專利名稱：microRNA-1的反義鎖核苷酸序列在制備預(yù)防或治療心肌梗死后心衰藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸類物質(zhì)在制備預(yù)防或治療疾病藥物中的應(yīng)用，特別涉及 microRNA-1的反義鎖核苷酸序列在制備預(yù)防或治療心肌梗死后心衰藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
心衰是心肌梗死后發(fā)生猝死的重要原因。心臟疾病發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，每一種發(fā)病機(jī)制可導(dǎo)致一種或多種疾病的表現(xiàn)形式，而多種疾病的表現(xiàn)形式可能由單一發(fā)病機(jī)制所導(dǎo)致，這給此類疾病的預(yù)防和治療帶來(lái)難度。因此目前為止針對(duì)單一靶點(diǎn)的藥物治療，尚不能達(dá)到讓人滿意的效果。隨著近來(lái)microRNAs研究的興起，這種內(nèi)源性的非編碼小RNAs已經(jīng)作為一個(gè)基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因子參與許多重要的生理過(guò)程。由于單一的microRNA可負(fù)向調(diào)控多個(gè)基因mRNA的表達(dá)，使得以關(guān)鍵microRNA為靶點(diǎn)的藥物可通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)參與心臟疾病發(fā)生的基因的表達(dá)，從而給心臟疾病的防治帶來(lái)新的希望，因此發(fā)現(xiàn)不同病理生理情況下起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的microRNA亞型變化，并闡明其功能，將會(huì)對(duì)該疾病的治療帶來(lái)新的靶標(biāo)和產(chǎn)生新的干預(yù)策略。已有研究表明microRNA-Ι作為在肌肉中特異表達(dá)的微小 RNA，在心肌梗死患者和冠脈結(jié)扎的心肌組織中高表達(dá)。并證明其通過(guò)作用于鉀通道蛋白和心肌Cx43參與了心梗后惡性心律失常的發(fā)生。也有研究表明microRNA-Ι在胚胎期可以影響心肌細(xì)胞的發(fā)育和分化。然而，microRNA-Ι是否參與了心梗后心衰的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程， 仍未見(jiàn)報(bào)道。因此，本發(fā)明采用多種技術(shù)手段證明microRNA-Ι在心衰發(fā)生發(fā)展中的作用， 并采用最新的鎖核苷技術(shù)研究microRNA-Ι對(duì)心衰發(fā)生和發(fā)展的防治作用，最終確定檢測(cè)外周血液(全血，血漿，血清)microRNA-Ι是否可以作為一種新的生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)心梗后心衰的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用多種技術(shù)手段證明了 microRNA-Ι在心衰發(fā)生和發(fā)展中的作用，并將其作為一種新型的藥物作用靶點(diǎn)，以及生物標(biāo)志物，應(yīng)用于預(yù)防或治療由心肌梗死導(dǎo)致的心衰的治療。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)micr0RNA-l在心?；颊咄庵苎核脚c心臟功能呈負(fù)相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)microRNA-1 (5，-UAUGUAUGAAGAAAUGUAAGGU-3，)過(guò)表達(dá)小鼠出現(xiàn)心臟功能的下降。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了 microRNA-Ι的反義鎖核苷酸LNA-I (LNA 5，-ATACATACTTCT TTACATTCCA-3，，SEQ ID NO. 1 所示)可以防止心衰的發(fā)生。LNA-1 可成為一種預(yù)防和治療心肌梗死后心衰的治療。因此，本發(fā)明提出了 microRNA-Ι的反義鎖核苷酸在制備預(yù)防或治療心肌梗死后心衰藥物中的應(yīng)用。
microRNA-1的反義鎖核苷酸在制備診斷缺血性心臟病誘發(fā)的心衰的試劑中的應(yīng)用。通過(guò)熒光定量PCR，銀染增強(qiáng)的納米微球技術(shù)檢測(cè)病人外周血液(全血，血漿和血清)中microRNA-1的表達(dá)水平，用于對(duì)缺血性心臟病誘發(fā)心衰的診斷和預(yù)防。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述的microRNA-1的反義鎖核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。利用本發(fā)明的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列制備得到的預(yù)防或治療心肌梗死后心衰的藥物，其特征在于有效成分為所述的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列。制備的藥物可以只含microRNA-1，也可通過(guò)制成一種藥物組合物的方式實(shí)現(xiàn)，其特征在于包含以上所述的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列及藥學(xué)上可接受的載體；其中，所述的載體為病毒、膽固醇，納米顆粒，殼聚糖，脂質(zhì)體等，合成HiiR-I并與上述的適當(dāng)載體連接形成藥物，可制成口服制劑或注射制劑等，通過(guò)靜脈或肌肉注射的方式，用于治療和預(yù)防心肌梗死后心衰的發(fā)生。例如將microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列與膽固醇連接制備相應(yīng)的藥物，其制備方法可采用首先化學(xué)合成microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列，在其尾端連接膽固醇的常規(guī)核酸制劑的方法；例如將microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列與納米顆粒連接制備相應(yīng)的藥物，其制備方法可采用化學(xué)合成microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列，將其與適宜的納米顆?；旌?， 制成連有microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列的納米顆粒，用于心肌梗死后心衰藥物的制備中。為了增加核酸試劑的使用效果，還可輔以專用的穩(wěn)定劑和特異性免疫增強(qiáng)劑精制而成。一種用于診斷缺血性心臟病誘發(fā)的心衰的試劑，其特征在于包含所述的 microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列。


圖1為心肌梗死患者血漿miR-1水平與心功的相關(guān)性分析；MIH 有心梗病史；AMI 初發(fā)急性心肌梗死圖2為microRNA-Ι轉(zhuǎn)基因小鼠心臟microRNA-Ι表達(dá)水平變化；圖3為TG小鼠心電和電鏡檢測(cè)；圖4為TG小鼠心臟功能評(píng)價(jià)；
圖5為TG小鼠心臟形態(tài)學(xué)改變；圖6為心肌收縮相關(guān)蛋白在miR-lTG小鼠心臟上的表達(dá)；圖7為L(zhǎng)NA對(duì)TG小鼠心臟功能的影響及分子機(jī)制。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)藥理性及臨床觀察實(shí)驗(yàn)并結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例ImicroRNA-I在心衰中的作用以及microRNA-Ι心臟過(guò)表達(dá)TG小鼠模型的
4構(gòu)建實(shí)驗(yàn)材料C57B/L6小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司1. UmicroRNA-I在心梗患者外周血液水平與心臟功能呈負(fù)相關(guān)本實(shí)驗(yàn)選取49例心肌梗死患者的血樣，發(fā)現(xiàn)在初發(fā)急性心肌梗死患者血中 microRNA-1水平與射血分?jǐn)?shù)(EF)、左心室短軸縮短率(FQ和二尖瓣口舒張?jiān)缙诜逯邓俣?(E)與舒張晚期峰值速度(A)的比值呈負(fù)相關(guān)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖IA-H所示。1. 2、microRNA_l心臟過(guò)表達(dá)TG小鼠模型的構(gòu)建利用real time PCR檢測(cè)TG小鼠各臟器中microRNA-1的表達(dá)量，結(jié)果顯示與非轉(zhuǎn)基因小鼠(WT)相比，TG小鼠左心室microRNA-1表達(dá)升高了 4倍< 0. 05vs. WT) (圖2A所示)，而骨骼肌未發(fā)生改變(圖2B所示。)，說(shuō)明本發(fā)明所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠是心臟特異性的轉(zhuǎn)基因小鼠。1. 2. UmicroRNA-ITG小鼠進(jìn)行心臟功能的評(píng)價(jià)如圖3A所示本發(fā)明應(yīng)用心電監(jiān)測(cè)儀記錄了 12只陽(yáng)性TG小鼠和12只WT小鼠的心電變化，結(jié)果顯示從出生后4個(gè)月開(kāi)始，所有12只陽(yáng)性TG小鼠均出現(xiàn)P-R間期和QRS波群的增寬。表明TG小鼠出現(xiàn)傳導(dǎo)阻滯。圖;3B電鏡觀察表明心肌組織出現(xiàn)明顯閏盤的溶解， Western檢測(cè)進(jìn)一步證明與同齡的WT小鼠相比較，影響閏盤組織結(jié)構(gòu)的的關(guān)鍵蛋白Cx43在 TG小鼠心臟表達(dá)明顯下降。隨后本發(fā)明采用心臟超生和壓力容積環(huán)的方法對(duì)TG小鼠的心功進(jìn)行了評(píng)價(jià)。如圖4A-I所示與同齡WT小鼠相比較TG小鼠的心臟功能隨年齡的增加而下降。主要表現(xiàn)在 EF%，ESP，士dp/dt，PRSW 禾口 τ 的下降和 EDP、ESV 的下降。1. 2. 2、microRNA-1 TG小鼠心臟形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)通過(guò)對(duì)小鼠正常組、microRNA-lTG小鼠2，4，6個(gè)月組的心臟/體重進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與同齡WT小鼠比較，6個(gè)月TG小鼠表現(xiàn)出心臟/體重的增大(圖5A&B)。HE染色觀察并未發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞的肥大(圖5C&D)。電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)2，4，6個(gè)月TG小鼠均表現(xiàn)出明顯的肌肉收縮不規(guī)則，進(jìn)一步的定量分析發(fā)現(xiàn)TG小鼠肌節(jié)長(zhǎng)度呈現(xiàn)長(zhǎng)短不一的現(xiàn)象(圖5E， F&G)。圖5E亦顯示6各月TG小鼠心肌組織出現(xiàn)明顯的壞死樣變化。1. 2. 3、microRNA-1 TG小鼠心肌相關(guān)蛋白MLC2v和CaM表達(dá)下降實(shí)驗(yàn)采用Wfestern blot的方法發(fā)現(xiàn)microRNA-lTG小鼠心肌收縮相關(guān)蛋白MLC2v、 cMyBP-C和CaMKII的磷酸化水平降低(圖6A、B、E)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)是由于cMLCK和CaM 表達(dá)下降引起的(圖6C、D、F和G)。實(shí)施例2microRNA-l反義鎖核苷酸(LNA)的合成以及LNA對(duì)microRNA-lTG小鼠心臟功能和蛋白的影響2. UmicroRNA-I反義鎖核苷酸(LNA)的合成采用基因全序列合成的方法合成microRNA-Ι反義鎖核苷酸(LNA)序列，所合成的序列如下所示LNA :5，-ATACATACTTCT TTACATTCCA-3，(SEQ ID NO. 1 所示)。 2.2、LNA-對(duì)microRNA-1 TG小鼠心臟功能和蛋白的影響
將LNA用PBS配置成濃度為0. 4mg/ml的液體，采用在體microRNA-Ι反義鎖核苷酸序列(LNA)尾靜脈注射的方法將所合成的反義鎖核苷酸序列注射入TG小鼠體內(nèi)。尾靜脈注射:3mg/kg/次，每隔一周注射一次，共注射3次。在末次注射一周后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MiR-I-LNA不僅可以逆轉(zhuǎn)TG小鼠的心臟功能，還能阻止心肌重構(gòu)的進(jìn)一步發(fā)展(圖7A-D所示)。這一結(jié)果是由于LNA解除了 miR-1對(duì)心肌收縮蛋白cMLCK和CaM的抑制作用(圖7E-K所示)。 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明而言僅是說(shuō)明性的，而非限制性的； 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.microRNA-1的反義鎖核苷酸在制備治療或預(yù)防心肌梗死后心衰藥物中的應(yīng)用。
2.microRNA-1的反義鎖核苷酸在制備診斷缺血性心臟病誘發(fā)的心衰的試劑中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
4.一種用于治療或預(yù)防心肌梗死后心衰的藥物組合物，其特征在于有效成分為權(quán)利要求1或3所述的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物中還進(jìn)一步包括藥學(xué)上接受的載體，所述的載體為病毒、膽固醇、納米顆粒、殼聚糖或脂質(zhì)體。
6.如權(quán)利要求4或5所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物為口服制劑或注射制劑。
7.一種用于診斷缺血性心臟病誘發(fā)的心衰的試劑，其特征在于包含權(quán)利要求2或3所述的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了microRNA-1的反義鎖核苷酸在制備預(yù)防和治療心肌梗死后心衰藥物中的應(yīng)用。制備的藥物可以只含microRNA-1的反義鎖核苷酸序列，也可制成一種藥物組合物，其特征在于包含有效劑量的microRNA-1的反義鎖核苷酸序列及藥學(xué)上可接受的載體；其中，所述的載體可為病毒、膽固醇，納米顆粒，殼聚糖，脂質(zhì)體等，合成microRNA-1的反義鎖核苷酸序列并與上述的適當(dāng)載體連接形成藥物，可制成注射制劑，通過(guò)靜脈或肌肉注射的方式，用于治療心肌梗死后心衰的發(fā)生。
文檔編號(hào)A61P9/04GK102416184SQ201110405299
公開(kāi)日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者呂延杰, 楊寶峰, 艾靜 申請(qǐng)人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)