_丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)和二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)形成的 LIP0FECTIN 和LIP0FECTACE 。生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法在本領(lǐng)域中眾所周知，也在許多出版物中被描述。脂質(zhì)體也已被 Gregoriadis, G.在 Trends in Biotechnology,卷 3，235-241 頁(yè) (1985)中所回顧。用于大分子包括核酸的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送的新的脂質(zhì)體也在PCT國(guó)際申請(qǐng)PCT/ US96/07572 (公開(kāi)號(hào) W096/40060,名稱(chēng)為“ Int racellular Delivery of Macromolecules”) 中被描述。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，優(yōu)選的載體是適合植入哺乳動(dòng)物受體的生物相容性的微顆?；蛑踩胛铩Ｗ鳛榉独母鶕?jù)此方法而有用的生物侵蝕性植入物在PCT國(guó)際申請(qǐng)PCT/ US/03307(公開(kāi)號(hào) W095/24929,名稱(chēng)為“Polymeric Gene Delivery System”，其要求 1994 年3月15日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)213，668的優(yōu)先權(quán))中被描述。PCT/US/0307描述了用于包含(受適當(dāng)?shù)膯?dòng)子調(diào)控的)外源性基因的生物相容性的聚合性基質(zhì)，優(yōu)選生物降解性的聚合性基質(zhì)。聚合性基質(zhì)被用于實(shí)現(xiàn)外源性基因在患者中的持續(xù)性釋放。根據(jù)本發(fā)明，在此所述的核酸在PCT/US/03307中所公開(kāi)的生物相容性?xún)?yōu)選生物降解性的聚合性基質(zhì)中被封裝或分散。聚合性基質(zhì)優(yōu)選微顆粒形式例如微球體(其中核酸被分散到整個(gè)固體聚合性基質(zhì)中)或微囊(其中核酸被儲(chǔ)存在聚合性殼的核心中)。包含本發(fā)明的核酸的聚合性基質(zhì)的其它形式包括膜，涂層，膠，植入物和支架。聚合性基質(zhì)裝置的大小和組成被選作引起基質(zhì)裝置被植入的組織中的良好的釋放動(dòng)力學(xué)。進(jìn)一步設(shè)計(jì)的聚合性基質(zhì)的大小根據(jù)將被應(yīng)用的運(yùn)送方法而選擇，所述運(yùn)送方法典型地是組織注射或懸浮液通過(guò)霧化施用到鼻部和/或肺部區(qū)域。聚合性基質(zhì)組合物能被選成同時(shí)具有良好的降解速率，及由生物粘附性物質(zhì)形成，以在設(shè)計(jì)物被施用到血管表面時(shí)進(jìn)一步增加轉(zhuǎn)運(yùn)的有效性。基質(zhì)組合物也能被選成不降解，但更適合通過(guò)持續(xù)相當(dāng)一段時(shí)間的擴(kuò)散而釋放。
非生物降解性和生物降解性的聚合性基質(zhì)都能被用作將本發(fā)明的核酸運(yùn)送到受試者。優(yōu)選生物降解性基質(zhì)。這類(lèi)聚合物可以是自然或合成性的聚合物。優(yōu)選合成性聚合物。根據(jù)釋放所需要的時(shí)間長(zhǎng)度而選擇聚合物，一般是幾個(gè)小時(shí)到一年或更長(zhǎng)時(shí)間的級(jí)別。 典型地，范圍從幾個(gè)小時(shí)到三至十二個(gè)月的時(shí)間長(zhǎng)度的釋放最合意。聚合物可選性地是能吸收高到其重量的約90%的水的水凝膠的形式，而進(jìn)一步地，可選性地與多價(jià)離子或其它聚合物交聯(lián)。
一般而言，本發(fā)明的核酸應(yīng)用生物侵蝕性植入物以擴(kuò)散方式而被運(yùn)送，或更優(yōu)選地，通過(guò)聚合性基質(zhì)的降解。作為范例的能被用于形成生物降解性運(yùn)送系統(tǒng)的合成性聚合物包括聚酰胺，聚碳酸酯，聚亞烷基，聚亞烷基二醇，聚環(huán)氧烷，聚亞烷基對(duì)苯二酸酯， 聚乙烯醇，聚乙烯醚，聚乙烯酯，聚-乙烯鹵化物，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙交酯，聚硅氧烷，聚氨基甲酸乙酯和其共聚物，烷基纖維素，羥基烷基纖維素，纖維素醚，纖維素酯， 硝基纖維素，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，甲基纖維素，乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羥丁基甲基纖維素，醋酸纖維素，丙酸纖維素，纖維素醋酸丁酸酯，纖維素醋酸鄰苯二甲酸酯，羧乙基纖維素，三醋酸纖維素，纖維素硫酸鈉鹽，聚(甲基異丁烯酸酯)，聚(乙基異丁烯酸酯)，聚(丁基異丁烯酸酯)，聚(異丁基異丁烯酸酯)，聚(己基異丁烯酸酯)，聚(異癸基異丁烯酸酯)，聚(十二烷基異丁烯酸酯)，聚(苯基異丁烯酸酯)，聚 (甲基丙烯酸酯)，聚(異丙基丙烯酸酯)，聚(異丁基丙烯酸酯)，聚(十八烷基丙烯酸酯)，聚乙烯，聚丙烯，聚(乙二醇)，聚(環(huán)氧乙烷)，聚(對(duì)苯二甲酸乙二酯)，聚(乙烯醇)，聚乙烯醋酸，聚氯乙烯，聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮.
非生物降解性聚合物的實(shí)例包括亞乙基乙烯醋酸，聚(甲)丙烯酸，聚酰胺，其共聚物和混合物。
生物降解性聚合物的實(shí)例包括合成性聚合物例如乳酸和乙二酸的聚合物，聚酸酐，聚(原)酸酯，聚氨基甲酸乙酯，聚(丁酸)，聚(戊酸)，聚(丙交酯-共己內(nèi)酯)，天然聚合物例如藻酸和其它多糖包括葡聚糖和纖維素，膠原，其化學(xué)衍生物(化學(xué)基團(tuán)例如，烷基， 亞烷基，羥化，氧化的取代和增加，和其它由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)進(jìn)行的修飾)，白蛋白和其它親水蛋白質(zhì)，玉米醇溶蛋白和其它醇溶谷蛋白及疏水蛋白質(zhì)，其共聚物和混合物。一般而言，這些物質(zhì)或者通過(guò)酶水解或者在體內(nèi)暴露于水時(shí)通過(guò)表面或整體侵蝕而降解。
特別受關(guān)注的生物粘附性聚合物包括H. S. Sawhney, C. P. Pathak和J. A. Hubell在 Macromolecules, 1993，26，581-587中所述的生物侵蝕性水凝膠，其教導(dǎo)在此被整合，聚透明質(zhì)酸，酪蛋白，明膠，谷膠酪蛋白，聚酸酐，聚丙烯酸，藻酸，脫乙酰殼多糖，聚(甲基異丁烯酸酯)，聚(乙基異丁烯酸酯)，聚(丁基異丁烯酸酯)，聚(異丁基異丁烯酸酯)，聚(己基異丁烯酸酯)，聚(異癸基異丁烯酸酯)，聚(十二烷基異丁烯酸酯)，聚(苯基異丁烯酸酯)，聚 (甲基丙烯酸酯)，聚(異丙基丙烯酸酯)，聚(異丁基丙烯酸酯)，和聚(十八烷基丙烯酸酯)。 因此，本發(fā)明提供用作藥物的本發(fā)明的上述分子的組合物，制備此藥物的方法和在體內(nèi)用于持續(xù)釋放藥物的方法。
壓縮試劑也能與本發(fā)明的載體結(jié)合應(yīng)用。在本文中所用的“壓縮試劑”指試劑例如組蛋白，它中和核酸上的負(fù)電荷從而允許核酸壓縮成細(xì)顆粒。核酸的壓縮促進(jìn)了核酸被靶細(xì)胞的吸收。壓縮試劑能單獨(dú)使用，即以被細(xì)胞更有效地吸收的形式運(yùn)送分離的本發(fā)明的核酸或，更優(yōu)選地，與一種或更多上述載體組合。
其它作為范例的能被用于促進(jìn)靶細(xì)胞對(duì)本發(fā)明的核酸的吸收的組合物包括磷酸鈣及細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、微注射組合物和電穿孔的其它化學(xué)調(diào)節(jié)物。本發(fā)明包含在細(xì)胞中增加硫酸酯酶活性的方法。這類(lèi)方法包括以有效地在細(xì)胞中增加硫酸酯酶活性的量將分離的本發(fā)明的核酸分子(例如如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所要求的分離的核酸分子，具有選自 SEQ ID NO: 1，3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的FGE核酸分子)或其表達(dá)產(chǎn)物(例如如權(quán)利要求11-15，19，20 中所要求的多肽或具有選自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的序列的肽)與表達(dá)硫酸酯酶的細(xì)胞接觸。在本文中所用的“增加”硫酸酯酶活性，指增加的對(duì)硫酸酯酶的特異性底物的親合性和/或?qū)ζ涞霓D(zhuǎn)化，典型地導(dǎo)致硫酸酯酶分子上的FGly的形成的增加。在某一實(shí)施方案中，細(xì)胞以比野生型細(xì)胞更高的水平表達(dá)硫酸酯酶?！霸诩?xì)胞中增加硫酸酯酶活性”也指增加細(xì)胞所分泌的硫酸酯酶的活性。細(xì)胞可表達(dá)內(nèi)源性和/或外源性的硫酸酯酶。與FGE分子的所述接觸也指激活細(xì)胞的內(nèi)源性FGE基因。在重要的實(shí)施方案中，內(nèi)源性硫酸酯酶被活化。在一定實(shí)施方案中，硫酸酯酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-l，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4, HSulf-5,和/或HSulf-6。在一定的實(shí)施方案中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)本方面的另一方面，藥物組合物被提供。組合物以藥學(xué)上有效治療硫酸酯酶缺乏癥的量包含細(xì)胞產(chǎn)生的硫酸酯酶，也包含藥學(xué)上可接受的載體，其中所述細(xì)胞已與包含分離的本發(fā)明的核酸分子(例如如權(quán)利要求1-8所要求的分離的核酸分子或具有選自SEQ ID NO:1, 3，4，45，47, 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87 的序列的核酸分子)或其表達(dá)產(chǎn)物(例如選自SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，7 6，和78的肽)的試劑接觸。在重要的實(shí)施方案中，硫酸酯酶以高于正常/對(duì)照細(xì)胞的水平表達(dá)。本發(fā)明也包含產(chǎn)生硫酸酯酶的細(xì)胞，其中細(xì)胞所產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的比率增加。細(xì)胞包含(i)相對(duì)于對(duì)照具有增加的活性的硫酸酯酶，和(ii)相對(duì)于對(duì)照具有增加的活性的甲酰甘氨酸生成酶，其中相對(duì)于甲酰甘氨酸生成酶缺乏的細(xì)胞所產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的比率，細(xì)胞所產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的比率增加至少5%。在本領(lǐng)域中已知,硫酸酯酶的過(guò)表達(dá)能減少內(nèi)源性硫酸酯酶的活性(Anson等，Biochem. J.，1993，294:657-662)。此外，僅有重組硫酸酯酶的一部分有活性。出乎意料地，我們發(fā)現(xiàn)在具有硫酸酯酶的增加的表達(dá)/活性的細(xì)胞中，F(xiàn)GE增加的表達(dá)/活性導(dǎo)致更有活性的硫酸酯酶的產(chǎn)生。既然FGly在硫酸酯酶分子上的存在與硫酸酯酶活性相關(guān)，則“有活性的硫酸酯酶”就能通過(guò)應(yīng)用MALD1-T0F質(zhì)譜(如本文中其它部分所描述的)對(duì)FGly在硫酸酯酶細(xì)胞產(chǎn)物上的存在的測(cè)定而定量。然后對(duì)總硫酸酯酶的比率能很容易測(cè)定。本發(fā)明也提供用于硫酸酯酶缺乏癥的診斷和治療的方法。這類(lèi)疾病包括但不限于，多種硫酸酯酶缺乏癥，粘多糖病II(MPS II;Hunter綜合癥)，粘多糖病IIIA (MPSIIIA; Sanfilippo 綜合癥 A),粘多糖病 VIII(MPS VIII),粘多糖病 IVA (MPS IVA; Morquio綜合癥A)，粘多糖病VI (MPS VI; Maroteaux-Lamy綜合癥)，異常染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(MLD)，X-連鎖的隱性點(diǎn)狀軟骨發(fā)育不全1，和X-連鎖的魚(yú)鱗病(類(lèi)固醇硫酸酯酶缺乏癥)。
本發(fā)明的方法在對(duì)任何前述病癥的急性或預(yù)防性治療中都有用。在此所用的急性治療指對(duì)具有特定病癥的受試者的治療。預(yù)防性治療指對(duì)可能具有此病癥但現(xiàn)在并沒(méi)有或并未經(jīng)歷此病癥的癥狀的受試者的治療。就其最廣泛的意義而言，術(shù)語(yǔ)“治療”表示急性和預(yù)防性治療兩者。如果需要治療的受試者正經(jīng)歷病癥(或具有或正具有特定病癥)，那么治療病癥指改善、減弱或消除病癥或來(lái)自病癥的一種或更多的癥狀。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療此病癥指改善、減弱或消除與病癥相關(guān)的特異的癥狀或特異亞型的癥狀。如果需要治療的受試者是可能具有此病癥的受試者，那么對(duì)受試者治療指減小受試者產(chǎn)生此病癥的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的治療劑的施用模式和劑量將隨著被治療的病癥的特定階段、被治療的受試者的年齡和生理狀態(tài)、同時(shí)進(jìn)行的治療(如果有)的本性、施用的特定途徑和在醫(yī)學(xué)實(shí)踐者的知識(shí)和專(zhuān)業(yè)技術(shù)范圍內(nèi)的類(lèi)似因素而變化。如本文中所述的，本發(fā)明的試劑以治療任何前述硫酸酯酶缺乏癥的有效量而被施用。一般而言，有效量是能引起受試者的所期望的組織中的有益變化的任何量。有效量?jī)?yōu)選在特定病癥中足以弓I起良好表型變化例如癥狀或病癥的整體性減輕、緩和或消除的量?！愣?，有效量是藥學(xué)制劑單獨(dú)或與進(jìn)一步的藥劑一起產(chǎn)生出所期望的反應(yīng)那樣的量。這可包括只短暫減慢病癥的進(jìn)程，雖然更優(yōu)選它包括長(zhǎng)期性地阻止病癥進(jìn)程，或延緩病癥的發(fā)作，或防止病癥發(fā)生。這可通過(guò)常規(guī)方法監(jiān)測(cè)。一般地，活性化合物的劑量將從約0. 01mg/kg每天到1000mg/kg每天。期望范圍在50 u g-500mg/kg的劑量將是適合,優(yōu)選口服和每天施用一次或幾次。當(dāng)然，這類(lèi)量將取決于被治療的特定病癥，病癥的嚴(yán)重程度，患者個(gè)體的參數(shù)包括年齡、生理狀況、身材尺寸和體重，治療的持續(xù)時(shí)間，同時(shí)進(jìn)行的治療(如果有)的本性，施用的特異途徑和在醫(yī)學(xué)實(shí)踐者的知識(shí)和專(zhuān)業(yè)技術(shù)范圍內(nèi)的類(lèi)似因素。低劑量將源自施用的一定形式，例如靜脈內(nèi)施用。在應(yīng)用初始劑量時(shí)受試者中的反應(yīng)不充分的情形中，更高的劑量(或通過(guò)不同的更局部化的運(yùn)送途徑的有效更高劑量)可應(yīng)用到患者耐受力所允許的程度。每天多重劑量被預(yù)期能 實(shí)現(xiàn)化合物的合適的系統(tǒng)水平。一般地，優(yōu)選應(yīng)用最大劑量，也就是，根據(jù)合理的醫(yī)學(xué)判斷的最高安全劑量。然而將被本領(lǐng)域中一般技術(shù)人員所理解的是，患者可出于醫(yī)學(xué)原因、心理原因或事實(shí)上的其它任何原因而堅(jiān)持較低劑量或可耐受性劑量。本發(fā)明的試劑可選性地與藥學(xué)上可接受的載體組合以形成藥學(xué)制劑。在本文中所用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”表示適合對(duì)人施用的一種或更多相容性的固體或液體填充物、稀釋劑或封裝物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“載體”表示天然或合成性的有機(jī)或無(wú)機(jī)成分，活性成分與其組合以促進(jìn)應(yīng)用。藥學(xué)組合物的成分也能被與本發(fā)明的分子共混合，及彼此混合，其方式是確保沒(méi)有實(shí)質(zhì)性破壞所期望的藥學(xué)效力的相互作用存在。在某些方面，藥學(xué)制劑以有效治療疾病的量包含本發(fā)明的試劑。藥學(xué)制劑可包含合適的緩沖劑，包括鹽形式的醋酸、鹽形式的檸檬酸、鹽形式的硼酸或鹽形式的磷酸。藥學(xué)組合物可選性地，也可包含合適的防腐劑例如苯扎氯；氯代丁醇；對(duì)輕基苯甲酸酯或乙基萊硫代水楊酸鈉(thimerosal)。多種施藥途徑可用。當(dāng)然，選出的特定模式將取決于選定的特定藥物，被治療的病癥的嚴(yán)重程度和治療效力所需的劑量。本發(fā)明的方法，一般而言，可應(yīng)用醫(yī)學(xué)上可接受的任何施用模式，即產(chǎn)生活性化合物的有效水平而不引起臨床上無(wú)法接受的不利效應(yīng)的有意義的任何模式而實(shí)行。施用的這類(lèi)模式包括口服，直腸，局部，鼻，皮內(nèi)，經(jīng)皮，或非腸道途徑。術(shù)語(yǔ)“非腸道的”包括皮下，靜脈內(nèi)，intraomental，肌肉內(nèi)，或輸注。靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)途徑不是特別適合長(zhǎng)期性治療和預(yù)防。作為實(shí)例，用于對(duì)具有偏頭痛的受試者的急性治療的藥學(xué)組合物可配制成多種不同的方式和多種施用模式，包括片劑，膠囊，粉末，栓齊U，注射液和鼻噴霧劑。藥學(xué)制劑可方便地以單位劑型存在，也可通過(guò)任何制藥領(lǐng)域中眾所周知的方法制備。所有方法包括將活性試劑與載體相連的步驟，所述載體組成了一種或更多附屬成分。一般而言，組合物通過(guò)統(tǒng)一地和密切地將活性化合物與液體載體、很好地分隔的固體載體或同時(shí)二者相連而制備，然后如果需要，將產(chǎn)物定形。適合口服施用的組合物可作為離散性單位存在，例如膠囊，片劑，錠劑，每一個(gè)都包含預(yù)定量的活性化合物。其它組合物包括水性或非水性的懸浮液例如糖漿，酏劑或乳劑。適合非腸道施用的組合物方便地包含消毒過(guò)的本發(fā)明試劑的水制劑，其優(yōu)選與接受者的血液等滲。此水制劑可根據(jù)已知方法應(yīng)用合適的分散或潤(rùn)濕劑和懸浮試劑進(jìn)行配制。無(wú)菌的可注射性制劑也可是非毒性的注射用可接受的稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌的注射溶液或懸浮液，例如在1，3- 丁二醇中的溶液。可接受的可用載體和溶劑有水、Ringer’ s溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌的固定油傳統(tǒng)上被用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這一目的，任何溫和的固定油可被應(yīng)用，包括合成性的甘油單酯或雙酯。此外，脂肪酸例如油酸可在可注射的制劑中應(yīng)用。適合口服，皮下，靜脈內(nèi)，月幾肉內(nèi)等施用的配方能在Remington’ sPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. , Easton, PA 中找至丨J。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)發(fā)明，用于在細(xì)胞中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括將分離的本發(fā)明的核酸分子(例如SEQ ID NO.1的核酸)或其表達(dá)產(chǎn)物(例如SEQ ID NO. 2的肽)以在細(xì)胞中增加(。-甲酰甘氨酸生成活性的有效量與細(xì)胞接觸。在重要的實(shí)施方案中，方法包括激活`內(nèi)源性FGE基因以在細(xì)胞中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性。在某些實(shí)施方案中，接觸在允許本發(fā)明的分子進(jìn)入細(xì)胞的條件下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“允許分子進(jìn)入”細(xì)胞具有下面基于分子本性的含義。對(duì)分離的核酸，它用于描述核酸通過(guò)細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞核，在其基礎(chǔ)上“核酸轉(zhuǎn)基因”能利用細(xì)胞機(jī)制產(chǎn)生核酸所編碼的功能多肽?！昂怂徂D(zhuǎn)基因”用于描述所有的有或沒(méi)有相連載體的本發(fā)明的核酸。對(duì)于多肽，它用于描述多肽通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，及如果需要，對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)機(jī)制的利用以功能性地修飾多肽(例如修飾成活性形式)。多種技術(shù)可被用于將本發(fā)明的核酸引入細(xì)胞，其依賴(lài)于核酸是在體外還是體內(nèi)而被引入宿主。這類(lèi)技術(shù)包括核酸-CaPO4沉淀的轉(zhuǎn)染，與DEAE相連的核酸的轉(zhuǎn)染，包括目的核酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和類(lèi)似方法。對(duì)于一定的應(yīng)用，優(yōu)選將核酸靶向于特定細(xì)胞。在這類(lèi)例子中，用于將本發(fā)明的核酸運(yùn)送進(jìn)細(xì)胞的載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒；脂質(zhì)體)可以具有附著于其上的靶向分子。例如，分子例如對(duì)靶細(xì)胞上的表面膜蛋白專(zhuān)一的抗體或靶細(xì)胞上的受體的配體能被固定到核酸運(yùn)送載體上或整合在其中。例如，脂質(zhì)體被用于運(yùn)送本發(fā)明的核酸的情形中，結(jié)合到與內(nèi)吞作用相關(guān)的表面膜蛋白的蛋白質(zhì)可被整合進(jìn)用于靶向和/或促進(jìn)吸收的脂質(zhì)體的配劑。這類(lèi)蛋白質(zhì)包括對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型有親和力的衣殼蛋白或其片段，針對(duì)循環(huán)中經(jīng)歷內(nèi)化的蛋白質(zhì)的抗體，靶向細(xì)胞內(nèi)定位和增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)，和類(lèi)似物。聚合性運(yùn)送系統(tǒng)也已被成功用于運(yùn)送核酸進(jìn)入細(xì)胞，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。這類(lèi)系統(tǒng)甚至允許核酸的口服運(yùn)送。其它運(yùn)送系統(tǒng)能包括定時(shí)釋放性、延遲釋放性或持續(xù)釋放性運(yùn)送系統(tǒng)。這類(lèi)系統(tǒng)能避免本發(fā)明的試劑的重復(fù)施用，增加對(duì)受試者和醫(yī)生的方便性。多種類(lèi)型的釋放運(yùn)送系統(tǒng)可用，且為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所已知。它們包括以聚合物為基礎(chǔ)的系統(tǒng)例如聚(丙交酯-乙交酯)，共聚草酸，聚己內(nèi)酯，聚酯酰胺，聚原酸酯，聚羥基丁酸和聚酸酐。包含藥物的前述聚合物的微囊在例如U. S. Patent 5，075，109中被描述。運(yùn)送系統(tǒng)也包括非聚合物系統(tǒng)脂類(lèi)，包括固醇例如膽固醇，膽固醇酯和脂肪酸或中性脂肪例如單-二-和三-甘油酯；水凝膠釋放系統(tǒng)；SylaStic系統(tǒng)；以肽為基礎(chǔ)的系統(tǒng)；蠟涂層；應(yīng)用傳統(tǒng)粘合劑和賦形劑的壓制成的藥片；部分融合的植入物；和類(lèi)似物。具體的實(shí)例包括但不限于(a)本發(fā)明的試劑以某一形式被包含在基質(zhì)內(nèi)的侵蝕性系統(tǒng)例如U. S. PatentNos. 4，452，775，4，675，189和5，736，152中所描述的那些類(lèi)型，和(b)活性成分以受控的速率從聚合物中滲出的擴(kuò)散系統(tǒng)例如U. S. Patent Nos. 3，854，480，5，133，974和5，407，686中所述的。此外，以泵為基礎(chǔ)的硬件運(yùn)送系統(tǒng)能被應(yīng)用，其中部分適于植入。長(zhǎng)期持續(xù)釋放性植入物的應(yīng)用可以是合乎期望。在本文中所用的長(zhǎng)期釋放，表示植入物被構(gòu)建和計(jì)劃成至少30天運(yùn)送治療水平的活性成分，優(yōu)選60天。長(zhǎng)期持續(xù)釋放性植入物是本領(lǐng)域中一般技術(shù)人員眾所周知的，包括部分上述的釋放系統(tǒng)。具體的實(shí)例包括但不限于，在U. S. Patent No. 4，748，024和加拿大No. 1330939中所述的長(zhǎng)期持續(xù)釋放性植入物。

本發(fā)明也包括本發(fā)明的FGE分子之外的試劑的施用，和在某些實(shí)施方案中的共施用，所述試劑當(dāng)以有效劑量施用時(shí)可與本發(fā)明的分子合作性地、加成性地或協(xié)同性地起作用，以(i)調(diào)節(jié)Ca-甲酰甘氨酸生成活性，和(ii)治療涉及本發(fā)明分子的(。-甲酰甘氨酸生成活性的任何病癥(例如硫酸酯酶缺乏癥包括多種硫酸酯酶缺乏癥)。本發(fā)明的分子之外的試劑包括艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,或HSulf-6，(核酸和多肽，和/或其片段)，和/或其組合。在本文中所用的“共施用”指同時(shí)施用兩種或更多的本發(fā)明的化合物(例如已知在對(duì)例如硫酸酯酶缺乏癥的治療中有益的FGE核酸和/或多肽和試劑，——例如治療MPSII中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)，其作為單一組合物中的混合物，或以足夠的時(shí)間間隔順序施用以至于化合物可發(fā)揮出相加性或甚至協(xié)同性的效力。本發(fā)明也包含固相核酸分子陣列。陣列基本上由固定于固體基質(zhì)的一套核酸分子、其表達(dá)產(chǎn)物或其(或者核酸或者多肽分子的)片段組成，每一核酸分子選自FGE，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶 E，芳基硫酸酯酶 F，芳基硫酸酯酶 G，HSulf-1，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4，HSulf-5，和HSulf-6。在某些實(shí)施方案中，固相陣列進(jìn)一步包含至少一種對(duì)照核酸分子。在一定實(shí)施方案中，這套核酸分子包含至少一種，至少兩種，至少三種，至少四種或甚至至少五種核酸分子，每一種選自FGE，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-l，HSulf-2，HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和HSulf-6。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這套核酸分子包含最多100種不同核酸分子。在重要的實(shí)施方案中，這套核酸分子包含最多10種不同核酸分子。根據(jù)此發(fā)明，標(biāo)準(zhǔn)的微陣列技術(shù)的雜交技術(shù)被用于評(píng)估核酸表達(dá)的模式和鑒別核酸表達(dá)。微陣列技術(shù)，其也稱(chēng)為其它名字，包括DNA芯片技術(shù)，基因芯片技術(shù)和固相核酸陣列技術(shù)，為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知，并基于但不限于，獲得在固定的基質(zhì)上的已鑒別出的核酸探針的陣列(例如在本文中其它部分所述如FGE，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和 / 或 HSulf-6 的分子)，以報(bào)告分子(例如放射性的，化學(xué)發(fā)光的，或熒光性的標(biāo)記例如熒光素，Cye3-dUTP或Cye5-dUTP)標(biāo)記靶分子，將靶核酸與探針雜交，和評(píng)估靶一探針的雜交。一般而言，具有與靶序列完全匹配的核酸序列的探針，將比不完全匹配的探針檢測(cè)到更強(qiáng)的報(bào)告分子信號(hào)。在核酸微陣列技術(shù)中應(yīng)用的多種成分和技術(shù)在The Chipping Forecast,Nature Genetics,卷21，Jan1999中呈現(xiàn)，其全部?jī)?nèi)容在本文中被整合作為參考。根據(jù)本發(fā)明，微陣列基質(zhì)可包括但不限于玻璃，硅土，鋁硅酸鹽，硼硅酸鹽，金屬氧化物例如氧化鋁和氧化鎳，多種粘土，硝基纖維素或尼龍。在所有實(shí)施方案中，優(yōu)選玻璃基質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，探針選自核酸，其包括但不限于DNA，基因組DNA，cDNA和寡核苷酸；且可以是天然的或合成的。寡核苷酸探針優(yōu)選20到25聚體寡核苷酸，而DNA/cDNA探針優(yōu)選長(zhǎng)度為500到5000個(gè)堿基，雖然其它長(zhǎng)度也可被應(yīng)用。合適的探針長(zhǎng)度可被本領(lǐng)域一般技術(shù)人員通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的程序而測(cè)定。在某一實(shí)施方案中，優(yōu)選的探針是以SEQID NOs:1, 3, 4, 6, 8, 10,和/或12給出的核酸分子中的兩種或更多的組合。探針可應(yīng)用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法例如凝膠過(guò)濾或沉淀純化，以除去污染物。

在某一實(shí)施方案中，微陣列基質(zhì)可用化合物涂層以增強(qiáng)探針在基質(zhì)上的合成。這類(lèi)化合物包括但不限于，寡聚乙二醇。在另一實(shí)施方案中，基質(zhì)上的偶聯(lián)試劑或基團(tuán)能被用于共價(jià)連接第一核苷酸或寡核苷酸到基質(zhì)。這些試劑或基團(tuán)可包括但不限于氨基，羥基，溴基和羧基。這些活性基團(tuán)優(yōu)選通過(guò)烴基例如亞烷基或亞苯基二價(jià)基團(tuán)附著于基質(zhì)，一個(gè)化合價(jià)位置被鏈連接占據(jù)而余下的一個(gè)附著到活性基團(tuán)。這些烴基基團(tuán)可包含多至約10個(gè)碳原子，優(yōu)選多至約6個(gè)碳原子。亞烷基通常優(yōu)選在主鏈中包含2到4個(gè)碳原子。本方法的這些和另外的細(xì)節(jié)在例如U. S. Patent 4，458，066中被公開(kāi)，其全部?jī)?nèi)容被整合作為參考。在某一實(shí)施方案中，應(yīng)用方法例如光導(dǎo)向的化學(xué)合成、光化學(xué)去保護(hù)或核苷酸前體到基質(zhì)的運(yùn)送及隨后的探針產(chǎn)生，探針以預(yù)先確定的柵格模式直接在基質(zhì)上被合成。在另一實(shí)施方案中，基質(zhì)可用化合物涂層以增強(qiáng)探針與基質(zhì)的結(jié)合。這類(lèi)化合物包括但不限于聚賴(lài)氨酸，氨基娃燒，氨基-反應(yīng)性娃燒(Chipping Forecast, 1999)或鉻(Gwynne和Page，2000)。在此實(shí)施方案中，預(yù)合成的探針以精確的、預(yù)先確定體積的和柵格的模式被應(yīng)用于基質(zhì)，利用了計(jì)算機(jī)控制的機(jī)器人將探針以接觸打印方式或非接觸方式例如噴墨或壓電運(yùn)送而應(yīng)用于基質(zhì)。以包括但不限于UV照射的方法，探針可共價(jià)連接到基質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，探針熱連接到基質(zhì)。靶標(biāo)是選自包括但不限于下列的核酸DNA，基因組DNA, cDNA, RNA, mRNA,且可以是天然的或合成性的。在所有實(shí)施方案中，優(yōu)選來(lái)自被懷疑為發(fā)展或具有硫酸酯酶缺乏癥的受試者的核酸分子。在本發(fā)明的一定的實(shí)施方案中，一種或更多對(duì)照核酸分子被附著于基質(zhì)。優(yōu)選地，對(duì)照核酸分子允許了對(duì)包括但不限于下列的因素的測(cè)定核酸質(zhì)量和結(jié)合特征；試劑質(zhì)量和有效性；雜交成功性；和分析閾值和成功性。對(duì)照核酸可包括但不限于，基因如管家基因的表達(dá)產(chǎn)物或其片段。為選擇一套硫酸酯酶缺乏疾病的標(biāo)記物，優(yōu)選分析由例如基因表達(dá)的微陣列分析產(chǎn)生的表達(dá)數(shù)據(jù)，以確定在不同患者類(lèi)別(每一患者類(lèi)別是一種不同的硫酸酯酶缺乏疾病)中的哪個(gè)基因是顯著差異性地表達(dá)?；虮磉_(dá)的顯著性可應(yīng)用Permax計(jì)算機(jī)軟件被測(cè)定，雖然任何能區(qū)分表達(dá)的顯著差異的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)包也可被使用。Permax實(shí)現(xiàn)了對(duì)數(shù)據(jù)的大規(guī)模陣列的排列雙樣本t-檢驗(yàn)。對(duì)于觀察中的高維度載體，Permax軟件計(jì)算了對(duì)每一屬性的t-統(tǒng)計(jì)，并應(yīng)用全部屬性的最大值與最小值的排列分布評(píng)估了顯著性。主要應(yīng)用是確定兩組之間差異最大的屬性(基因)(例如對(duì)照的健康受試者和具有特定硫酸酯酶缺乏癥的受試者)，應(yīng)用t-統(tǒng)計(jì)的值測(cè)量“最大差異”和它們的顯著性水平。硫酸酯酶缺乏疾病相關(guān)性核酸分子的表達(dá)也能應(yīng)用蛋白測(cè)量方法測(cè)定，以測(cè)定SEQ ID NOs: 2的表達(dá)，例如通過(guò)測(cè)定SEQ ID NOs:1和/或3編碼的多肽的表達(dá)。特異和定量測(cè)量蛋白質(zhì)的優(yōu)選方法包括但不限于基于質(zhì)譜的方法例如表面增強(qiáng)的激光解吸電離(SELDI;例如Ciphergen蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng))，非基于質(zhì)譜的方法，和基于免疫組織化學(xué)的方法例如二維凝膠電泳。通過(guò)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的程序，SELDI方法可被用于蒸發(fā)顯微量的蛋白，和創(chuàng)造個(gè)體蛋白質(zhì)的“指紋”，從而 允許對(duì)在單一樣本中的多種蛋白質(zhì)的含量的同時(shí)測(cè)量。優(yōu)選地，基于SELDI的分析可被用于鑒別多種硫酸酯酶缺乏癥的特征，以及這類(lèi)病癥的階段。這類(lèi)分析優(yōu)選包括，但不限于下列實(shí)例。RNA微陣列所發(fā)現(xiàn)的基因產(chǎn)物可通過(guò)被專(zhuān)一(抗體介導(dǎo)的)捕獲到SELDI蛋白質(zhì)盤(pán)(例如選擇性SELDI)而被選擇性地測(cè)量。蛋白篩選(例如以2維凝膠)所發(fā)現(xiàn)的基因產(chǎn)物可通過(guò)最優(yōu)化的“總蛋白SELDI”解析以可視化那些來(lái)自SEQ ID NOs:1, 6, 8, 10，12，14，16，18，20，22，24，26，和 / 或 28 中的特定的目的標(biāo)記。來(lái)自SEQ ID NOs:1, 6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，和 / 或 28 中的多種標(biāo)記物的 SELDI 測(cè)量的特定硫酸酯酶缺乏癥的預(yù)測(cè)模型可被用于SELDI策略。任何前述微陣列方法在測(cè)定硫酸酯酶缺乏疾病相關(guān)核酸的蛋白中的應(yīng)用，能以本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的常規(guī)方法完成，而通過(guò)蛋白質(zhì)測(cè)量方法測(cè)定的表達(dá)可與標(biāo)記物的預(yù)測(cè)定水平相關(guān)，用作對(duì)硫酸酯酶缺乏疾病患者治療策略進(jìn)行選擇的預(yù)測(cè)性方法。本發(fā)明也包含硫酸酯酶產(chǎn)生性細(xì)胞，其中細(xì)胞產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的比率(即比活性)被增加。細(xì)胞包含(i)具有增強(qiáng)的表達(dá)的硫酸酯酶，和(ii)具有增強(qiáng)的表達(dá)的甲酰甘氨酸生成酶，其中細(xì)胞產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的比率，相對(duì)于甲酰甘氨酸生成酶缺乏時(shí)細(xì)胞所產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的比率，增加至少5%。在本文中所用的“具有增強(qiáng)的表達(dá)的硫酸酯酶”典型地指硫酸酯酶和/或其編碼的多肽相對(duì)于對(duì)照的增加的表達(dá)。增加的表達(dá)指增加(即到可探測(cè)的程度)任何硫酸酯酶核酸(如本文中其它部分所描述的本發(fā)明的硫酸酯酶核酸)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，因?yàn)槿魏芜@些過(guò)程的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致基因(核酸)所編碼的多肽的濃度/數(shù)量的增加。這能應(yīng)用大量本領(lǐng)域中已知也在本文中其它部分描述的方法而完成，例如以硫酸酯酶cDNA和/或包含硫酸酯酶位點(diǎn)的基因組DNA對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，通過(guò)應(yīng)用同源重組將例如強(qiáng)啟動(dòng)子元件置于內(nèi)源性硫酸酯酶基因的基因組位點(diǎn)上游而激活內(nèi)源性硫酸酯酶基因(參見(jiàn)，例如U. S. PatentsNos. 5，733，761,6, 270，989和6，565，844中詳細(xì)描述的基因激活技術(shù)，所有這些被整合在本文中作為參考)等。典型的對(duì)照將是載體質(zhì)粒所轉(zhuǎn)染的同樣的細(xì)胞。增強(qiáng)(或增加)硫酸酯酶活性也指防止或抑制硫酸酯酶的降解(例如通過(guò)增強(qiáng)的泛素化)，下調(diào)等，其導(dǎo)致例如相對(duì)于對(duì)照的增加的或穩(wěn)定的硫酸酯酶分子t1/2(半衰期)。下調(diào)或降低的表達(dá)指基因和/或其編碼的多肽的降低的表達(dá)?；虮磉_(dá)的上調(diào)或下調(diào)能通過(guò)一定方式直接測(cè)定，所述方式為應(yīng)用任何本領(lǐng)域已知的適合的方式例如核酸雜交或抗體探測(cè)方法分別探測(cè)基因(例如，硫酸酯酶)的mRNA水平或基因所編碼多肽的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的增加或降低，并與對(duì)照比較。硫酸酯酶基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)也能通過(guò)探測(cè)硫酸酯酶活性的變化而間接測(cè)定。類(lèi)似地，在本文中所用的“具有增強(qiáng)的表達(dá)的甲酰甘氨酸生成酶”，典型地指本發(fā)明的FGE核酸和/或其編碼的多肽相對(duì)于對(duì)照的增加的表達(dá)。增加的表達(dá)指增加(即到可探測(cè)的程度)任何本發(fā)明的FGE核酸(如本文中其它部分所描述的)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，因?yàn)槿魏芜@些過(guò)程的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致基因(核酸)所編碼的多肽的濃度/數(shù)量的增加。這能應(yīng)用上述的(對(duì)硫酸酯酶)和在本文中其它部分描述的方法而完成，在一定實(shí)施方案中，相對(duì)于甲酰甘氨酸生成酶缺乏的細(xì)胞所產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的比率，細(xì)胞所產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的比率增加至少10%，15%,20%, 50%, 100%, 200%, 500%, 1000%。本發(fā)明進(jìn)一步包 含在受試者中治療硫酸酯酶缺乏癥的改進(jìn)的方法。方法包括對(duì)需要這類(lèi)治療的受試者以有效劑量施用硫酸酯酶以治療受試者中的硫酸酯酶缺乏癥，其中硫酸酯酶與一定量的甲酰甘氨酸生成酶接觸，所述量是增加硫酸酯酶比活性的有效量。如本文中其它部分所描述的，“比活性”指所產(chǎn)生的活性硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的比率。在此所用的“接觸”指如本文中其它部分所描述的FGE翻譯后修飾硫酸酯酶。將對(duì)一般技術(shù)人員顯然的是，如果編碼FGE和硫酸酯酶的核酸在細(xì)胞中共表達(dá)，或甚至如果分離的FGE多肽與分離的硫酸酯酶多肽在體內(nèi)或體外接觸，則FGE能接觸硫酸酯酶并對(duì)它進(jìn)行修飾。即使分離的FGE多肽能與分離的硫酸酯酶多肽共施用于受試者，以治療受試者中的硫酸酯酶缺乏癥，在FGE和硫酸酯酶之間的接觸也優(yōu)選在硫酸酯酶施用于受試者之前在體外發(fā)生。既然更低量的硫酸酯酶需要被施用，和/或以更低頻率施用(因?yàn)榱蛩狨ッ妇哂懈叩谋然钚?，此改進(jìn)的治療方法對(duì)受試者有益。參考下面的實(shí)施例，本發(fā)明將被更充分地理解。然而，這些實(shí)施例只傾向于舉例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，而不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1 多種硫酸酯酶缺乏癥由編碼人(。_甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的基因中的突變所引起。實(shí)駘稈序材料和方法FGE的體外分析為監(jiān)測(cè)FGE的活性，N-乙?；虲-酰胺化的23聚肽P23 (MTDFYVPVSLCTPSRAALLTGRS)(SEQ ID NO: 33)被用作底物。位點(diǎn)11的半胱氨酸殘基向FGly的轉(zhuǎn)化通過(guò)MALD1-T0F質(zhì)譜監(jiān)測(cè)。30%乙氰和0. 1%三氯乙酸(TFA)中的6 ii M的P23原液被制備。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，6pmol的P23與高至10 u I的酶一起在最終體積為30 ii I的50mM Tris/HCl (pH9. 0,含有67mM NaCl, 15 u MCaCl2, 2mM DTT,和0. 33mg/ml牛血清白蛋白)中于37°C培育。為停止酶反應(yīng)，加入1. 5 y I10%TFA。然后P23被固著于ZipTip C18 (Millipore)，以0. 1%TFA清洗，并在3 y I的50%乙氰和
0.1%TFA中洗脫。0.5U I的洗脫液與0. 5ii I的基質(zhì)溶液(50%乙氰和0. 1%TFA中的5mg/ml a-氰基-4-輕基-肉桂酸(Bruker Daltonics, Billerica, MA))在不鎊鋼的祀上混合。MALD1-TOF質(zhì)譜應(yīng)用反射模式和剛好高于解吸/電離閾值的激光能量以Reflex III (Bruker Daltonics)完成。所有譜線是來(lái)自靶標(biāo)上幾個(gè)點(diǎn)的200-300次射擊(shot)的平均值。質(zhì)量軸應(yīng)用分子質(zhì)量范圍在1000到3000Da的肽作為外部標(biāo)準(zhǔn)而校準(zhǔn)。P23的單同位素MlT是2526. 28，而包含F(xiàn)Gly產(chǎn)物的是2508. 29。活性(pmol產(chǎn)物/小時(shí))根據(jù)產(chǎn)物的峰值高度除以P23和產(chǎn)物的峰值高度總和而計(jì)算。來(lái)自牛睪丸的FGE的純化牛睪丸得自當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)，冰上保存最多20小時(shí)。實(shí)質(zhì)(Parenchyme)從結(jié)締組織中釋放，并在韋林氏攪切器中和通過(guò)三輪次的馬達(dá)陶制(motor pottering)而勻衆(zhòng)。通過(guò)所得到的勻衆(zhòng)的細(xì)胞分級(jí)分離，粗微粒體(RM)的制備按(Meyer等，J. Biol.Chem.，2000，275:14550-14557)所述并進(jìn)行下面的修正而完成。三次差異離心步驟，每次4°C下 20 分鐘，在 500g(JA10 轉(zhuǎn)子)，3000g(JA10)和 IOOOOg(JA20)下完成。RM 膜從最后一次的上清液中沉淀(125000g，Ti45轉(zhuǎn)子，45分鐘，4°C )，通過(guò)馬達(dá)陶制勻漿并在蔗糖墊層上分層(50mMHepes, pH7. 6, 50mM KAc, 6mM MgAc2, ImM EDTA,1. 3M鹿糖，5mM P _疏基乙醇)。在Ti45轉(zhuǎn)子中以45000rpm4°C下離心210分鐘后，RM從沉淀中回收。通常100000-150000等價(jià)的 RM,如 Walter 和 Blobel (Methods Enzymol. , 1983, 96:84-93)所定義，從 Ikg 睪丸組織中得到。reticuloplasm,即RM的腔內(nèi)容物通過(guò)低濃度脫氧Big Chap下的分級(jí)抽提而得到，如 Fey 等，J. Biol. Chem.，2001，276:47021-47028 所述。對(duì) FGE 的純化，95ml 的reticuloplasm4°C 下對(duì) 20mM Tris/HCl, pH8. 0, 2. 5mM DTT 透析 20 小時(shí)，而通過(guò) 125000g下離心I小時(shí)澄清。32ml澄清reticuloplasm等份物室溫下被裝在MonoQ HR10/10柱(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)上，清洗和用線性梯度的 80ml Tris 緩沖液中的0到0. 75M NaCl以2ml/min洗脫。三輪洗脫的包含F(xiàn)GE活性的級(jí)分(50_165mM NaCl洗脫)被收集(42ml),與2ml的伴刀ii球蛋白A-Sepharose (Amersham Biosciences,已用含有
0.5M KCl, ImM MgCl2, ImM MnCl2, ImM CaCl2,和 2. 5mM DTT 的 50mM Hepes 緩沖液，pH7. 4 清洗過(guò))混合。4°C下培育16小時(shí)后,伴刀豆球蛋白A-Sepharose在柱中被收集,并用6ml相同的H印es緩沖液清洗。固著的物質(zhì)通過(guò)柱在室溫下與6ml 0. 5M a-甲基甘露糖苷在50mMHepes, pH7. 4,2. 5mM中培育I小時(shí)而洗脫。洗脫用4ml的相同洗脫劑重復(fù)。來(lái)自伴刀豆球蛋白A-Sepharose的合并的洗脫液(IOml)以0. 5MTris/HCl (pH9. 0)調(diào)至pH8. 0,并與用IOmg 混雜肽(PVSLPTRSCAALLTGR) (SEQ ID NO: 34)衍生化的 2ml 的 Aff igel 10 (Bio-RadLaboratories, Hercules, CA)混合，以緩沖液 A(50mM Hepes, pH8. 0,含有 0. 15M 乙酸鉀，0. 125M蔗糖，ImM MgCl2,和2. 5mM DTT)清洗。4°C下培育3小時(shí)后，親和基質(zhì)在柱中被收集。收集經(jīng)過(guò)的液體(flow through)和用4ml緩沖液A清洗的組分,合并,并與已用IOmg的 Ser69肽(PVSLSTPSRAALLTGR) (SEQ ID N0:35)取代的 2ml Affigel 10 混合，用緩沖液A清洗。4°C下培育過(guò)夜，親和基質(zhì)在柱中被收集，用6ml的緩沖液B (含有2M NaCl和20種組成蛋白質(zhì)的氨基酸(每一濃度為50mg/ml)的混合物的緩沖液A)清洗3次。通過(guò)將Affigel與含有25mM Ser69肽的6ml緩沖液B培育兩次，每次90min，而將固著的物質(zhì)從親和基質(zhì)洗脫。洗脫液的等分組分以lmg/ml牛血清白蛋白取代，對(duì)緩沖液A透析，并分析活性?；钚缘谋Ａ舨糠?11.8ml)在 Vivaspin500 濃縮器(Vivascience AG, Hannover, Germany)中濃縮，并在95°C下溶于Laemmli SDS樣品緩沖液。起始物質(zhì)和層析步驟后得到的制劑的多肽組成以SDS - PAGE (15%丙烯酰胺，0. 16%雙丙烯酰胺)監(jiān)測(cè)，和以SYPRO Ruby (Bio-RadLaborator·ies)染色。通過(guò)質(zhì)譜對(duì)FGE的鑒定對(duì)于肽質(zhì)量指紋分析，純化的多肽用胰蛋白酶在凝膠內(nèi)被消化(Shevchenko等，Anal. Chem.，1996，68:850-855)，在C18 ZipTip上脫鹽，并應(yīng)用二氫苯甲酸作為基質(zhì)和兩種來(lái)自胰蛋白酶的自降解肽(m/z 842. 51和2211. 10)作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)而以MALD1-T0F質(zhì)譜進(jìn)行分析。對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜分析，選出的肽通過(guò)MALD1-T0F post-source decay質(zhì)譜而被分析。它們對(duì)應(yīng)的帶雙電荷的離子被分離出，并被offline nano-ESI離子講質(zhì)譜(EsquireLC, Bruker Daltonics)所片段化。質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)Mascot檢索算法用于NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中和NCBI EST核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)鑒定。生物信息學(xué)信號(hào)肽和切斷的位置根據(jù)在EMBOSS (Rice 等，Trends in Genetics, 2000, 16:276-277)中實(shí)行的 von Heijne (von Hei jne, Nucleic Acids Res., 1986, 14:4683-90)的方法被描述。N-糖基化位點(diǎn)應(yīng)用 Brunak 的算法(Gupta 和 Brunak, Pac. Symp. Biocomput., 2002, 310-22)被預(yù)測(cè)。功能結(jié)構(gòu)域通過(guò)搜索 PFAM-Hidden-Markov-Models (version 7. 8) (Sonnhammer 等，Nucleic AcidsRes.，1998，26:320-322)而被探測(cè)至Li。為搜索FGE 同源物,National Center for BiotechnologyInformation 的數(shù)據(jù)庫(kù)(Wheeler 等，Nucleic Acids Res., 2002, 20:13-16)用 BLAST (Altschul等，Nucleic Acids Res.，1997，25:3389-3402)查詢(xún)。序列類(lèi)似度應(yīng)用來(lái)自EMBOSS的標(biāo)準(zhǔn)工具而計(jì)算?；蚪M位點(diǎn)組織和同線性應(yīng)用NCBI的人和小鼠基因組資源及也來(lái)自NCBI，BetheSda，MD的人類(lèi)-小鼠同源性圖譜而確定。人FGEcDNA 的克隆從人成纖維細(xì)胞應(yīng)用RNEASY Mini試劑盒(Qiagen，Inc.，Valencia, CA)制備的總 RNA，應(yīng)用 OMNISCRIPT RT 試劑盒(Qiagen, Inc.，Valencia, CA)以及寡(dT)引物或者FGE 專(zhuān)一的引物 1199nc(CCAATGTAGGTCAGACACG) (SEQ ID NO:36)而被反轉(zhuǎn)錄。cDNA 的第一鏈通過(guò)應(yīng)用正向引物lc(ACATGGCCCGCGGGAC) (SEQ ID NO:37)和作為反向引物的1199nc或 1182nc(CGACTGCTCCTTGGACTGG) (SEQ ID NO:38)的 PCR 而擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物被直接克隆進(jìn)pCR4-T0P0 載體(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)。通過(guò)對(duì)克隆 PCR 產(chǎn)物(其從不同的個(gè)體和獨(dú)立的RT - PCR反應(yīng)得到)的多種測(cè)序，F(xiàn)GE cDNA的編碼序列被確定(SEQ IDNOs:1 和 3)。突變探測(cè)，基因組測(cè)序，定點(diǎn)誘變和RNA印跡分析此研究中采用的標(biāo)準(zhǔn)流程本質(zhì)上如LU bke等(Nat. Gen. ,2001,28:73-76)和Hansske 等(J. Clin.1nvest. , 2002, 109:725-733)所述。Northern 點(diǎn)與覆蓋整個(gè)編碼區(qū)cDNA探針雜交，并與P -肌動(dòng)蛋白cDNA探針雜交而作為RNA負(fù)載的對(duì)照。細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)自多種硫酸酯酶缺乏癥患者1~6的成纖維細(xì)胞分別從E. Christenson (RigshospitaletCopenhagen) , M. Bec k (Universititskinderkliaik Mainz) , A.Kohlschtitter (Uni veiS i tstskrankenhaus Eppendorf, Hamburg), E. Zammarchi (MeyerHospital, University of Florence), K. Harzer(Institut filr Himforschung, Ulli VGTS i tiitTiibingen),和 A. Fensom(Guy’s Hospital, London)得到。人皮膚成纖維細(xì)胞，HT-1080, BHK21 和 CHO細(xì)胞被以37°C和5%C02下保存在含有10%胎牛血清的Dulbecco的修飾后的Eagle培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染，間接免疫熒光，Western印跡分析和FGE活性的探測(cè)通過(guò)add-on PCR(其應(yīng)用了 Pfu 聚合酶(Stratagene, La Jolla, CA)和下列引物GGAATTCGGGACAACATGGCTGCG(EcoRI)(SEQ ID NO:39), CCCAAGCTTATGCGTAGTCAGGCACATCATACGGATAGTCCATGGTGGGCAGGC(HA)(SEQ ID NO:40), CCCAAGCTTACAGGTCTTCTTCAGAAATCAGCTTTTGTTCGTCCATGGTGGGCAGGC(c-Myc)(SEQ ID NO:41), CCCAAGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGCGATCCTCTGTCCATGGTGGGCAGGC (RGS-His6) (SEQ ID NO:42) ), FGE cDNA 被裝上 5’EcoR1-位點(diǎn)以及3’ HA-, c-Myc或者RG S-His6-標(biāo)記序列，及其后的終止密碼子和HindIII位點(diǎn)。得到的PCR產(chǎn)物作為 EcoRI/Hindlll 片段被克隆進(jìn) pMPSVEH(Artelt 等，Gene, 1988，68:213-219)。應(yīng)用EFFECTENE (Qiagen)作為轉(zhuǎn)染試劑，得到的質(zhì)粒被瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)生長(zhǎng)在蓋玻片上的HT-1080，BHK21和CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，細(xì)胞通過(guò)如前面所述的間接免疫熒光(Lubke 等,Nat.Gen.,2001, 28:73-76;Hansske 等,J.Clin.1nvest. , 2002, 109:725-733)，應(yīng)用抗HA的單克隆IgGl抗體(Berkeley抗體Company, Richmond, CA),抗c_Myc的單克隆 IgGl 抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc. , Santa Cruz, CA)或抗 RGS-His 的單克隆IgGl抗體(Qiagen)作為第一抗體而被分析。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白即蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)被用不同亞型的單克隆抗體(IgG2A, Stressgen Biotech. , Victoria BC, Canada)所探測(cè)。第一抗體被用分別偶聯(lián)到CY2或CY3的同型-專(zhuān)一性的山羊第二抗體(MolecularProbes, Inc. ,Eugene, OR)所探測(cè)。免疫熒光圖像在Leica TCS Sp2 AOBS激光掃描顯微鏡上得到。對(duì)Western印跡分析,應(yīng)用相同的單克隆抗體,HRP-綴合的抗-小鼠IgG被用作第二抗體。對(duì)FGE活性的測(cè)定，胰蛋白酶化的細(xì)胞用含有2. 5mM DTT、蛋白酶抑制劑和l%TritonX-100的IOmM Tris (pH8. 0)所溶解的磷酸緩沖鹽溶液清洗，其含有蛋白酶抑制劑的混合物(208 u M 4-(2-氨基乙基)鹽酸苯磺酰基氟，0. 16 ii M抑酶肽，4.2 ii M亮抑酶肽，7.2 ii M苯丁抑制素，3 ii M抑胃酶肽A，2. 8 ii ME-64)，并通過(guò)在125，OOOg離心I小時(shí)而澄清。上清液在MonoQ PCl. 6/5柱上應(yīng)用上述條件進(jìn)行層析。在50_200mM NaCl中洗脫的組分被收集，冷凍干燥，并重構(gòu)成原始體積的十分之一，隨后用肽P23測(cè)定FGE活性。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)目的cDNAs被克隆進(jìn)基于莫洛尼鼠白血病病毒的載體pLPCX和pLNCX2 (BDBiosciences Clontech, Palo Alto, CA) 嗜親性的 FNX-Eco 細(xì)胞(ATCC, Manassas, VA)的轉(zhuǎn)染，及兼嗜性RETR0PACK PT67細(xì)胞(BD Biosciences Clontech)和人成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)按 Lubke 等，Nat. Gen.，2001，28:73-76; Thiel 等，Biochem. J.，2002，376，195-201 所述完成。對(duì)部分實(shí)驗(yàn)，在測(cè)定硫酸酯酶活性前，用嘌呤霉素選擇PLPCX轉(zhuǎn)導(dǎo)的PT67細(xì)胞硫酸酯酶分析ASA, STS 和 GalNAc6S 的活性按 Rommerskirch 和 von Figura, Proc. Natl. Acad.Sc1.，USA, 1992，89:2561-2565; GloSSl和 Kresse, Clin. Chim. Acta, 1978，88:111-119 中所述被測(cè)定。MS對(duì)FGE活性的基于肽的快速分析我們已發(fā)展出應(yīng)用體外合成的[35S]ASA片段作為底物而用于在微粒體抽提物中測(cè)定FGE活性的分析法。片段被加入分析混合物而作為核糖體相連的初生鏈復(fù)合物。對(duì)產(chǎn)物的定量包括胰蛋白酶消化、肽通過(guò)RP-HPLC的分離，及通過(guò)化學(xué)衍生為腙、RP-HPLC分離和液閃計(jì)數(shù)的組合而對(duì)含有[35S]-標(biāo)記的FGly的胰蛋白酶降解肽的鑒別和定量(Fey等，J. Biol. Chem.，2001, 276:47021-47028)。為監(jiān)測(cè)純化過(guò)程中的酶活性，此麻煩的程序需要被修正。對(duì)應(yīng)于ASA殘基65-80和含有FGly形成所需的序列基序的合成性的16聚肽在體外分析中抑制了 FGE活性。這暗示了肽例如ASA65-80可作為FGE的底物而起作用。我們合成了 23聚肽P23(SEQ ID NO: 33)，其對(duì)應(yīng)于ASA殘基60-80并附加了 N-乙酰化的甲硫氨酸和C-酰胺化的絲氨酸殘基以分別保護(hù)N-和C-末端。含有半胱氨酸和FGly的P23形式能通過(guò)基質(zhì)輔助的激光解析/電離飛行時(shí)間(MALD1-T0F)質(zhì)譜鑒別和定量。FGly殘基在P23位點(diǎn)11的存在通過(guò)MALD1-T0F post source decay質(zhì)譜證實(shí)(參見(jiàn)Peng等，J. MassSpec.，2003，38:80-86)。P23和來(lái)自牛胰或牛睪丸微粒體的抽提物的培育將高至95%的肽轉(zhuǎn)化成為含有FGly的衍生物(圖1)。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，反應(yīng)與酶的數(shù)量和培育的時(shí)間成正比例，只要少于50%的底物被消耗和培育時(shí)間不超過(guò)24小時(shí)。P23的km是13nM。減少的和氧化的谷胱甘肽、Ca2+和 pH的效應(yīng)與在應(yīng)用核糖體相連初生鏈復(fù)合物作為底物的分析中所見(jiàn)到的那些相當(dāng)(Fey 等，J. Biol. Chem.，2001，276:47021-47028)。FGE的純化對(duì)FGE的純化,牛睪丸微粒體的可溶性的級(jí)分(reticuloplasm)作為起始物質(zhì)。FGE的比活性比那些來(lái)自牛胰微粒體的reticuloplasm中的類(lèi)型高10-20倍(Fey等，J.Biol. Chem.，2001, 276:47021-47028)。FGE的純化通過(guò)四個(gè)層析步驟的組合而完成。前兩個(gè)步驟是在MonoQ陰離子交換柱和伴刀豆球蛋白A-Sepharose柱上的層析。在pH8,FGE活性物被固著到MonoQ，并在50-165mM NaCl被洗脫，而具有60-90%的回收率。當(dāng)此級(jí)分與伴刀豆球蛋白A-S印harose混合時(shí)，F(xiàn)GE被固著。起始活性的30-40%能用0. 5M a-甲基甘露糖苷洗脫。后面兩個(gè)純化步驟是以16聚肽衍生的親和基質(zhì)上的層析。第一親和基質(zhì)是ASA65-80肽的變體所取代的Affigel 10，其中對(duì)FGly形成很關(guān)鍵的殘基Cys69，Pro71和Arg73被攪亂(混雜肽PVSLPTRSCAALLTGR-SEQ ID NO:34)。當(dāng)以IOmM濃度加入體外的分析中時(shí)，此肽不會(huì)抑制FGE活性，且當(dāng)固定到Affigel 10時(shí)不會(huì)保持FGE活性。在混雜肽親和基質(zhì)上的層析除去了肽結(jié)合性蛋白，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的伴侶。第二親和基質(zhì)是ASA65-80肽的變體所取代的Affigel 10，其中Cys69被絲氨酸取代(Ser69肽PVSLSTPSRAALLTGR-SEQ IDNO: 35)。Ser69肽親和基質(zhì)有效結(jié)合FGE。FGE活性物能用2M KSCN或者25mM Ser69肽洗脫，而具有20-40%的回收率。在活性測(cè)定之前，KSCN或Ser69肽必須通過(guò)透析除去。Cys69被絲氨酸的取代對(duì)活性FGE的洗脫至關(guān)重要。被野生型ASA65-80肽所取代的Affigel 10有效結(jié)合FGE。然而，幾乎沒(méi)有活性能在用離液鹽(KSCN，MgCl2)，肽(ASA65-80或Ser69肽)，或者低或高pH值緩沖液洗脫的洗脫液中回收。在圖2中顯示了起始物質(zhì)和在經(jīng)歷了典型純化過(guò)程的四個(gè)層析步驟之后得到的活性組分的多肽模式。在最終級(jí)分中，5%的起始FGE活性和0. 0006%的起始蛋白被回收(8333-倍純化)。純化的39. 5和41. 5kDa多肽被單個(gè)基因編碼在純化的FGE制劑中的39. 5和41. 5kDa多肽被進(jìn)行肽質(zhì)量指紋分析。通過(guò)MALD1-T0F質(zhì)譜得到的兩個(gè)多肽的胰蛋白酶肽的質(zhì)譜很大程度地重疊，暗示著兩個(gè)蛋白質(zhì)源自相同基因。在兩個(gè)多肽的胰蛋白酶肽中，兩個(gè)富含肽(MH+1580. 73, SQNTPDSSASNLGFR(SEQ ID NO:43)和 MH+ 2049. 91, MVPIPAGVFTMGTDDPQIK-SEQ IDNO: 44外加兩處甲硫氨酸氧化)被發(fā)現(xiàn)，其與具有GenBank Acc. No. AK075459 (SEQ ID NO: 4)的cDNA所編碼的蛋白質(zhì)吻合。這兩個(gè)肽的氨基酸序列被MALD1-TOF post source decay譜和應(yīng)用 offline nano-electrospray ionisation (ESI)離子講質(zhì)譜的 MS/MS 分析所確認(rèn)。人cDNA的牛定向進(jìn)化同源物的EST序列，其覆蓋FGE的C端部分并與兩個(gè)肽的序列都吻合，提供了牛FGE的另外的序列信息。FGE的進(jìn)化保守和結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)人FGE基因被SEQ ID NOs:1和/或3的cDNA編碼，并位于染色體3p26。它跨度約為105kb，而編碼序列分散在9個(gè)外顯子中。人FGE基因的三個(gè)定向進(jìn)化同源物在小鼠中(87% —致)，黃果蠅(48% —致)，和瘧蚊(47% —致)被發(fā)現(xiàn)。定向進(jìn)化同源物的EST序列在更多的8個(gè)物種中被發(fā)現(xiàn),包括奶牛，豬，非洲爪蟾，Silurana tropicalis,斑馬魚(yú)，鮭魚(yú)和其它魚(yú)物種(對(duì)于細(xì)節(jié)，參見(jiàn)實(shí)施例2)。外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)在人與小鼠基因間保守，而在染色體6E2上 的小鼠基因位于與人染色體3p26同線的區(qū)域內(nèi)。S. cerevisiae和C. elegans的基因組缺乏FGE同源物。在原核生物中，12種人FGE的同源物被發(fā)現(xiàn)。人FGE的cDNA被預(yù)測(cè)編碼一個(gè)374殘基的蛋白(圖3和SEQ ID NO:2)。此蛋白包含一個(gè)33殘基的可切斷的信號(hào)序列，其表明FGE到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的遷移，此蛋白也包含了在Asnl41處的單一 N-糖基化位點(diǎn)。FGE與伴刀豆球蛋白A的結(jié)合暗示著此N-糖基化位點(diǎn)被應(yīng)用。FGE的殘基87-367被列在PFAM蛋白質(zhì)基序數(shù)據(jù)庫(kù)中，作為未知功能的結(jié)構(gòu)域(PFAM:DUF323)。人FGE和其在數(shù)據(jù)庫(kù)中已鑒定出的真核生物的定向進(jìn)化同源物的序列比較分析說(shuō)明此結(jié)構(gòu)域由三個(gè)不同的亞結(jié)構(gòu)域組成。在四種已知的真核生物FGE定向進(jìn)化同源物中，N端亞結(jié)構(gòu)域(人FGE中的殘基91-154)具有46%的序列一致性和79%的相似性。在人FGE中，此結(jié)構(gòu)域在Asn 141攜帶N-糖基化位點(diǎn)，這在其它定向進(jìn)化同源物中保守。FGE的中間部分(人FGE中的殘基179-308)為富含色氨酸的亞結(jié)構(gòu)域(每129殘基中12個(gè)色氨酸)。真核生物定向進(jìn)化同源物在此亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一致性是57%，相似性是82%。C端亞結(jié)構(gòu)域(人FGE中的殘基327-366)是FGE家族內(nèi)最高度保守的序列。人C端亞結(jié)構(gòu)域與真核生物定向進(jìn)化同源物(3個(gè)全長(zhǎng)序列和8個(gè)EST)的序列一致性是85%，相似性是97%。在亞結(jié)構(gòu)域3的40個(gè)殘基內(nèi)，四個(gè)半胱氨酸殘基完全保守。三個(gè)半胱氨酸也在原核生物FGE定向進(jìn)化同源物中保守。FGE家族的12個(gè)原核生物成員(細(xì)節(jié)參見(jiàn)實(shí)施例2)與真核生物FGE共享亞結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。三個(gè)亞結(jié)構(gòu)域之間的邊界在原核生物FGE家族中更加明顯，因?yàn)榭勺冮L(zhǎng)度的非保守序列將亞結(jié)構(gòu)域彼此分開(kāi)。人和小鼠基因組編碼兩個(gè)密切相關(guān)的FGE同源物(SEQ ID NOs:43和44，GenBankAcc. No. NM_015411，在人中；和 SEQ ID NOs:45 和 46，GenBank Acc. No. AK076022，在小鼠中)。兩個(gè)平行進(jìn)化同源物為86%—致。它們的基因位于同線染色體區(qū)域(在人中7qll，在小鼠中5G1)。兩個(gè)平行進(jìn)化同源物都與FGE定向進(jìn)化同源物分享亞結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，與人FGE有35% —致性和47%的相似性。在兩個(gè)同源物中都100%—致的第三亞結(jié)構(gòu)域中，含有半胱氨酸的亞結(jié)構(gòu)域3的i^一體序列缺失。表達(dá)，亞細(xì)胞定位和分子形式2.1 kb的單一轉(zhuǎn)錄子通過(guò)來(lái)自成纖維細(xì)胞的總RNA和來(lái)自心臟、腦、胎盤(pán)、肺、肝臟、骨骼肌、腎和胰的聚A+RNA的RNA印跡分析可被探測(cè)。相對(duì)于P -肌動(dòng)蛋白R(shí)NA，含量有一個(gè)數(shù)量級(jí)的變化，而在胰和腎中最高，腦中最低。多種真核生物細(xì)胞系，其穩(wěn)定地或瞬時(shí)表達(dá)人FGE的cDNA或C端被HA-，Myc-或His6_tag所延長(zhǎng)的FGE衍生物的cDNA，被用于對(duì)FGE活性和FGE亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析。標(biāo)記或非標(biāo)記的FGE的瞬時(shí)表達(dá)增加了1. 6-3. 9倍的FGE活性。FGE在PT67細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)增加了約100倍的FGE活性。在BHK21，CHO和HT1080細(xì)胞中通過(guò)間接免疫熒光對(duì)帶標(biāo)記的FGE形式的探測(cè)顯示多種帶標(biāo)記的FGE形式與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔蛋白)共定位。來(lái)自BHK 21細(xì)胞(被編碼帶標(biāo)記的FGE形式的cDNA所瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的抽提物的Western印跡分析顯示單一的免疫活性條帶,其表觀大小在42到44kDa之間。FGE基因攜帶多種硫酸酯酶缺乏癥中的突變多種硫酸酯酶缺乏癥由硫酸酯酶中無(wú)法產(chǎn)生FGly殘基的缺陷所引起(Schmidt, B.等，Cell, 1995，82:271-278)。FGE基因因此是多種硫酸酯酶缺乏癥的候選基因。我們對(duì)7位多種硫酸酯酶缺乏癥患者的FGE編碼性cDNA進(jìn)行了擴(kuò)增和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)十個(gè)不同的突變，其被基因組DNA測(cè)序所確證(表I)。
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表1:MSD患者中的突變
權(quán)利要求
1.組合物，其包含由共表達(dá)硫酸酯酶和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的硫酸酯酶，其中相對(duì)于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的相同的哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞所產(chǎn)生的對(duì)照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶具有增加百分比的硫酸酯酶活性。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中相對(duì)于缺乏甲酰甘氨酸生成酶的對(duì)照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的活性百分比增加至少為5%。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中相對(duì)于缺乏甲酰甘氨酸生成酶的對(duì)照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的活性百分比增加至少為10%。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中相對(duì)于缺乏甲酰甘氨酸生成酶的對(duì)照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的活性百分比增加至少為20%。
5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的組合物，其中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞過(guò)表達(dá)FGE。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中通過(guò)激活內(nèi)源性FGE使哺乳動(dòng)物細(xì)胞過(guò)表達(dá)FGE。
7.權(quán)利要求5的組合物，其中通過(guò)過(guò)表達(dá)外源性FGE使哺乳動(dòng)物細(xì)胞過(guò)表達(dá)FGE。
8.組合物，其包含由相比野生型細(xì)胞具有提高的Ca-甲酰甘氨酸生成活性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的硫酸酯酶，其中相對(duì)于由野生型細(xì)胞所產(chǎn)生的對(duì)照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶具有增加的甲酰甘氨酸形成活性。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含激活的內(nèi)源性甲酰甘氨酸生成酶 (FGE)0
10.權(quán)利要求8的組合物，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含外源性甲酰甘氨酸生成酶 (FGE)0
11.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的組合物，其中的硫酸酯酶選自艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶， 硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A， 芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSuIf-5 和 HSulf-6。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中的硫酸酯酶是艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中的艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶包含SEQID N0:7。
14.權(quán)利要求11的組合物，其中的硫酸酯酶是芳基硫酸酯酶A。
15.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的組合物，其中的哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
16.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的組合物，其中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。
17.藥物組合物在制備用于治療受試者硫酸酯酶缺乏癥的藥物中的用途，所述藥物組合物包含由共表達(dá)硫酸酯酶和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的硫酸酯酶， 其中相對(duì)于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的相同的哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞所產(chǎn)生的對(duì)照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶具有增加百分比的硫酸酯酶活性。
18.藥物組合物在制備用于治療受試者硫酸酯酶缺乏癥的藥物中的用途，所述藥物組合物包含由相比野生型細(xì)胞具有提高的Ca -甲酰甘氨酸生成活性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的硫酸酯酶，其中相對(duì)于由野生型細(xì)胞所產(chǎn)生的對(duì)照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶具有增加的甲酰甘氨酸形成活性。
19.權(quán)利要求17或18的用途，其中的硫酸酯酶缺乏癥選自粘多糖病II(MPSII; Hunter 綜合癥)，粘多糖病IIIA(MPS IIIA; Sanfilippo綜合癥A)，粘多糖病VIII (MPS VIII)，粘多糖病 IVA (MPS IVA; Morquio 綜合癥 A)，粘多糖病 VI (MPS VI; Maroteaux-Lamy 綜合癥)，異常染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(MLD)，X-連鎖的隱性點(diǎn)狀軟骨發(fā)育不全1，和X-連鎖的魚(yú)鱗病 (類(lèi)固醇硫酸酯酶缺乏癥)。
20.權(quán)利要求19的用途，其中的硫酸酯酶缺乏癥是粘多糖病II(MPS II;Hunter綜合癥)。
21.權(quán)利要求19的用途，其中的硫酸酯酶缺乏癥是異常染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(MLD)。
22.權(quán)利要求19的用途，其中的硫酸酯酶缺乏癥是粘多糖病IIIA(MPS 11IA; Sanf i I ippo 綜合癥 A)。
23.權(quán)利要求17或18的用途，其中的硫酸酯酶選自艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSuIf-5 和 HSulf-6。
24.權(quán)利要求23的用途，其中的硫酸酯酶是艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
25.權(quán)利要求23的用途，其中的硫酸酯酶是芳基硫酸酯酶A。
26.硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，所述生產(chǎn)細(xì)胞共表達(dá)(i)硫酸酯酶，和( )甲酰甘氨酸生成酶(FGE)，其中，相比于野生型細(xì)胞所述細(xì)胞具有增加的Ca -甲酰甘氨酸生成活性，由此造成所述細(xì)胞生產(chǎn)的硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯的活性百分比增加。
27.權(quán)利要求26的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含外源性FGE。
28.權(quán)利要求26的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含激活的內(nèi)源性FGE。
29.權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中的FGE包含選自下述的氨基酸序列由 SEQ ID NO: 2 的第 34-374 位、SEQ ID NO: 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64， 66，68，70，72，74，76，和78構(gòu)成的氨基酸序列。
30.權(quán)利要求29的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中的FGE包含SEQID NO 2的34-374位氨基酸。
31.權(quán)利要求29的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中的FGE包含SEQID NO 2的氨基酸序列。
32.權(quán)利要求26-31中任一項(xiàng)的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞生產(chǎn)的硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的活性比率相比于缺乏FGE的該比率增加了至少5%。
33.權(quán)利要求26-32中任一項(xiàng)所述的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞生產(chǎn)的硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的活性比率相比于缺乏FGE的該比率增加了至少10%。
34.權(quán)利要求26-33中任一項(xiàng)所述的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞生產(chǎn)的硫酸酯酶對(duì)總硫酸酯酶的活性比率相比于缺乏FGE的該比率增加了至少20%。
35.權(quán)利要求26-34中任一項(xiàng)的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中的硫酸酯酶選自艾杜糖醛酸 2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶 F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSuIf-5 和 HSulf-6。
36.權(quán)利要求26-35中任一項(xiàng)的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中的硫酸酯酶是內(nèi)源性硫酸酯酶。
37.權(quán)利要求26-35中任一項(xiàng)的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中的硫酸酯酶是外源性硫酸酯酶。
38.權(quán)利要求26-37中任一項(xiàng)的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中的FGE是激活的內(nèi)源性FGE。
39.權(quán)利要求26-37中任一項(xiàng)的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中的FGE是外源性FGE。
40.權(quán)利要求26-39中任一項(xiàng)的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
41.權(quán)利要求40的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。
42.權(quán)利要求40的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
43.由權(quán)利要求26-42中任一項(xiàng)的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞所產(chǎn)生的硫酸酯酶。
44.包含權(quán)利要求43的硫酸酯酶的藥物組合物。
45.生產(chǎn)激活的硫酸酯酶的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求26-42中任一項(xiàng)的硫酸酯酶生產(chǎn)細(xì)胞。
46.用于制備用來(lái)治療硫酸酯酶缺乏癥藥物的多肽，其中，所述多肽具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性，且a)具有選自由SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76 ，78，或SEQ ID NO. 2的第34-374位氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列；或b)與SEQID No 2具有至少50%的序列一致性；或c)對(duì)于a)或b)所述的多肽具有I個(gè)或多個(gè)保守氨基酸突變；或d)是上述a)所述多肽的片段；e)是上述a)_d)中任一項(xiàng)的融合蛋白。
47.權(quán)利要求46的多肽，其中的b)中的序列一致性程度為至少75%。
48.權(quán)利要求46的多肽，其中的b)中的序列一致性程度為至少95%。
49.權(quán)利要求46-48中的多肽，其中的FGE是具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的多肽，且其具有包含下述中至少一個(gè)的亞結(jié)構(gòu)域3 (i)GFR基序(ii)RVXXGG (A) S 基序(iii)含3個(gè)精氨酸的七聚物(iv)三甘氨酸殘基。
50.編碼權(quán)利要求46-49中任一項(xiàng)的多肽的核酸或者含有所述核酸的載體。
51.權(quán)利要求50的核酸,其中的載體是病毒載體。
52.權(quán)利要求51的核酸,其中的病毒載體包含來(lái)自腺病毒、腺相關(guān)病或逆轉(zhuǎn)錄病毒的核酸序列。
53.權(quán)利要求50— 52中任一項(xiàng)的核酸,其中的核酸可操作地連接于表達(dá)調(diào)控序列的基因。
54.權(quán)利要求53的核酸，其中基因調(diào)控序列是哺乳動(dòng)物或者病毒的啟動(dòng)子。
55.含有權(quán)利要求46- 49中任一項(xiàng)所述的多肽和硫酸酯酶的組合物或試劑盒。
56.含有權(quán)利要求50- 54中任一項(xiàng)所述的核酸的組合物或試劑盒。
57.權(quán)利要求56的組合物或試劑盒，其中所述組合物或試劑盒進(jìn)一步包含編碼硫酸酯酶的核酸。
58.權(quán)利要求55或57的組合物或試劑盒，其中的硫酸酯酶選自艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶 F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSuIf-5 和 HSulf-6。
59.權(quán)利要求57或58的組合物或試劑盒，其中所述的核酸編碼的硫酸酯酶是由單獨(dú)分開(kāi)的載體所編碼的。
60.包括使用甲酰甘氨酸生成酶(FGE)以此導(dǎo)入醛基的修飾底物的方法。
61.權(quán)利要求60的方法，其中的底物是包含有序列L/V-FGly-X-P-S-R(SEQID NO:32) 的硫酸酯酶。
62.權(quán)利要求60或61的方法，其中的醛基替換巰甲基。
63.權(quán)利要求61或62的方法，其中的半胱氨酸或絲氨酸是被氧化的。
64.權(quán)利要求60-63中任一項(xiàng)的方法，其中的FGE以多肽形式提供，且進(jìn)一步地其中所述多肽具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性，且a)具有選自由SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76 ，78，或者SEQ ID NO. 2的第34-374位氨基酸構(gòu)成的序列；或b)與SEQID No 2具有至少50%的序列一致性；或c)對(duì)于a)或b)所述的多肽具有I個(gè)或者多個(gè)保守氨基酸突變；或d)是上述a)所述多肽的片段；e)是上述a)_d)中任一項(xiàng)的融合蛋白。
65.權(quán)利要求60-63中任一項(xiàng)的方法，其中的FGE以編碼權(quán)利要求64所述多肽的核酸的形式提供。
66.權(quán)利要求60-65中任一項(xiàng)的方法，其中的被修飾的底物與載體組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及診斷和治療多種硫酸酯酶缺乏癥(MSD)及其它硫酸酯酶缺乏癥的方法和組合物。更特異地，本發(fā)明涉及被分離的調(diào)節(jié)硫酸酯酶翻譯后修飾的分子。這類(lèi)修飾為硫酸酯酶的正確功能所必需。
文檔編號(hào)A61K38/00GK103055306SQ201210302070
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2004年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月11日
發(fā)明者K·馮菲古拉, B·施密特, T·蒂爾克斯, M·W·希爾特萊恩, A·巴拉比奧, M·P·考斯瑪 申請(qǐng)人:夏爾人類(lèi)遺傳性治療公司