專利名稱：血調(diào)節(jié)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有血調(diào)節(jié)活性并可用于刺激骨髓生長及治療病毒、真菌和細菌感染性疾病的新的肽。
有多種調(diào)節(jié)信使及修飾劑如集落刺激因子、干擾素及不同類型的肽具有調(diào)節(jié)骨髓生長的作用[Metcalf，Cell，43∶5(1985);Baserga R.，F(xiàn)oa P.，Metcalf D，Polli EE(eds)，Biological Regulation of Cell Proliferation(1986);Nicola et al.，J.Cell Physiol.128∶501(1986)，Zoumbos et al.，Proyr Hemat.1∶341 and 14∶201(1986);Werner et al.，Experientia 42∶521(1986)]。20多年前，Rytomaa and Kivieniemi(Cell Tissue Kinet 1∶329-340(1968))、Rytomaa等人(Control of Cellular Growth in Adult Organisms pp.106-138(1967))曾報導(dǎo)成熟粒細胞的提取物(粒細胞抑制素)在可特異地抑制復(fù)蓋滑動培養(yǎng)物中的大鼠骨髓生長細胞增殖。后來他們證明這種分子量小于3，000道爾頓的因子能夠誘導(dǎo)可移植大鼠粒細胞白血病的消退，并阻止人白血病細胞的生長。
Paukovits和其他一些研究者從大鼠骨髓細胞內(nèi)提取了一種類似因子并證明它能抑制骨髓細胞對滴定的胸苷的攝入(Paukovits，W.R.，Cell Tissue Kinet 4∶539-547(1971);Naturforsch37∶1297(1982))。1979年，Boll等人(Acta Haematologica 6∶130，1979)證明了大鼠粒細胞提取物對培養(yǎng)物中人骨髓細胞的抑制作用，許多其他研究者則證明該粒細胞粗提取物能在體外抑制嚙齒動物骨髓細胞中之g-CFUC和/或gm-CFUC的發(fā)育。
從理論概念上說，該稱為粒細胞抑制素的生物學(xué)制劑應(yīng)是一種作用于分泌它的同一組織的內(nèi)源性細胞增殖抑制劑。發(fā)現(xiàn)從粗提取物中得到的這種物質(zhì)沒有種特異性，但具有很高的組織特異性，而且無毒并具有可逆的活性。
1982年，有人報道了一種合成的血調(diào)節(jié)五肽可于體外和體內(nèi)選擇性地抑制骨髓生長細胞，且似乎主要是作用于骨髓生長干細胞(CFU-gm)(參見Paukovits et al.，Z.Naturforsch 37∶1297，1982和美國專利4，499，081號)。據(jù)信該肽是以很小量見于骨髓提取物中的天然存在的粒細胞生長抑制因子。
1987年，Laerum等人報導(dǎo)該肽的氧化產(chǎn)物是靠二硫橋鍵形成的二聚體(HP-5)。該二聚體具有與單體相反的作用，即在體外可強烈地刺激人和小鼠CFU-gm集落形成，并在體內(nèi)可向上調(diào)節(jié)小鼠骨髓生長細胞。歐洲專利申請87309806.5中提出要求專利保護該二聚體。
據(jù)報導(dǎo)，該二聚體可用于刺激骨髓細胞生長活性降低者的骨髓細胞生長，包括用于治療骨髓損傷、粒細胞缺乏及因免疫抑制治療以抑制組織排斥反應(yīng)，即骨髓移植外科引起的骨髓功能降低在內(nèi)的再生障礙性貧血。該二聚體也可用于在對腫瘤和病毒性疾病進行細胞靜止化學(xué)治療和放射治療后促進骨髓的迅速再生。對于因骨髓損傷后缺乏免疫反應(yīng)而發(fā)生嚴重感染的病人也有特殊的治療價值。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，某些對骨髓生長細胞有刺激作用的新的合成肽可用于治療和預(yù)防病毒、真菌及細菌性疾病。
本發(fā)明包括由下列式(Ⅰ)代表的肽，這些肽具有血液調(diào)節(jié)活性，可用于刺激造血機能并預(yù)防和治療細菌、病毒和真菌感染性疾病。
這些肽用于因手術(shù)所致的骨髓抑制、AIDS、ARDS、先天性骨髓發(fā)育不良、骨髓和器官移植等各種臨床狀態(tài)引起的白細胞計數(shù)降低病人，使其恢復(fù)白細胞計數(shù);保護白細胞減少病人免于遭受感染;治療嚴重?zé)齻∪思案纳埔蛴媚承┘毎芷谔禺愋钥共《緞┲委煿撬枰浦膊∪耍貏e是患移植物抗宿主性疾病者所引起的骨髓抑制;以及治療結(jié)核病人及動物的不明原因性發(fā)熱。該肽也可用于治療和預(yù)防病毒、真菌及細菌性感染性疾病，特別是處于免疫抑制和“正?！睜顟B(tài)的念珠菌、皰疹及肝炎感染者。
這些化合物也可與共同待批美國專利申請No.07/799465和美國專利No.4499081(已列為本文參考文獻)中介紹的單體聯(lián)合使用，以提供骨髓細胞內(nèi)高或低活性峰的交替出現(xiàn)，從而放大造血功能的天然生理節(jié)律。這樣便可在低骨髓活性期進行細胞靜止治療，以減小骨髓損傷的危險性，此時相續(xù)出現(xiàn)的活性峰將會促進骨髓再生。本發(fā)明還包括含有式(Ⅰ)化合物及醫(yī)藥上可接受之載體的藥物組合物。
本發(fā)明進一步建立了一種刺激包括人在內(nèi)的動物骨髓生長系統(tǒng)的方法，包括給需要治療的動物使用有效量的式(Ⅰ)化合物。
本發(fā)明還建立了預(yù)防和治療處于免疫抑制和正常狀態(tài)之動物(包括人)的病毒、真菌及細菌感染的方法，包括給需要進行治療的動物服用有效量的式(Ⅰ)化合物。
本發(fā)明的肽是由下列式(Ⅰ)代表的肽及其醫(yī)藥上可接受的鹽
其中Y1和Y2分別是CH2或S;
x是0，1，2，3或4;
m是0，1或2;
n是0，1或2;
A是2-噻吩羧酸、吡啶甲酸、環(huán)己烷羧酸、四氫-2-糠酸、四氫-3-糠酸、2-氧-4-噻唑烷羧酸、環(huán)戊烷羧酸、3-噻吩羧酸、(S)-(+)-5-氧-2-四氫呋喃羧酸、2-哌啶酸、吡咯羧酸、異吡咯羧酸、吡唑羧酸、異咪唑羧酸、三唑羧酸、二硫雜環(huán)戊二烯羧酸、氧硫雜環(huán)戊二烯羧酸、異噁唑羧酸、噁唑羧酸、噻唑羧酸、異噻唑羧酸、噁二唑羧酸、噁三唑羧酸、氧硫雜環(huán)戊二烯羧酸、噁嗪羧酸、噁噻唑羧酸、二噁唑羧酸、吡喃羧酸、嘧啶羧酸、吡啶羧酸、噠嗪羧酸、吡嗪羧酸、哌嗪羧酸、三嗪羧酸、異噁嗪羧酸、氧硫氮雜烯(oxathiazene)羧酸、嗎啉羧酸、吲哚羧酸、吲哚恩(indolenene)羧酸、2-異吲哚羧酸、1，5-吡啶羧酸、吡喃并[3，4-b]吡咯羧酸、異吲哚羧酸、吲噁嗪羧酸、苯并噁唑羧酸、苯鄰甲內(nèi)酰胺羧酸、喹啉羧酸、異喹啉羧酸、噌啉羧酸、喹唑啉羧酸、1，5-二氮雜萘羧酸、吡啶并[3，4-b]吡啶羧酸、吡啶并[3，2-b]吡啶羧酸、吡啶并[4，3-b]吡啶羧酸、1，3，2-苯并噁嗪羧酸、1，4，2-苯并噁嗪羧酸、2，3，1-苯并噁嗪羧酸、3，1，4-苯并噁嗪羧酸、1，2-苯并異噁嗪羧酸、1，4-苯并異噁嗪羧酸、咔唑羧酸、吖啶羧酸、或嘌呤羧酸;
B是絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;
C是谷氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸、β-丙氨酸或肌氨酸;
D是賴氨酸、精氨酸、酪氨酸、N-甲基精氨酸、天冬氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸、b-丙氨酸、肌氨酸或二氨基己炔酸;或羧酰胺或其羥甲基衍生物;
E是谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸或肽鍵;
F是酪氨酸或肽鍵;
或者其中Y1、Y2、x、m、n、C、D、F如上定義;
A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、或谷氨酸，而B是絲氨酸;
或其中Y1、Y2、x、m、n、D和F如上定義;
A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸;
B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;而C是絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或纈氨酸。
或者其中Y1、Y2、x、m、n和F如上定義;
A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸;
B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;
C是絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或纈氨酸;而D是鳥氨酸;
或者其中Y1、Y2、x、m和n如上定義;
A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸;
B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;
C是絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或纈氨酸;
D是鳥氨酸;而F是酪氨酸。
所有上述這些定義的條件是·當(dāng)Y1和Y2是S時，x是2，3或4，且m和n是1;或·當(dāng)Y1和Y2是CH2時，x是0，1或2，且m和n是0;或·當(dāng)Y1是S和Y2是CH2時，x是0且n是1，或·當(dāng)Y2是S和Y1是CH2時，則x是0且m是1;
·如果當(dāng)C選自于絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸或肌氨酸時，則D便選自于絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸或肌氨酸。
本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的適于藥用的鹽配合物。應(yīng)當(dāng)注意的是，式(Ⅰ)中A含末端氨基基團，同時D含有末端羧基或羧酰胺基團或其羥甲基衍生物。
本文使用本技術(shù)領(lǐng)域常用縮寫字和符號來描述該肽Ala＝丙氨酸pGlu＝焦谷氨酸Pro＝脯氨酸
Glu＝谷氨酸Asp＝天冬氨酸Tyr＝酪氨酸Pic＝吡啶甲酸Ppc＝二哌啶酸Ppg＝炔丙基甘氨酸Gly＝甘氨酸Orn＝鳥氨酸P-(NH2)Phe＝對-氨基苯丙氨酸Hna＝2，6-二氨基-4-己炔酸Lys＝賴氨酸Gln＝谷氨酰胺Arg＝精氨酸Cys＝半胱氨酸Sub＝二氨基辛二酸Pim＝二氨基庚二酸Ser＝絲氨酸Nle＝正亮氨酸Adp＝二氨基己二酸Chc＝環(huán)己烷羧酸Tfc＝四氫-2-糠酸Otz＝2-氧代-4-噻唑烷Cpa＝環(huán)戊烷Tpc＝3-噻吩羧酸
S-otf＝(S)-(+)-5-氧代-2-四氫呋喃羧酸·R-otf＝(R)-(-)-5-氧代-2-四氫呋喃羧酸按照常規(guī)表示法，氨基末端在左邊而羧基末端在右邊。所有手性氨基酸都可以是D或L絕對構(gòu)型。所有旋光異構(gòu)體都考慮在內(nèi)。
氨基末端都經(jīng)酰化作用加以保護。這些保護基的例子是叔丁氧羰基(t-Boc)，CH3CO和Ar-CO(Ar＝苯甲基或苯基)。
C-末端如天然氨基酸一樣可以是羧基，或可以是羧酰胺-C(O)NH2或羥甲基(-CH2-OH)衍生物。
優(yōu)選化合物是其中A為焦谷氨酸、吡啶甲酸、脯氨酸、酪氨酸或2-哌啶酸;
B為谷氨酸、絲氨酸、天冬氨酸或酪氨酸;
C為天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、或賴氨酸;
D為賴氨酸或其羧酰胺衍生物、精氨酸、N-甲基精氨酸、2，6-二氨基-4-己炔酸、天冬氨酸或鳥氨酸;
E為化學(xué)鍵;
Y1和Y2是CH2;
x是0或2;
m和n是0的化合物。
更優(yōu)選以下化合物是其中A為焦谷氨酸、脯氨酸或吡啶甲酸;
B為谷氨酸、天冬氨酸或絲氨酸;
C為天冬氨酸或谷氨酸;
D為賴氨酸或其羧酰胺衍生物;
E是化學(xué)鍵;
F是化學(xué)鍵;
Y1和Y2是CH2，且x是0或2，以及手性氨基酸為L絕對構(gòu)型的化合物。
特別優(yōu)選的是(Pic-Glu-Asp)2Sub(Lys)2[SEQ ID NO1](L-Ppc-Glu-Asp)2Sub(Lys)2[SEQ ID NO2](pGlu-Ser-Asp)2Sub(Lys)2[SEQ ID NO3](pGlu-Ser-Asp)2Adp(Lys)2[SEQ ID NO4](pGlu-Ser-Asp)2Adp(Lys-NH2)2[SEQ ID NO5](Pic-Ser-Asp)2Adp(Lys)2or [SEQ ID NO6](Pic-Ser-Asp)2Adp(Lys-NH2)2[SEQ ID NO7](pGlu-Glu-Asp)2Adp(Tyr-Lys)2[SEQ ID NO8](Pic-Glu-Asp)2Adp(Lys)2[SEQ ID NO9](Pic-Glu-Asp)2Adp(Lys-NH2)2[SEQ ID NO10]本發(fā)明的肽用Merrifield的固相技術(shù)制備(J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1964))，或可成功地采用本技術(shù)領(lǐng)域已知的溶液法來制備。
記載于J.M.Stewart和J.D.Young的“Solid Phase Peptide Synthesis(Pierce Chemical Company，Rockford，I L(1984))一書，或M.Bodansky，Y.A.Klauser和M.A.Ondetti的“Peptide Synthesis”(John Wiley & Sons.Inc.，New York，NY.(1976))一書中有關(guān)肽的一般合成法均可用于生產(chǎn)本發(fā)明的肽，這些文獻列入本文作為參考文獻。
每種氨基酸或肽均可按肽合成領(lǐng)域中已知方法適當(dāng)加以保護。例如，最好用α-芴基甲氧基羰基(Fmoc)或叔丁氧基羰基(t-Boc)保護氨基，特別是α位的氨基?？捎眠m當(dāng)取代的苯酯基保護賴氨酸的ε-氨基，而芐基則可分別用于保護Asp和Glu的β和γ羧基。適當(dāng)取代的苯酯基保護基團是以氯、溴、硝基或甲基于鄰位和/或?qū)ξ蝗〈?，用于修飾保護基團的反應(yīng)活性。除了t-Boc基團外，最常用的是用弱酸處理時不會被除去的那些保護基。這些保護基可用催化加氫，液氨中的鈉或HF處理這類本領(lǐng)域已知方法來除去。
假如采用固相合成法，則從肽的羧基末端起始，朝氨基末端方向逐步合成該肽?？赏ㄟ^將經(jīng)保護的氨基酸的C末端共價連接到一種適當(dāng)?shù)臉渲弦蚤_始固相合成，這些樹脂例如是二苯甲基胺樹脂(BHA)、甲基二苯甲基胺樹脂(MBHA)或氯甲基樹脂(CMR)，(如記載于U.S專利No.4244946中的一般樹脂)或苯基酸氨基甲基樹脂(PAM)。如果欲使產(chǎn)品肽的羧基末端為羧酰胺，則可使用BHA或MBHA載體樹脂。如果欲使產(chǎn)品肽的羧基末端為羧基基團，則一般可采用ACMR或PAM樹脂(但該類樹脂也可用于產(chǎn)生羧酰胺或酯)。
用弱酸(即三氟醋酸)處理除去α-氨基上的保護基團。使用本技術(shù)領(lǐng)域中已知的適當(dāng)去保護反應(yīng)，中和反應(yīng)及偶合反應(yīng)循環(huán)連續(xù)加成氨基酸而無需分離中間產(chǎn)物，直至形成所需之肽為止。然后使完成的肽去封閉和/或按任何順序從載體樹脂上裂解下來。
用HF或HBr/醋酸處理載肽樹脂，使肽從樹脂上裂解下來，并產(chǎn)生以羧酸或羧酰胺的形式存在的羧基末端氨基酸。
如果要想得到一種酯，可以于三乙胺存在下用適當(dāng)?shù)拇?、例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或苯甲醇處理之，使肽從樹脂上裂解下來并直接得到酯?br> 也可以從其前體羧酸以常規(guī)方法制備本發(fā)明肽的酯。一般情況下，在有酸催化劑存在下用醇處理該羧酸即可。此外，羧酸也可轉(zhuǎn)化為活化的酰基中間體，如酰鹵，并最好在堿存在下用醇處理之。
從載體樹脂上裂解肽的優(yōu)選方法是于適當(dāng)?shù)年栯x子清除劑(例如苯甲醚或二甲氧基苯)存在下用無水HF處理載肽樹脂。該方法同時除去所有保護基(除保護硫的硫代烷基外)，并從樹脂上將肽裂解下來。以該方法從CMR和Pam樹脂上水解的肽是羧酸，從BHA樹脂中裂解則得到羧酰胺。
以本領(lǐng)域一般已知方法，通過烷基化或酰化反應(yīng)來完成對肽的末端氨基的修飾?？梢栽诮Y(jié)合成肽以前對氨基酸進行這些修飾，或可在肽合成以后，末端氨基釋放但保護基尚未除去時對肽進行這些修飾。
一般來說，使用相應(yīng)烷基或芳基酸的酰鹵、酐或活化酯，于叔胺存在下，在游離氨基上完成酰化反應(yīng)。在弱還原劑(如氰基氫硼化鋰或鈉)存在下，采用適當(dāng)?shù)闹迦┗蛲?，通過氨基的還原烷基化反應(yīng)最方便地進行單烷基化反應(yīng)。而二烷基化反應(yīng)則可于堿存在下，使用過量烷基鹵處理氨基來完成。
溶液法合成肽采用對酰胺鍵常用的方法進行。一般是采用適當(dāng)?shù)呐己蟿?，例如N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，并可于存在1-羥基苯并三唑(HOBT)或二甲基氨基吡啶(DMAP)這類催化劑的情況下，將帶有游離羧基的被保護的t-Boc氨基酸偶聯(lián)到帶有游離氨基的被保護的氨基酸上。其它方法，例如活化酯、酐或酰鹵的形成，被保護的t-Boc氨基酸的游離羧基的形成，以及在有或沒有堿存在下，與被保護之氨基酸的游離氨基反應(yīng)也是適用的。例如，在無水溶劑(如二氯甲烷或四氫呋喃(THF))中，在堿(如N-甲基嗎啉、DMAP(二甲基氨基吡啶)或三烷基胺)存在下，用氯代甲酸異丁酯處理被保護的Boc-氨基酸或肽以形成“活化的酐”，隨后再將其與另一個經(jīng)保護的氨基酸或肽的游離胺反應(yīng)。按此方法形成的肽，可使用常規(guī)技術(shù)選擇性地除去氨基或羧基末端保護基，并采用相似方法再偶聯(lián)到其他肽或氨基酸上。肽合成完畢后，使用前面介紹的方法除去保護基，例如在鈀或鉑催化劑存在下氫化，于液氨、氫氟酸或堿中用鈉處理之。
去保護以后，假如最終的肽含有一個堿基團，則可制備酸加成鹽。肽的酸加成鹽按標準方式，在適當(dāng)溶劑中，從其母體化合物和稍微過量的酸(如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、醋酸、馬來酸、琥珀酸或甲磺酸)制備。醋酸鹽形式是特別有用的。如果最終的肽含有酸性基團，則可制備陽離子鹽。一般可用稍過量的堿試劑例如含適當(dāng)陽離子的氫氧化物，碳酸鹽或醇鹽處理母體化合物。諸如Na+、K+、Ca++和NH+4這類陽離子即是適于藥用之鹽的典型陽離子。特別優(yōu)選的是Na+和NH+4。
總的來說，為了發(fā)揮刺激效果，本發(fā)明的肽可以以0.5ng-1mg(優(yōu)選5-500ng)的劑量給病人注射或以50ng-5mg(例如每天每70Kg體重0.01mg-1mg)的劑量給病人口服;假如采用輸注或類似技術(shù)給藥，其劑量為每70Kg體重0.005ng-1mg，例如六天期間大約0.03ng，其原則是期望病人細胞外液中肽的濃度為10-15M-10-5M左右。
根據(jù)本發(fā)明的另一特征，本發(fā)明提供了含前面定義的式(Ⅰ)的一種或多種化合物，或者其生理學(xué)上相容的鹽作為活性成份并與藥用載體或賦形劑相結(jié)合的藥物組合物。本發(fā)明的組合物可配成適于口服、滴鼻、非腸道或直腸給藥的劑型。
本文所使用的術(shù)語“藥用的”也包括本發(fā)明作為獸藥的應(yīng)用。這些肽可以制成膠囊、片劑或配成乳劑或糖漿供口服。加入適于藥用的固體或液體載體以提高組合物的穩(wěn)定性或有利于組合物制備。液態(tài)載體包括糖漿、花生油、橄欖油、甘油、鹽水和水。固體載體包括淀粉、乳糖、硫酸鈣二水合物、石膏粉、硬脂酸鎂或硬脂酸、滑石、果膠、阿拉伯膠、瓊脂或明膠。載體也包括諸如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯這類緩釋物質(zhì)，可單加或其與石臘一起添加。固體載體的量可以有所變化，但較好每劑量單位約含20mg-1g。該藥物制劑可按照制藥常規(guī)技術(shù)制得、包括經(jīng)碾磨、混合、成粒和壓片等步驟制成片劑;或經(jīng)碾磨、混合及填充等工藝制成硬膠囊?？芍瞥珊环N或幾種活性成份的膠囊，例如將活性成份與惰性載體(例如乳糖或山梨醇)混合、將混合物填入明膠膠囊內(nèi)。當(dāng)使用液體載體時，可將制劑配成糖漿、酏劑、乳劑或水或非水懸浮劑。這類液體制劑可直接口服或填入軟膠囊中口服。也可以使用器官特異性載體系統(tǒng)。
本發(fā)明肽或其衍生物的其他藥物組合物可以配制成凍干粉的溶液經(jīng)胃腸道外途徑給藥?？梢栽谑褂们凹尤脒m當(dāng)?shù)南♂寗┗蚱渌伤幱玫妮d體來再加工粉末。液體制劑一般是緩沖的、等滲的水溶液。適當(dāng)稀釋劑的典型例子是普通等滲鹽水、溶于水中的標準5%葡萄糖或緩沖乙酸鈉或乙酸銨溶液。這類制劑特別適于非胃腸道給藥，但也可口服使用及裝入計數(shù)劑量的吸入器或噴霧器中供吸入用。加入諸如聚乙烯吡咯啉酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯膠、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化鈉或檸檬酸鈉這類賦形劑也是適宜的。
為直腸給藥，可將磨碎的本發(fā)明肽粉末與諸如可可脂、甘油、明膠或聚乙二醇這類賦形劑相結(jié)合制成栓劑。磨碎的粉末也可以與油制劑、膠、乳霜或乳劑混合，經(jīng)緩沖或不經(jīng)緩沖并通過透皮膏給藥。
可以用相似方法在水溶液中配制鼻噴霧劑，并裝入帶有氣霧推進器或配有供手動壓出配件的噴注容器中。
含本發(fā)明化合物的劑量單位最好含有0.1-100mg，例如含1-50mg式(Ⅰ)的肽或其鹽。
根據(jù)本發(fā)明的再一個特征，本發(fā)明提供了一種抑制骨髓組織生長的方法，該方法包括給病人使用前面定義的有效量的藥物組合物。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明使用本發(fā)明化合物時，不會產(chǎn)生不可接受的毒性作用。
通過下面的試驗來證明式(Ⅰ)化合物的生物活性。
通過基質(zhì)(Stromal)細胞誘導(dǎo)集落刺激活性使人骨髓基質(zhì)細胞系C6在塑料組織培養(yǎng)皿中，于RPMI-1640培養(yǎng)基和5%FBS中生長至融合。試驗前一天，將該培養(yǎng)基換成不加血清的DMEM。將化合物以一個小時的時間加到這些培養(yǎng)物中，然后從培養(yǎng)物中洗出。用新鮮DMEM代替培養(yǎng)基并于5%CO2，37℃下將細胞保溫24小時。24小時后收集C6細胞培養(yǎng)物上清液、無菌過濾、并冷凍直至可以按下述方法檢測造血集落刺激活性(CSA)的存在。
軟瓊脂試驗取路易士小鼠的骨髓細胞。在無血清DMEM中將其調(diào)到106個細胞/ml。所用的單層瓊脂系統(tǒng)是富集營養(yǎng)素(NaHCO3，丙酮酸鹽，氨基酸，維生素和HEPES緩沖劑)的DMEM;0.3Bacto瓊脂和20%Lewis大鼠血清。向該培養(yǎng)基中加入大鼠骨髓細胞(最終濃度為105個細胞/毫升)及C6細胞系上層清液的稀釋液(10-2.5%)。該瓊脂板在37℃，5%CO2下保溫7到8天。用顯微鏡計數(shù)增殖的骨髓細胞(CFU-C)集落。計數(shù)出的瓊脂集落數(shù)與在C6骨髓基質(zhì)細胞系上清液內(nèi)存在之CSA的量成比例的。
單純皰疹小鼠模型感染前7天，給Balb/c小鼠每天一次腹腔內(nèi)注射0.2ml劑量為10和1ng/Kg的化合物。對照組小鼠則注射0.1ml的稀釋緩沖液，DPBS和0.5%熱失活的正常小鼠血清的混合物。
通過在小鼠每只后足掌中注入懸浮于0.05ml PBS內(nèi)的5.0×105pfu病毒用單純皰疹病毒(MS株)感染小鼠。直到瀕死之前(不給食物或水)連續(xù)給小鼠注射化合物或?qū)φ兆⑸湟?。通常在大約感染8天后出現(xiàn)后肢麻痹。癱瘓過程一直進行到了發(fā)生腦炎為止。
另一種方法是通過陰道途徑接種病毒。把含有5.0×105/pfu MS-NAP病毒株的棉塞插入小鼠陰道內(nèi)。
使用Wilcoxin實驗來測定是否被治療小鼠比對照組小鼠的存活率有顯著增加。
抗念珠菌攻擊使用白色念珠菌B311a菌株。該菌株已在小鼠體內(nèi)傳代，然后在-70℃下冷凍。B311a對免疫抑制小鼠在5.0到8.0×104cfu/小鼠范圍內(nèi)和正常小鼠在1.0到2.0×105cfu/小鼠范圍內(nèi)有毒力。使白色念珠菌冷凍材料中的樣品生長于Sabouroud葡萄糖斜面上，然后轉(zhuǎn)移到50ml振蕩的Sabouroud肉湯培養(yǎng)液中培養(yǎng)18小時。將細胞洗三次，然后用血細胞計數(shù)器計數(shù)，并用亞甲蘭染料排除法證實其存活性。對接種物進行存活率計數(shù)以證實這一計數(shù)。
通過靜脈注射懸浮于0.2ml鹽水中的細胞用念珠菌感染所有小鼠(Balb/c)，經(jīng)用300拉德射線照射使一些小鼠發(fā)生亞致死性骨髓抑制。照射開始后2小時，每天給動物注射CSF化合物(作陽性對照)或賦形劑。照射后7天開始治療，通過靜脈給藥用白色念珠菌攻擊小鼠。這差不多代表了正常小鼠的LD75。在其他研究中小鼠沒有受到免疫抑制。在這些研究中，小鼠以與被照射小鼠相同方法感染后7天開始治療。在這兩種模型中均觀察小鼠直到瀕死期為止，并用Wilcoxin實驗比較存活率的變化。
下列實施例用來詳細說明本發(fā)明。這些實施例并不是限定本發(fā)明的范圍，而是舉例說明如何制備和使用本發(fā)明的化合物。
在這些實施例中，所有的溫度均為攝氏度。在Dionex Autoion100上進行氨基酸分析。肽含量分析是以氨基酸分析為基礎(chǔ)的。在VG ZAB質(zhì)譜儀上用快原子轟擊FAB質(zhì)譜分析。所使用的縮寫字如下Arg＝精氨酸Asp＝天冬氨酸t(yī)-BOC＝叔丁氧基羰基Bz＝芐基Cl-Z＝對位氯芐氧羰基碳酰(Z＝芐氧羰基碳酰)
DCC＝二環(huán)己基碳化二亞胺DIEA＝二異丙基乙胺EDC＝(N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺Glu＝谷氨酸p-Glu＝焦谷氨酸Tyr＝酪氨酸Hna＝二氨基己炔酸HOBT＝羥基苯并三唑Lys＝賴氨酸NMP＝N-甲基-2-吡咯烷酮Pro＝脯氨酸Gln＝谷氨酰胺Cys＝胱氨酸
N-MeArg＝N-甲基精氨酸Prc＝雙Boc-S，S′-1，3-丙二基胱氨酸Etc＝雙Boc-S，S′-1，2-乙二基胱氨酸Buc＝雙Boc-S，S′-1，4-丁二基胱氨酸Chc＝環(huán)己烷羧酸Tfc＝四氫-2-糠酸Otz＝2-氧代-4-噻唑烷Cpa＝環(huán)戊烷Tpc＝3-噻吩羧酸S-Otf＝(S)-(+)-5-氧代-2-四氫呋喃羧酸R-Otf＝(R)-(-)-5-氧代-2-四氫呋喃羧酸Ppc＝2-哌啶酸Ser＝絲氨酸Nle＝正亮氨酸實施例1(Pic-Glu-Asp)2-Sub-(Lys)2[SEQ ID NO∶1]a.Boc-Lys(Cl-Z)-樹脂的合成將Boc-Lys(Cl-Z)[16.6g，40mmol]溶解于150毫升含10%水的甲醇溶液中。用40ml 1M CsCO3溶液中和該溶液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮中和過的溶液。用DMF稀釋所得到的銫鹽并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去DMF。將該步驟重復(fù)兩次以上。將該鹽在真空中干燥4小時。
用120ml DMF稀釋Boc-Lys(Cl-Z)的銫鹽。向其中加入20g氯甲基樹脂(1meq/g)。在40℃下把反應(yīng)混合物旋動48小時。
將樹脂冷卻到室溫并用熔結(jié)漏斗過濾之，然后按下列次序依次洗滌500ml DMF;500ml DMF∶H2O(1∶1);500ml DMF;500ml MeOH和1000ml CH2Cl2。把樹脂在真空中干燥?；厥账腂oc-Lys(Cl-Z)樹脂23.9g。
對所得樹脂進行氨基酸分析。以氮(N)和氯(Cl)的測定結(jié)果為基礎(chǔ)，計算出樹脂上的取代為0.493meq/g。
b.Boc-Sub-[Lys(Cl-Z)]2-樹脂的合成把23g(11.339mmol)的Boc-Lys(Cl-Z)-樹脂轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器內(nèi)并懸浮于CH2Cl2中。
用40ml在CH2Cl2中的50% TEA洗滌樹脂5分鐘，再用另外40ml50%TFA洗滌30分鐘以除去Boc-Lys(Cl-Z)樹脂的Boc保護。然后再用40ml CH2Cl2洗3次。
所得TFA鹽用40ml溶于CH2Cl2中的10%DIEA處理(1分鐘)兩次，用40ml CH2Cl2洗滌一次并用40ml在CH2Cl2中的10%DIEA洗滌一次以上。用CH2Cl2(6×40ml)徹底洗滌該樹脂。
為使N，N′-雙-Boc二氨基辛二酸(Boc-Sub-OH)與NH2-Lys(Cl-Z)-樹脂偶聯(lián)，將樹脂懸浮于加在手動振搖容器內(nèi)的100ml二氯甲烷(CH2Cl2)中。在另一個50ml燒瓶中，將2.29g(5.66mmol)(Boc-Sub-OH)和HOBt(1.53g，11.34mmol)溶于5ml N-甲基吡咯烷酮(NMP)和20mlCH2Cl2中。用冰浴將溶液冷卻到0℃。在所得溶液中加入DCC(2.34g，11.34mmol)并在0℃下將反應(yīng)混和物攪拌15分鐘。濾去所得到的二環(huán)己脲沉淀物，把預(yù)形成的活性酯加到NH2-Lys(2-Cl-Z)-樹脂懸浮液中。用Kaiser試驗(茚三酮)監(jiān)測反應(yīng)。96小時后，用CH2Cl2(3×40ml)、(3×40ml)和CH2Cl2(6×40ml)洗此二肽鍵-樹脂。處理后茚三酮試驗得到一種與陰性對照差不多的淺藍色溶液。然后用溶在CH2Cl2中的10%乙酐將樹脂洗一次(10分鐘)，最后再用CH2Cl2(6×40ml)洗滌。
c.[Boc-Asp(OBz)]2-Sub-[Lys(Cl-Z)]2-樹脂的合成重復(fù)TFA去保護和中和步驟以制備與Boc-Asp(OBz)偶聯(lián)的雙肽鍵-樹脂。為偶聯(lián)該氨基酸，使用3.67g(11.339mmol)Boc-Asp(OBz)，2.34g(11.339mmol)和1.53gHOBt。陰性茚三酮試驗指示24小時后完成了偶聯(lián)。該三肽-樹脂也被用來制取在2(B)位上有不同氨基酸的其他肽。
d.[Boc-Glu(OBz)-Asp(OBz)]2-Sub-[Lys(Cl-Z)]2-樹脂的合成將5g(2.465mmol)三肽-樹脂轉(zhuǎn)移到一個較小的反應(yīng)容器中。如上面所描述的，重復(fù)TFA去保護步驟和DIEA中和步驟。為了偶聯(lián)，使用Boc-Glu(OBzl)[3.66g，10.846mmol]，HOBt[1.47g，10.846mmol]和DCC[2.23g，10.846mmol]。偶聯(lián)24小時后，反應(yīng)完成并回收到5.4g[Boc-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)]2-Sub-[Lys(Cl-Z)]2-樹脂。偶聯(lián)是在60ml DMF/CH2Cl2中進行的。用該四肽制取本發(fā)明化合物之1(A)位上有不同氨基酸的其他肽。
e.(Pic-Glu-Asp)2-Sub-(Lys)2[SEQ ID NO∶1]的合成從[Boc-Glu(OBzl)]2-Sub-[Lys(Cl-Z)]2-樹脂中除去Boc基團，使用146mg(1.0846mmol)HOBt和223mg(1.0846mmol)DCC在DMF中偶聯(lián)132.8mg吡啶甲酸。
使肽去保護，并用液體HF/甲氧基苯(10ml HF和0.35ml甲氧基苯)在0℃下處理1小時從樹脂上裂開之。在真空下除去HF，用乙醚洗滌肽/樹脂混和物，并用0.1%TFA/水溶液提取之。凍干該溶液。裂解350mg肽-樹脂后產(chǎn)生110mg粗肽。在C-18VYDAC制備柱上純化粗肽(50mg)，并使用乙腈/水TFA緩沖系統(tǒng)洗脫后得到8毫克純肽。FAB MS(M+H1159.3)氨基酸分析Asp1.9(2)，Glu2.2(2)和Lys(2)(未分析Pic和Sub)HPLC純度＞95%實施例2(pGlu-Ser-Asp)2-Sub-(Lys)2[SEQ ID NO∶3]按實施例18中描述的方法合成[Boc-Asp(OBzl)]2-Sub-[Lys(Cl-Z)]2-樹脂。從[Boc-Asp(OBzl)]2-Sub-[Lys(Cl-Z)]2-樹脂(0.5克)上裂開掉Boc基團。用146mg(1.0846mmol)HOBt和223mg(1.0846mmol)DCC在DMF/CH2Cl2中偶聯(lián)318.96mg Boc-Ser(OBz)-OH(1.08mM)和139.45mg pGlu(1.08mM)。使肽去保護并用液態(tài)HF/甲氧基苯(10ml HF和0.35ml甲氧基苯)在0℃下處理1小時從樹脂上裂開之。在真空下除去HF，用乙醚洗滌肽/樹脂混和物并用0.1%TFA/水溶液提取之。冷凍干燥該溶液。裂解350mg肽-樹脂產(chǎn)生125mg粗肽。在C-18VYDAC制備柱上純化50mg粗肽并使用乙腈/水TFA緩沖系統(tǒng)洗脫之。獲得11毫克純肽。
FAB MS(M+H 1087.4)氨基酸分析Asp2.01(2)，Ser1.50(2)，Glu2.6(2)和Lys2(2)(沒有分析Sub，且因水解期間分解致使Ser值不正確)HPLC純度＞95%實施例3(Pic-Ser-Asp)2-Adp-(Lys)2[SEQ ID NO∶6]按實施例18(a)所述方法合成該肽的Boc-Lys(Cl-Z)-樹脂。除N，N′-雙-Boc·二氨基辛二酸(Boc-Sub-OH)用N，N′二-Boc二氨基己二酸(Boc-Adp-OH)取代外，使用如實施例18(b)和18(c)中所述的合成[Boc-Asp(OBz)]2-Adp-[Lys(Cl-Z)]2-樹脂的相同方法。使用0.5克[Boc-Asp(OBz)]2-Adp-[Lys(Cl-Z)]2-樹脂合成(Pic-Ser-Asp)2-Adp-(Lys)2[SEQ ID NO∶6]。用Boc-Ser(Bz)-OH和吡啶甲酸重復(fù)去保護，中和及偶聯(lián)循環(huán)。偶聯(lián)中使用1.8mM氨基酸，DCC和HOBt。偶聯(lián)在10mlDMF/CH2Cl2中進行。裂解400mg肽-樹脂，得到113mg粗肽，在C-18Vydac 制備柱上純化50mg粗肽并使用乙腈/水TFA緩沖系統(tǒng)洗脫，得到13毫克純肽。
FAB MS(M+H1047.4)氨基酸分析Asp2.00(2)，Ser1.62(2)，Lys1.81(2)(Pic和Adp沒有分析)HPLC純度＞95%實施例4(Pic-Ser-Asp)2-Adp-(Lys-CONH2)2[SEQ ID NO∶11]把5克Boc-Lys(Cl-Z)-BHA樹脂(2.15mM，取代值＝0.43meq/g，Applied Biosystem Inc.)裝入振蕩器內(nèi)并進行標準去保護和中和循環(huán)。使用974mg(4.3mM)DCC和638mg(4.3mM)HOBt偶聯(lián)N，N′-二Boc-二氨基己二酸(Boc-Adp-OH/404mg，1.075mM)。偶聯(lián)在N-甲基-吡咯烷酮(NMP)和二氯甲烷中進行。72小時后用在CH2Cl2中的10%乙酐封住未反應(yīng)的氨基。去保護和中和之后，使用DCC1.95g(9.46mM)，HOBt 1.28g(9.46mM)在DMF/CH2Cl2使Boc-Asp(OBz)-OH3.1g(9.46mM)與樹脂偶聯(lián)。經(jīng)過下一次去保護和中和循環(huán)后，用二氯甲烷洗樹脂并干燥之。將0.5g該三肽樹脂裝入一個較小的手動振搖容器內(nèi)，按實施例18中所描述的方法使其他兩種殘基(Boc-Ser(OBz)-OH和Pic)與樹脂相偶聯(lián)。用10mlHF和0.35ml苯甲醚裂解350mg肽樹脂。用乙醚洗肽/樹脂混和物并在0.1%TFA/水溶液中提取肽。冷凍干燥提取液得到大約120mg的粗肽。在C-18Vydac制備柱上使用TFA/乙腈/水緩沖液梯度洗脫純化50毫克粗肽。
ES MS(M+H1045.4)氨基酸分析Asp2.00(2)，Ser1.67(2)，Lys1.74(2)。
HPLC純度＞95%實施例5(pGlu-Glu-Asp)2-Adp-(Tyr-Lys)2∶[SEQ ID NO∶8]將1克(0.64mM)Boy-Lys(Cl-Z)-樹脂裝入一手動振蕩容器內(nèi)。經(jīng)去保護和中和循環(huán)之后，用DCC2.01g(10mM)和HOBt1.53g(10mM)將樹脂與Boc-Tyr(Br-Z)-OH 4.9g(10mM)偶聯(lián)。偶聯(lián)反應(yīng)在DMF/CH2Cl2中進行。用Kaiser′s試驗監(jiān)測偶聯(lián)完成情況。除去Boc基團并中和后，使用DCC128.4mg(0.64mM)和HOBt98mg(0.64mM)在20ml DMF/CH2Cl2中偶聯(lián)N，N′-二-Boc-二氨基己二酸127.4mg(0.33mM)。用Kaiser′s試驗監(jiān)測偶聯(lián)反應(yīng)。72小時后(反應(yīng)還沒有完成)加入另外1毫摩爾DCC(201mg)和HOBt(153mg)。再過72小時之后，用加在二氯甲烷中的10%乙酐封住在未反應(yīng)的氨基基團上。用標準的去保護、中和和偶聯(lián)循環(huán)偶聯(lián)其余的氨基酸。使用10毫摩爾各氨基酸，DCC和HOBt。偶聯(lián)是在DMF/CH2Cl2中進行的。用30ml HF和1ml苯甲醚裂解整個肽樹脂。用乙醚洗肽/樹脂混和物并用0.1%TFA/水提取肽。冷冰干燥該提取液。在C-18制備柱上用TFA/乙腈/水緩沖梯度系統(tǒng)純化350mg粗肽。得到112mg純肽。
ES MS(M+H1470.8)氨基酸分析Asp 2.27(2)，Glu4.17(4)，Tyr1.74(2)和Lys2(2)(沒有分析Adp，Tyr的值，因水解期間分解測定不準確)HPLC純度＞95%實施例6(pGlu-Glu-Lys)2-Sub-(Asp)2∶[SEQ ID NO∶12]將1克Boc-Asp(OcHex＊)PAM樹脂(Bachem CA.，0.5mM/g)裝入手動力振蕩的容器內(nèi)。在去保護和中和循環(huán)后，用實施例18中所描述的方法將N，N′-二-Boc-二氨基辛二酸偶聯(lián)到樹脂上。用標準的去保護、中和和偶聯(lián)方法偶聯(lián)其余的三個氨基酸(Boc-Lys(Cl-Z)-OH，Boc-Glu(OBz)-OH和pGlu)。使用了3毫摩爾氨基酸，DCC和HOBt。偶聯(lián)是在DMF/CH2Cl2中進行的。用10ml HF和1.0ml苯甲醚裂解肽樹脂。用乙醚洗肽/樹脂混和物并用0.1%TFA/水溶液提取肽。冷凍干燥該提取液得到大約4789mg粗肽。在C-18Vydac制備柱上使用TFA/乙腈/水緩沖梯度洗脫純化60mg粗肽。獲得19mg純肽。
＊環(huán)己基ES MS(M+H1171.4)氨基酸分析Asp1.98(2)，Glu4.56(2)，和Lys2(2)(沒有分析Sub)HPLC純度＞95%
實施例7-8按上面給出的方法制備下列化合物(Pic-Glu-Asp)2-Adp(Lys)2[SEQ ID NO∶9](Pic-Glu-Asp)2-Adp(Lys-NH2)2[SEQ ID NO∶10]實施例9(Pic-Ser-Ala)2-Sub(Nle-NH2)2[SEQ ID NO∶13]將Boc-Nle.DCHA(1.24g，3.0mM)，HOBt(0.46g，3.0mM)和PyBOP(1.56g，3.0mM)一起溶于10ml DMF中。加入DIEA(0.77ml，4.5mM)并攪拌混和物10分鐘。然后將活化的氨基酸裝入手動振蕩容器內(nèi)，該容器中含有在5ml DMF中溶脹的1.61g(1.0mM)對位甲基二苯甲基胺樹脂。樹脂已預(yù)先用加在DMF中的5%DIEA(2×)處理過并用DMF(3×)洗過。將反應(yīng)容器振蕩1小時30分鐘Kaiser試驗結(jié)果為陰性。用DMF(2×)，iPrOH/DCM(1/1)(2×)和DCM(2×)洗樹脂，用33%TFA的DCM溶液除去Boc基團。用5%DIEA的DMF溶液中和后，在DMF/DCM(1/4)中用0.5mM(76.6mg)HOBt和0.5mM(78.6μl)DICC使0.25mM(101.0mg)的Boc-Sub與0.5mM Nle-樹脂偶聯(lián)。48小時后Kaiser試驗稍顯陽性;把另外的HOBt和DICC(各0.25mM)加入樹脂中。72小時后定量Kaiser試驗表明偶聯(lián)得率為93%。用20%乙酐和在DMF中的5%DIEA溶液封住未反應(yīng)的氨基基團。重復(fù)前述去保護、中和和偶聯(lián)循環(huán)以偶聯(lián)Boc-Ala，Boc-Ser(OBz)和Pic。其中使用加在10ml DMF中的1.5mM氨基酸、PyBOP和HOBt。在加入2.25mM DIEA后將氨基酸預(yù)活化10分鐘，然后將此混合物加入樹脂中。用Kaiser試驗監(jiān)測偶聯(lián)完成情況，如果實驗結(jié)果是陽性，即重復(fù)偶聯(lián)步驟。使0.5g所得樹脂肽(總共獲得1.34g)去保護，并用1.0ml苯甲醚和10ml HF在-5℃下裂解1小時。蒸發(fā)掉HF，用乙醚洗肽樹脂混合物。用0.5%TFA水溶液，然后用冰醋酸提取肽。冷凍干燥后，得到57.7mg粗肽。用乙腈-水(0.1%TFA緩沖系統(tǒng))在C-18Vydac制備柱上純化粗肽(22.6mg)。得到3.5mg純肽。氨基酸分析和FAB-MS進一步證實其結(jié)構(gòu)。
氨基酸分析Ser(2)，Ala(2)，Sub(1)，Nle(2)。
實施例10-11按上面給出的方法合成下列化合物(Pic-Ser-Ser)2-Sub(Gln-NH2)2[SEQ ID NO∶14](Pic-Ser-Phe)2-Sub(Phe-NH2)2[SEQ ID NO∶15]實施例12可按不同劑型并加入多種不同的賦形劑制備摻入了本發(fā)明化合物的藥用配制劑。下面給出這類配方的例子片劑/每片成分1.活性成分(式Ⅰ的化合物) 0.5mg2.玉米淀粉 20mg3.藻酸 20mg4.藻酸鈉 20mg5.硬脂酸鎂 1.3mg
片劑制備方法步驟1在一個適當(dāng)?shù)幕旌推?攪拌器中混和成分No.1，No.2，No.3和No.4。
步驟2分批添加足量水到步驟1中的摻合物中，每次加入后都仔細混和之。加水并混和直到團塊的稠度可以轉(zhuǎn)化為濕顆粒為止。
步驟3使?jié)駡F塊通過一個No.8篩目(2.38mm)篩的搖擺式造粒機使之成為顆粒。
步驟4然后在干燥箱內(nèi)于140°F(60℃)下烘干濕顆粒，直到干燥為止。
步驟5用成分No.5潤滑干顆粒。
步驟6用一臺合適的壓片機榨壓潤滑過的顆粒。
胃腸道外給藥的制劑制備胃腸道外給藥的藥物組合物，即將適量的式Ⅰ化合物加熱溶入聚乙二醇中。然后用注射用水Ph Eur.稀釋該溶液(至100ml)。再通過0.22微米膜濾器過濾除菌并在無菌容器中密封之。
權(quán)利要求
1.由下式代表的化合物或其醫(yī)學(xué)上可接受的鹽
其中Y1和Y2分別是CH2或S；x是0，1，2，3或4；m是0，1或2；n是0，1或2；A是2-噻吩羧酸、吡啶甲酸、環(huán)己烷羧酸、四氫-2-糠酸、四氫-3-糠酸、2-氧代-4-噻唑烷羧酸、環(huán)戊烷羧酸、3-噻吩羧酸、(S)-(+)-5-氧代-2-四氫呋喃羧酸、2-哌啶酸、吡咯羧酸、異吡咯羧酸、吡唑羧酸、異咪唑羧酸、三唑羧酸、二硫雜環(huán)戊二烯羧酸、氧硫雜環(huán)戊二烯羧酸、異噁唑羧酸、噁唑羧酸、噻唑羧酸、異噻唑羧酸、噁二唑羧酸、噁三唑羧酸、氧硫雜環(huán)戊二烯羧酸、噁嗪羧酸、噁噻唑羧酸、二噁唑羧酸、吡喃羧酸、嘧啶羧酸、吡啶羧酸、噠嗪羧酸、吡嗪羧酸、哌嗪羧酸、三嗪羧酸、異噁嗪羧酸、氧硫氮雜烯羧酸或嗎啉羧酸、吲哚羧酸、吲哚恩羧酸(indolenenecarboxylic acid)、2-異吲哚羧酸、1，5-吡啶羧酸、吡喃并[3，4-b]吡咯羧酸、異吲哚羧酸、吲噁嗪羧酸(indoxazinecarboxylic acid)、苯并噁唑羧酸、苯鄰甲內(nèi)酰胺羧酸、喹啉羧酸、異喹啉羧酸、噌啉羧酸、喹唑啉羧酸、1，5-二氮雜萘羧酸、吡啶并[3，4-b]吡啶羧酸、吡啶并[3，2-b]吡啶羧酸、吡啶并[4，3-b]吡啶羧酸、1，3，2-苯并噁嗪羧酸、1，4，2-苯并噁嗪羧酸、2，3，1-苯并噁嗪羧酸、3，1，4-苯并噁嗪羧酸、1，2-苯并異噁嗪羧酸、1，4-苯并異噁嗪羧酸、咔唑羧酸、噁啶羧酸或嘌呤羧酸；B是絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸；C是谷氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸、β-丙氨酸或肌氨酸；D是賴氨酸、精氨酸、酪氨酸、N-甲基精氨酸、天冬氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸、b-丙氨酸、肌氨酸，或二氨己炔酸；或羧酰胺，或其羥甲基衍生物；E是谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸或肽鍵；F是酪氨酸或肽鍵；或者其中Y1，Y2，x，m，n，C，D，F(xiàn)是如上文所定義的；A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、或谷氨酸，而B是絲氨酸；或者其中Y1，Y2，x，m，n，D和F是如上所定義的；A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸；B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸；而C是絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或纈氨酸；或者其中Y1，Y2，x，m，n和F是如上文所定義的；A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸；B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸；C是絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或纈氨酸；而D是鳥氨酸；或者其中Y1，Y2，x，m和n是如上文所定義的；A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酸酰胺、酪氨酸或谷氨酸；B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸；C是絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸；D是鳥氨酸，而F是酪氨酸；所有上述這些定義的條件是·當(dāng)Y1和Y2是S時，x是2，3或4，且m和n是1；或·當(dāng)Y1和Y2是CH2時，x是0，1或2，且m和n是0；或·當(dāng)Y1是S和Y2是CH2時，x是0且n是1；或·當(dāng)Y2是S和Y1是CH2時，x是0且m是1；·如果C選自于絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酸酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸或肌氨酸時，則D就選自于絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸或肌氨酸。
2.權(quán)利要求1中所述的化合物，其中Y1和Y2是CH2，x是0或2，A是焦谷氨酸，吡啶羧酸，脯氨酸，酪氨酸，或2-哌啶甲酸;B是谷氨酸，絲氨酸，天冬氨酸或酪氨酸;C是天冬氨酸，谷氨酸，酪氨酸或賴氨酸;D是賴氨酸，其羧酰胺衍生物，精氨酸，N-甲基精氨酸，2，6-二氨基-4-己炔酸，天冬氨酸或鳥氨酸且E是肽鍵。
3.權(quán)利要求1所述的化合物選自于(Pic-Glu-Asp)2Sub(Lys)2[SEQ ID NO∶1](L-Ppc-Glu-Asp)2Sub(Lys)2[SEQ ID NO∶2](pGlu-Ser-Asp)2Sub(Lys)2[SEQ ID NO∶3](pGlu-Ser-Asp)2Adp(Lys)2[SEQ ID NO∶4](pGlu-Ser-Asp)2Adp(Lys-NH2)2[SEQ ID NO∶5](Pic-Ser-Asp)2Adp(Lys)2[SEQ ID NO∶6](Pic-Ser-Asp)2Adp(Lys-NH2)2or [SEQ ID NO∶7](pGlu-Glu-Asp)2-Adp(Typ-Lys)2SEQ ID NO∶8]
4.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1到3中所述的任何一種化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
5.一種刺激骨髓生成系統(tǒng)的方法，包括給需要治療者服用刺激該骨髓生長系統(tǒng)有效劑量的權(quán)利要求1到3中任一項所述的化合物。
6.一種預(yù)防或治療病毒、真菌和細菌感染的方法，包括給需要治療者服用有效劑量的權(quán)利要求1到3中任一項所述的化合物。
7.一種預(yù)防或治療念珠菌、皰疹或肝炎感染的方法，包括給需要治療者服用有效劑量的權(quán)利要求1到3中任一項所述的化合物。
8.一種制備如權(quán)利要求1所定義的式(Ⅰ)化合物的方法，包括，a)偶聯(lián)被保護的氨基酸形成適宜當(dāng)被保護的下列結(jié)構(gòu)通式的化合物
其中Y1，Y2，m，n，A，B，C和E為如權(quán)利要求1所定義的;[D′]是氯代甲基，甲基二苯甲基胺，二苯甲基胺或苯乙酰胺基甲基樹脂或D是如權(quán)利要求1中所定義的;b)除去任何保護基團，必要時，從樹脂上裂解掉肽;并且c)根據(jù)需要形成其藥學(xué)上可接受的鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供如下通式的化合物該化合物具有血調(diào)節(jié)活性，可用于刺激造血機能以及預(yù)防和治療病毒、真菌和細菌感染性疾病。
文檔編號A61P31/04GK1077960SQ9310206
公開日1993年11月3日 申請日期1993年1月8日 優(yōu)先權(quán)日1992年1月10日
發(fā)明者P·K·巴納加, W·F·哈夫曼 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司