專利名稱：家蠶基因工程生產(chǎn)重組人巨噬細(xì)胞集落刺激因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中的基因工程生產(chǎn)多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域。
人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hM-CSF)是一種重要的造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子。它對(duì)巨噬細(xì)胞的分化、增殖及成熟后的功能具有特異的刺激作用。同時(shí)它也是一種免疫效應(yīng)劑，能促進(jìn)和誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞分泌干擾素、腫瘤壞死因子、白介素-1、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、前列腺素及纖溶酶原激活劑等，有效地增強(qiáng)巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中的抗炎癥作用。臨床上主要應(yīng)用于促進(jìn)造血功能的恢復(fù)。如放療化療后的白細(xì)胞減少或骨髓移植造成的骨髓發(fā)育不良;增強(qiáng)機(jī)體抗感染、抗腫瘤的防御能力，對(duì)治療某些致死性真菌病和某些病毒病特別有效;此外，還能選擇性地降低血清中的低密度脂蛋白，用于抗動(dòng)脈硬化。國(guó)外基因工程生產(chǎn)的rhM-CSF已進(jìn)入Ⅲ期臨床。1985年美國(guó)Cetus公司首先分離到hM-CSF的短鏈cDNA基因(Science(1985)230291)，并在COS細(xì)胞中表達(dá)出有活性的rhM-CSF，但表達(dá)水平僅為2×103單位/毫升，隨后不同實(shí)驗(yàn)室相繼從大腸桿菌、酵母或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)獲得rhM-CSF。但表達(dá)水平一般在10毫克/升。1988年Cetus公司采用大規(guī)模高密度培養(yǎng)的草地貪夜蛾(S.F)細(xì)胞，使rhM-CSF在培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)量達(dá)到40毫克/升。(Biotechnology(1988)61406)。但成本偏高。不利于投入生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的是利用我國(guó)資源來(lái)源十分廣泛便宜的家蠶為原料，代替大腸桿菌或酵母發(fā)酵，或昆蟲SF培養(yǎng)細(xì)胞，從家蠶幼蟲的血淋巴中大量表達(dá)rhM-CSF，表達(dá)水平可達(dá)250毫克/升，并創(chuàng)造一條簡(jiǎn)便可行的工藝，從家蠶血淋巴中分離純化出比活大于107單位/毫克，純度98%的rhM-CSF精品。使整個(gè)工藝成本大為降低，成為一條更適于大規(guī)模生產(chǎn)可供臨床應(yīng)用的rhM-CSF生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容包括1.家蠶基因工程表達(dá)載體-帶hM-CSF(1-149aa)的重組家蠶核型多角體病毒BmNPV-M-CSF的構(gòu)建;2。重組病毒對(duì)家蠶幼蟲的感染及rhM-CSF在家蠶血淋巴中的高效表達(dá)和分泌;3.從家蠶血淋巴中分離純化rhM-CSF的精品。
1.天然的hM-CSF具有長(zhǎng)中短三種型式，它們的cDNA基因具有相同的信號(hào)肽(32個(gè)氨基酸)和N端第1-149位氨基酸密碼子.據(jù)此，我們?cè)O(shè)計(jì)的rhM-CSF基因?yàn)楹型暾奶烊恍盘?hào)肽(32個(gè)氨基酸包括起始密碼ATG)和基因第1-149位氨基酸密碼子及終止密碼的DNA片段。具體合成過(guò)程與重組病毒的構(gòu)建過(guò)程如下hM-CSF信號(hào)肽質(zhì)粒含有hM-CSF信號(hào)肽32個(gè)氨基酸及基因第1-6位氨基酸密碼子，經(jīng)化學(xué)合成后克隆于pUC18的EcoRI、PstI位點(diǎn)中，由中科院上海生物工程研究中心合成提供。另以hM-CSF的長(zhǎng)鏈cDNA基因片段為模板，用PCR法合成5′端帶EcoRI位點(diǎn)3′端帶終止密碼及Hind Ⅲ位點(diǎn)的含hM-CSF基因第3-149位密碼子的基因片段，克隆于M13mp18之EcoRI、Hind Ⅲ位點(diǎn)中。利用hM-CSF基因第6密碼子中的ScaI位點(diǎn)，將信號(hào)肽與基因片段拼接成5′端有EcoRI位點(diǎn)，含信號(hào)肽32個(gè)密碼子、基因第1-149位密碼子及終止密碼，3′端有Hind Ⅲ位點(diǎn)的分泌型短基因，克隆于pUC18的EcoRI、Hind Ⅲ位點(diǎn)中。經(jīng)序列分析證明序列正確，ScaI位點(diǎn)恢復(fù)。上述質(zhì)粒經(jīng)擴(kuò)增純化后用EcoRI、Hind Ⅲ雙酶解切出帶信號(hào)肽及N端1-149位密碼子的rhM-CSF基因片段，用klenow酶補(bǔ)平后插入至家蠶轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBE284(S.Maeda提供)之補(bǔ)平的XbaI位點(diǎn)中.限制酶分析篩選出重組方向正確-即多角體基因啟動(dòng)子與基因編碼方向一致的表達(dá)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBE-M-CSF。擴(kuò)增純化后與純化的野生型家蠶核型多角體病毒Bm NPV(C6株)的基因組DNA混合，經(jīng)脂質(zhì)體(Lipofectin)共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的單層家蠶細(xì)胞Bm N.27℃，培養(yǎng)7天后在瓊脂板上用原位雜交篩選出陽(yáng)性重組病毒空斑。再經(jīng)4次以上96孔板有限稀釋法純化病毒。并結(jié)合測(cè)定集落刺激活性選出高水平表達(dá)rhM-CSF的不含野生型病毒的純凈重組病毒BmNPV-M-CSF。
2.重組病毒感染家蠶幼蟲及表達(dá)rhM-CSF的家蠶血淋巴的收獲純化后的重組病毒以感染指數(shù)(MOI)＝0.1空斑形成單位(PFU)/細(xì)胞感染單層培養(yǎng)的BmN細(xì)胞，27℃培養(yǎng)4-5天后，4000轉(zhuǎn)/分離心棄細(xì)胞收集上清液作為毒種。毒種液滴度為107CFU/ml。用天然桑葉或人工飼料飼養(yǎng)的家蠶，5齡起眠后第1天，以10微升(105PFU)/蟲毒種腹部注射或穿刺感染重組病毒。繼續(xù)飼養(yǎng)4-5天后，剪腹足加一倍體積抗氧劑保護(hù)液(1mMDTT，10mM抗壞血酸)防止血淋巴黑化，離心8，000-10，000轉(zhuǎn)/分，4℃，20分鐘或低溫壓濾收集血淋巴。血淋巴可在-20℃存放。測(cè)定血淋巴的集落刺激活性可達(dá)2-3×106集落刺激單位(CFU)/ml。
3.從家蠶血淋巴中分離純化rhM-CSF上述方法收集的家蠶血淋巴，在70℃水浴保溫15分鐘，8，000轉(zhuǎn)/分離心除去熱處理沉淀的雜蛋白。上清液對(duì)pH6.0，0.05M NaAc緩沖液透析，上DEAE 52柱，柱子預(yù)先用樣品緩沖液平衡.先用0.05M NaAc，0.05M NaCl，pH6.0緩沖液充分洗滌，然后用pH6.0，0.05M NaAc，0.2M NaCl緩沖液洗脫rhM-CSF。收集洗脫液對(duì)pH6.5，3mM磷酸鈉緩沖液透析，上預(yù)先平衡的羥基磷灰石柱子。先用10mM，pH6.5磷酸鈉緩沖液充分洗滌，再用50mM，pH6.5，磷酸鈉緩沖液洗脫rhM-CSF。收集洗脫液透析濃縮后，于低壓液相層析系統(tǒng)上經(jīng)SP柱離子交換層析。用pH4.5，0.02M NaAc緩沖液鹽濃度梯度0-0.5M NaCl進(jìn)行梯度洗脫，梯度時(shí)間30分鐘，流速1ml/分，rhM-CSF洗脫峰位于20-25分鐘區(qū)段.收集該區(qū)段rhM-CSF洗脫液，透析脫鹽后凍干保存。
本發(fā)明構(gòu)建的重組家蠶核型多角體病毒BmNPV-M-CSF，其中帶完整信號(hào)肽的hM-CSF基因(1-149)位于BmNPV的強(qiáng)大的多角體基因啟動(dòng)子控制下，多角體基因被hM-CSF基因所取代。在家蠶的培養(yǎng)細(xì)胞、幼蟲或蛹體內(nèi)，隨著重組病毒的感染和復(fù)制，rhM-CSF能高效表達(dá)并分泌至細(xì)胞外。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)免疫印跡法(western-blotting)檢定，產(chǎn)生的rhM-CSF為糖基化程度不同分子量分別為18、20、22KD三種免疫特異性及生物活性相似的蛋白。精品經(jīng)N末端分析N端十個(gè)氨基酸序列為Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Ser-His-Met，表明rhM-CSF的天然信號(hào)肽在表達(dá)分泌過(guò)程中已被正確地切除。
采用本發(fā)明構(gòu)建的重組病毒按本發(fā)明所述方法感染家蠶幼蟲和收集血淋巴，家蠶血淋巴中表達(dá)積累的rhM-CSF可達(dá)3×106CFU/ml，按精品比活1.2×107CFU/mg折算，表達(dá)量為250mg/L。實(shí)現(xiàn)了rhM-CSF的高效表達(dá)。
按本發(fā)明的技術(shù)路線，熱處理可簡(jiǎn)便有效地滅活家蠶血淋巴中存在的大量酪氨酸氧化酶，防止了黑化并除去一部分易熱變性的雜蛋白。按本發(fā)明提供的分離純化方法可以從家蠶感染重組病毒后采集的血淋巴中獲得純化程度基本符合基因工程制藥要求的rhM-CSF精品。rhM-CSF精品比活達(dá)1.2×107CFU/mg以上。在高壓液相層析(HPLC)系統(tǒng)TSK2000SW分子篩柱上分析呈一個(gè)主峰，純度＞98%。用SDS-PAGE銀染法檢測(cè)，無(wú)明顯的雜蛋白電泳區(qū)帶。rhM-CSF精品臨床可用于生產(chǎn)抗真菌、抗病毒感染、抗腫瘤及升白血球等藥物。
下面是
具體實(shí)施例方式1.rhM-CSF在不同家蠶幼蟲中的表達(dá)。以5齡家蠶幼蟲，品種蘇5×蘇6，每批5，000條為材料，以M.O.I＝105PFU/蟲的劑量注射感染重組病毒，第4天剪去一對(duì)腹足，加一倍體積抗氧劑溶液(1mMDTT，10mM抗壞血酸)，離心8，000轉(zhuǎn)/分，4℃，20分鐘，收集血淋巴。第5天家蠶幼蟲開始大批死亡。將收集的血淋巴存放于-20℃。血淋巴測(cè)定集落刺激活性，1993年春蠶二批的平均表達(dá)水平為2×106CFU/ml血淋巴原液。93年秋蠶二批平均表達(dá)水平為3×106CFU/ml血淋巴原液，約合250微克/毫升。
單層培養(yǎng)的家蠶細(xì)胞BmN，在接近匯合時(shí)，以MOI＝10PFU/細(xì)胞劑量感染重組病毒BmNPV-M-CSF，感染后27℃繼續(xù)培養(yǎng)，第6天培養(yǎng)液中rhM-CSF的表達(dá)量達(dá)10-14×104CFU/ml(3×105細(xì)胞)。
2.取家蠶血淋巴表達(dá)液100ml，加抗氧劑液稀釋1倍后，70℃保溫15分鐘，8，000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄雜蛋白沉淀取上清液。對(duì)pH6.0，0.05M NaAc緩沖液透析后，上DEAE52柱(16mm×200mm)，柱子預(yù)先用樣品緩沖液平衡。先用三倍床體積之pH6.0，0.05M，NaAc，洗滌，然后用pH6.0，0.05M NaAc。0.2M NaCl緩沖液洗出rhM-CSF，收集洗出液。柱子用pH6.0，0.05M NaAc，0.05M NaCl緩沖液洗除雜蛋白，再生平衡后再使用。rhM-CSF洗出液對(duì)pH6.5，3mM磷酸鈉緩沖液透析后，上預(yù)先平衡的羥基磷灰石柱。先用三倍床體積pH6.5，10mm磷酸鈉緩沖液洗滌，而后用pH6.5，50mM磷酸鈉緩沖液洗出rhM-CSF組分。留存的雜蛋白可用0.5M磷酸緩沖液洗凈后再生平衡待用。收集的rhM-CSF洗出液經(jīng)透析脫鹽濃縮后，于Waters 650E蛋白純化系統(tǒng)上經(jīng)SP離子交換柱層析(FPLC)。選擇梯度緩沖液為pH4.5，0.02M NaAc，0-0.5M Nacl，梯度時(shí)間30分鐘，流速1ml/分.收集20-25分鐘區(qū)段rhM-CSF洗出峰。上述rhM-CSF洗出液經(jīng)透析脫鹽后，冷凍干燥分裝成rhM-CSF精品。分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量和集落刺激活性，算出精品比活為1.2×107CFU/mg。HPLC測(cè)定純度＞98%。整個(gè)分離純化過(guò)程純化倍數(shù)為200倍以上?；钚缘寐蚀笥?0%。
按本發(fā)明所述方法每一萬(wàn)條秋蠶可得血淋巴表達(dá)液約6升，可提取rhM-CSF精品約500毫克。
權(quán)利要求
1.一種基因工程人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhM-CSF)的生產(chǎn)方法，其特征是以家蠶為原料，通過(guò)帶人rhM-CSF基因的重組家蠶核型多角體病毒(BmNPV-M-CSF)為載體，在感染重組病毒的家蠶血淋巴中大量表達(dá)rhM-CSF，并從家蠶血淋巴中分離純化rhM-CSF精品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1.所述的方法其所用的重組病毒載體的構(gòu)建特征是，將化學(xué)法合成的hM-CSF信號(hào)肽片段與PCR法合成的人M-CSF基因片段，經(jīng)體外重組拼接成含人M-CSF信號(hào)肽32個(gè)密碼子和基因第1-149位密碼子及終止密碼、兩端有適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)的分泌型rhM-CSF基因片段，通過(guò)平頭連接插入家蠶轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBE284中補(bǔ)平的XbaI位點(diǎn)，選出重組方向正確即多角體基因啟動(dòng)子與rhM-CSF基因編碼方向一致的表達(dá)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBE-M-CSF，擴(kuò)增純化后再與純凈的野生型家蠶核型多角體病毒(BmNPV)C6株的基因組DNA混合，經(jīng)脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的單層家蠶細(xì)胞BmN，再經(jīng)多次病毒的純化篩選出高水平表達(dá)rhM-CSF的純凈重組病毒BmNPV-M-CSF。
3.根據(jù)權(quán)利要求1.，2.所述的方法，從感染重組病毒的家蠶血淋巴中表達(dá)和分離純化rhM-CSF的特征是，用重組病毒10微升毒種(105PFU/蟲)腹部注射或穿刺感染5齡家蠶幼蟲，剪腹足加抗氧劑保護(hù)后，離心收集血淋巴，然后經(jīng)熱處理→DEAE52柱→羥基磷灰石柱→FPLC(SP柱)逐步純化。獲得比活大于1.2×107集落刺激單位(CFU)/毫克，純度達(dá)98%以上(HPLC分析)的rhM-CSF精品，活性得率為30%以上。
4.本方法生產(chǎn)的rhM-CSF產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)特征是其氨基酸序列與天然人M-CSF第1-149位氨基酸相同，N端第1位是谷氨酸殘基，產(chǎn)物為三種糖基化程度不同分子量分別是18、20、22KD的蛋白質(zhì)混合物。臨床可用于生產(chǎn)抗真菌、抗病毒感染、抗腫瘤及升白血球等藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中的基因工程生產(chǎn)多肽藥物的技術(shù)領(lǐng)域，其目的是利用我國(guó)資源十分豐富的家蠶為原料，從家蠶幼蟲中的血淋巴中大量表達(dá)rhM-CSF，表達(dá)水平可達(dá)250毫克/升，rhM-CSF基因?yàn)楹型暾奶烊恍盘?hào)肽和基因第1—149位氨基酸密碼子及終止密碼的DNA片段。并從家蠶血淋巴中分離純化出比活大于10
文檔編號(hào)A61K38/00GK1096541SQ9411122
公開日1994年12月21日 申請(qǐng)日期1994年1月24日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月24日
發(fā)明者秦浚川, 邱平, 朱德煦, 丁益, 朱潔, 施曉青 申請(qǐng)人:南京大學(xué)