專利名稱：具有基因藥物程序性釋放性能的金納米球殼載體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有基因藥物程序性釋放性能的金納米球殼載體及制備方法；以金納米球殼結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的具有基因藥物程序釋放性能的金納米球殼載體的制備方法，球殼里面負(fù)載抗癌藥物、球殼外面負(fù)載基因，用此方法構(gòu)建的載體所負(fù)載的基因進(jìn)入細(xì)胞后可以自動釋放到細(xì)胞質(zhì)，藥物可以通過激光照射來激發(fā)釋放，因此該載體具有藥物基因的時序性釋放功能。
背景技術(shù)：
金納米材料具有比較獨特的物理化學(xué)特性，金納米球殼結(jié)構(gòu)因為表面等離子體共振效應(yīng)，在近紅外區(qū)有吸收峰，是比較理想的光熱轉(zhuǎn)換藥物和基因載體，在生物醫(yī)學(xué)上有重要意義。研究者已有利用脂質(zhì)體為模板，在表面沉積金，形成納米空心球結(jié)構(gòu)，并利用脂質(zhì) 體載鹽酸阿霉素等抗癌藥物，用近紅外區(qū)脈沖激光照射金納米球殼，使球殼爆破，達(dá)到控制藥物釋放的目的。金納米球殼也被廣泛用于基因的載體，利用巰基與金的反應(yīng)，將帶有巰基的陽離子性聚合物修飾在金納米空心球的表面，利用靜電吸附效應(yīng)，將呆負(fù)電基因吸附在金納米空心球表面，研究表明，陽離子聚合物攜帶基因進(jìn)入細(xì)胞后會將基因釋放到細(xì)胞質(zhì)中，因此金納米球殼結(jié)構(gòu)可以做為良好的基因投遞載體。研究表明，在腫瘤的治療過程中，基因和藥物聯(lián)合治療有助于增強腫瘤的治療效果，進(jìn)一步的研究表明，因為藥物和基因的作用機理不同，因此藥物和基因的釋放的順序不同對聯(lián)合治療的效果有不同的影響。而現(xiàn)在對藥物和基因的時序性釋放并沒有一個很好的載體，現(xiàn)有的載體更多的是實現(xiàn)藥物和基因的同載，在進(jìn)入細(xì)胞后不能夠根據(jù)需要來控制基因和藥物的釋放順序；另外也有研究者利用多種載體，分別載有基因和藥物，在不同時間段分批將分別載有藥物和基因的載體投遞到細(xì)胞中來研究時序性治療的問題，這種方法工作量很大，過程復(fù)雜，效率不高，而且并不能保證藥物和基因在同一個細(xì)胞當(dāng)中起作用，沒有足夠的信服力。因此現(xiàn)在載體的限制使得基因和藥物的時序性治療的研究受到很大的限制，藥物和基因的時序性治療研究要取得突破必須構(gòu)建一個良好的可實現(xiàn)基因藥物可控時序釋放的載體。因此本發(fā)明要利用金納米球殼結(jié)構(gòu)構(gòu)建一個具有時序性釋放基因和藥物功能的載體，該載體有本身的金的獨特的物理化學(xué)性質(zhì)，毒性低，并且可以通過近紅外區(qū)的激光控制藥物的釋放，為基因和藥物的時序性治療的研究提供了重要的載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用金納米球殼結(jié)構(gòu)，構(gòu)建一個具有基因和藥物時序性釋放功能的載體。本發(fā)明制備具有基因藥物時序性釋放性能的金納米球殼結(jié)構(gòu)載體，其金納米球殼內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)載藥，藥物可通過脈沖激光激發(fā)釋放，球殼外面接陽離子聚合物來負(fù)載帶負(fù)電的基因，可以在細(xì)胞中自行釋放。所述用來負(fù)載基因的陽離子聚合物是聚組氨酸，分子量大于5000.所述載體中，用來負(fù)載的基因為20-100個堿基的RNA。本發(fā)明的構(gòu)建具有基因藥物時序性釋放性能的金納米球殼結(jié)構(gòu)的方法，步驟如下a.將總物質(zhì)的量為O. 5-1. 5umol的二肉豆蘧酰磷脂酸和二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿按照1:1的比例溶解在ImL氯仿和甲醇的混合溶液中，在脂質(zhì)體形成過程中加入親水性的藥物鹽酸阿霉素，使得鹽酸阿霉素的濃度為30nM，加入1-1. 5mg的陽離子聚合物聚組氨酸或者聚賴氨酸，加入10-15uL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯金酸溶液和20-30uL濃度為20mM的鹽酸輕胺，形成載藥的金納米球殼結(jié)構(gòu)； b.用Immol的Traut’ s試劑與l_2mg聚組氨酸反應(yīng),修飾出巰基,利用巰基與金的反應(yīng)，將反應(yīng)后的聚組氨酸加入O. 5-1. 5mL的金納米球殼溶液中，聚組氨酸的側(cè)基咪唑基帶正電，而基因帶負(fù)電，因此分別將2倍，8倍，16倍，32倍，64倍載藥的金納米球殼溶液與等量as-micro-RNA-21或者Danio rerio microRNA 146b_l溶液混合時，可以得到復(fù)合物·所述的步驟a還可以采用如下方法在600mL濃度為O. 2mM硝酸銀溶液中加入O. 6_lmL濃度為I. OM硼氫化鈉和O. 5mM檸檬酸鈉水溶液，將溶液攪拌均勻，再往溶液里加入O. 6-lmL的2. OM鹽酸羥胺和I. 5mL的
O.IM的硝酸銀溶液，攪拌過夜，形成比較大的銀顆粒?？焖賹?. 8-5mL濃度為25mM的氯金酸溶液和銀納米粒子混合，得到金納米球孔洞結(jié)構(gòu)，將溶液避光保存一星期。將上述得到的溶液用20000分子量的透析卡在1500mL的500uM的檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=5. 5)中透析提純，得到金納米球孔洞結(jié)構(gòu)的溶液。然后加入鹽酸阿霉素，使得溶液中鹽酸阿霉素濃度為40-60nM，加入三乙胺，使得溶液中三乙胺的濃度為40-60nM，形成載藥的金納米孔洞結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的原理是利用金納米球殼或者帶孔洞的金納米球結(jié)構(gòu)載藥，在金納米球殼表面利用巰基修飾上陽離子性的聚合物(聚組氨酸)，將帶負(fù)電的基因吸附在陽離子聚合物上，帶巰基的PEG同時修飾在金的表面，用以保護(hù)基因。吸附在陽離子聚合物上的基因進(jìn)入細(xì)胞后會釋放到細(xì)胞質(zhì)中，而金納米球殼載的藥物可以通過脈沖激光控制釋放，從而控制基因和藥物的時序性釋放。本發(fā)明所用金納米球殼結(jié)構(gòu)或帶孔洞的金納米球殼結(jié)構(gòu)可以用以前研究者所用方法，可以以陰離子脂質(zhì)體為模板制備金納米球殼結(jié)構(gòu)時，將O. 5-1. 5umol的DMPA和DMPC按照1:1的比例溶解在ImL氯仿和甲醇的混合溶液中，在脂質(zhì)體形成過程中加入親水性的藥物鹽酸阿霉素，使鹽酸阿霉素濃度為30mM，加入1-1. 5mg的陽離子聚合物(聚組氨酸或者聚賴氨酸)，加入10-15uL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯金酸和2倍體積濃度為20mM的鹽酸羥胺，形成載藥的金納米球殼結(jié)構(gòu)；利用模板法制備金納米孔洞結(jié)構(gòu)時，用置換法形成金納米孔洞結(jié)構(gòu)，在600mL濃度為O. 2mM硝酸銀溶液中加入O. 6-lmL濃度為I. OM NaBH4和O. 5mM檸檬酸鈉水溶液，將溶液攪拌幾個小時，再往溶液里加入O. 6-lmL的2. OM鹽酸羥胺和I. 5mL的O. IM的硝酸銀溶液，攪拌過夜，形成比較大的銀顆粒?？焖賹?. 8-5mL濃度為25mM的HAuCl4溶液和銀納米粒子混合，得到金納米球孔洞結(jié)構(gòu)，將溶液避光保存一星期。將上述得到的溶液用20000分子量的透析卡在1500mL的500uM的檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=5. 5)中透析提純，得到金納米球孔洞結(jié)構(gòu)的溶液。然后加入鹽酸阿霉素，使得鹽酸阿霉素濃度為40-50nM，加入三乙胺，使得三乙胺的濃度為40-50nM，形成載藥的金納米孔洞結(jié)構(gòu)。本發(fā)明利用陽離子性聚合物聚組氨酸在金納米球殼結(jié)構(gòu)的表面負(fù)載基因，用Immol的Traot’ s試劑與l_2mg聚組氨酸反應(yīng),修飾出巰基,利用巰基與金的反應(yīng),將反應(yīng)后的聚組氨酸加入O. 5-1. 5mL的金納米球殼溶液中，聚組氨酸的側(cè)基咪唑基帶正電，而基因帶負(fù)電，因此分別將2倍，8倍，16倍，3 2倍，6 4倍載藥的金納米球殼溶液與等量as-micro-RNA-21或者Danio rerio microRNA 146b_l溶液混合時，可以得到復(fù)合物·聚組氨酸修飾巰基的反應(yīng)為
權(quán)利要求
1.制備具有基因藥物時序性釋放性能的金納米球殼結(jié)構(gòu)載體，其特征是金納米球殼內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)載藥，藥物通過脈沖激光激發(fā)釋放，球殼外面接陽離子聚合物來負(fù)載帶負(fù)電的基因，在細(xì)胞中自行釋放。
2.如權(quán)利要求I所述載體，其特征是用來負(fù)載基因的陽離子聚合物是聚組氨酸，分子量大于5000。
3.如權(quán)利要求I所述載體，其特征是用來負(fù)載的基因為20-100個堿基的RNA。
4.構(gòu)建權(quán)利要求I的具有基因藥物時序性釋放性能的金納米球殼結(jié)構(gòu)的方法，其特征是步驟如下 a.將總物質(zhì)的量為0.5-1. 5umol的二肉豆蘧酰磷脂酸和二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿按照1:1的比例溶解在ImL氯仿和甲醇的混合溶液中，在脂質(zhì)體形成過程中加入親水性的藥物鹽酸阿霉素，使得鹽酸阿霉素的濃度為30nM，加入1-1. 5mg的陽離子聚合物聚組氨酸或者聚賴氨酸，加入10-15uL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯金酸溶液和20-30uL濃度為20mM的鹽酸羥胺，形成載藥的金納米球殼結(jié)構(gòu)； b.用Immol的Traut’s試劑與l_2mg聚組氨酸反應(yīng),修飾出巰基,利用巰基與金的反應(yīng)，將反應(yīng)后的聚組氨酸加入0. 5-1. 5mL的金納米球殼溶液中，聚組氨酸的側(cè)基咪唑基帶正電，而基因帶負(fù)電，因此分別將2倍，8倍，16倍，32倍，64倍載藥的金納米球殼溶液與等量as-micro-RNA-21或者Danio rerio microRNA 146b_l溶液混合時，可以得到復(fù)合物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所述的步驟a為 在600mL濃度為0. 2mM硝酸銀溶液中加入0. 6_lmL濃度為I. OM硼氫化鈉和0. 5mM檸檬酸鈉水溶液，將溶液攪拌均勻，再往溶液里加入0. 6-lmL的2. OM鹽酸羥胺和I. 5mL的0. IM的硝酸銀溶液，攪拌過夜，形成比較大的銀顆粒?？焖賹?. 8-5mL濃度為25mM的氯金酸溶液和銀納米粒子混合，得到金納米球孔洞結(jié)構(gòu)，將溶液避光保存一星期。將上述得到的溶液用20000分子量的透析卡在1500mL的500uM的檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=5. 5)中透析提純，得到金納米球孔洞結(jié)構(gòu)的溶液。然后加入鹽酸阿霉素，使得溶液中鹽酸阿霉素濃度為40-60nM，加入三乙胺，使得溶液中三乙胺的濃度為40-60nM，形成載藥的金納米孔洞結(jié)構(gòu)。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有基因藥物程序性釋放性能的金納米球殼載體及制備方法，球殼里面載藥物，球殼外面修飾陽離子聚合物，用來負(fù)載基因。陽離子聚合物負(fù)載的基因進(jìn)入細(xì)胞可以釋放，球殼里載的藥物可以通過激光激發(fā)釋放，實現(xiàn)基因藥物的時序性釋放。金納米球殼結(jié)構(gòu)可以以脂質(zhì)體為模板制備，將脂質(zhì)體載鹽酸阿霉素的親水抗癌藥，然后在脂質(zhì)體的表面沉積一層金，形成載藥的金納米球殼結(jié)構(gòu)?；蛴勉y置換法，得到金納米球孔洞結(jié)構(gòu)，再進(jìn)行載藥。利用Traut’s試劑和聚組氨酸的氨基反應(yīng)，讓聚組氨酸的一段帶巰基，然后接在金納米球殼的表面，利用靜電作用負(fù)載基因。構(gòu)建的以金納米球殼為載體的時序性藥物基因釋放系統(tǒng)為藥物和基因的時序性治療提供了一個較好的平臺。
文檔編號A61K47/34GK102805870SQ20121016812
公開日2012年12月5日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者高立章, 劉貴高, 原續(xù)波, 何芳 申請人:天津大學(xué)