專利名稱：一種修復(fù)半月板撕裂的生物材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程學(xué)的生物材料技術(shù)，涉及一種修復(fù)半月板撕裂的生物材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
半月板位于膝關(guān)節(jié)股骨髁與脛骨平臺(tái)之間，其功能在于穩(wěn)定膝關(guān)節(jié)，傳遞膝關(guān)節(jié)負(fù)荷力，吸收振蕩，減少應(yīng)力，改善關(guān)節(jié)潤(rùn) 滑，并有助于關(guān)節(jié)軟骨的營(yíng)養(yǎng)。正是由于半月板起到了穩(wěn)定載荷作用，才保證了膝關(guān)節(jié)能夠長(zhǎng)年負(fù)重運(yùn)動(dòng)而不致?lián)p傷。然而，由于膝半屈、重力擠壓、旋轉(zhuǎn)及剪切力量等原因，常造成半月板損傷，其發(fā)病率約占所有膝關(guān)節(jié)紊亂疾病的75%左右。半月板損傷后常引起股四頭肌萎縮，關(guān)節(jié)疼痛、彈力、絞鎖、活動(dòng)受限，導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)退變加速，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。Arnoczky等依據(jù)半月板血液供應(yīng)情況，提出三區(qū)分類半月板外周的紅區(qū)，中央的白區(qū)，和兩者之間的紅白區(qū)。其中紅區(qū)及紅白區(qū)有血供，而白區(qū)僅靠關(guān)節(jié)腔滑液提供營(yíng)養(yǎng)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，采用現(xiàn)有的治療及修復(fù)技術(shù)，僅能對(duì)位于紅區(qū)的半月板進(jìn)行修復(fù)，紅白區(qū)僅有部分愈合能力，而對(duì)白區(qū)完全沒有愈合能力。若不對(duì)撕裂部位尤其是白區(qū)(無(wú)血供區(qū))進(jìn)行治療，會(huì)導(dǎo)致撕裂和損傷的擴(kuò)大甚至半月板的退化、關(guān)節(jié)軟骨損傷。因此，如何有效修復(fù)半月板撕裂損傷，防止后期膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，是諸多醫(yī)生及學(xué)者們一直在致力探尋的課題。目前，半月板損傷治療常用的外科手術(shù)，包括完全或者部分半月板切除術(shù)、撕裂后縫合術(shù)以及半月板置換術(shù)等。對(duì)于紅區(qū)及紅白區(qū)撕裂，臨床一般采用縫合法；而對(duì)于白區(qū)的損傷則采用切除術(shù)。這種手術(shù)能夠使患者迅速緩解痛苦，恢復(fù)膝關(guān)節(jié)的功能。對(duì)半月板全部切除術(shù)后長(zhǎng)期隨訪結(jié)果表明手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率明顯升高，少數(shù)病例出現(xiàn)韌帶松弛，而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變，以至發(fā)生骨性關(guān)節(jié)炎。為此，許多半月板支架或植入物被用來(lái)替代或者修復(fù)半月板切除術(shù)中被切除的組織。專利200780042802. 7,PCT/US2010/047852、US5984858、US4880429、US5735903、US5108438、US6042610、US5913900 等，提供了采用人工合成、自體、同種異體、異種材料等來(lái)替代全切除的半月板的支架及植入物的制備方法。這些材料能夠延緩膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，但半月板假體的柔軟性、蠕變性、相關(guān)的免疫排斥反應(yīng)及生理功能等，尚難達(dá)到人體半月板的要求，無(wú)法滿足臨床要求，尤其是對(duì)于白區(qū)損傷，一直缺乏有效的治療手段。發(fā)明專利200680031664. 8、US20090186062，提供了一種用于半月板撕裂的方法，包括一種膠原膜材料(ChondroGide)。該膠原膜材料由豬或牛的膠原膜制備而成，通過(guò)弓I導(dǎo)滑膜細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞因子等，從不同部位遷移修復(fù)半月板撕裂，達(dá)到修復(fù)撕裂組織的目的。這些技術(shù)經(jīng)組織學(xué)證實(shí)雖然有滑膜細(xì)胞的遷入，但未發(fā)現(xiàn)這種膠原膜在半月板紅區(qū)、紅白區(qū)及白區(qū)撕裂修復(fù)中具有明顯效果，其應(yīng)用于半月板撕裂具有一定的局限性。發(fā)明專利200580013082. 2公開了一種用于無(wú)血管半月板修復(fù)和再生的支架，該發(fā)明僅僅提供了一種用于血液及其成分、細(xì)胞、藥物從組織血管區(qū)到無(wú)血區(qū)的通道，其本身并不具有生物活性，材料本身在撕裂修復(fù)中，同時(shí)也增加了半月板本身的組成成分；此外，支架材料的降解會(huì)產(chǎn)生不同于機(jī)體的微環(huán)境，不利于半月板組織的重建。研究發(fā)現(xiàn)，理想的半月板損傷修復(fù)材料，應(yīng)具有良好的生物活性，能夠產(chǎn)生生物活性因子及基質(zhì)成分；細(xì)胞參與半月板重建過(guò)程中，能夠與周圍正常半月板組織形成胞間聯(lián)系；能夠在撕裂部位自我穩(wěn)定，并通過(guò)關(guān)節(jié)腔滑液進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)吸收，可通過(guò)誘導(dǎo)其間充質(zhì)干細(xì)胞的遷入，加快半月板愈合及白區(qū)的修復(fù)。由于軟骨細(xì)胞可直接在關(guān)節(jié)鏡下從自體獲取，并且移植后不引起免疫排斥反應(yīng)，因而成為目前組織工程研究中應(yīng)用廣泛的一種細(xì)胞來(lái)源。由動(dòng)物來(lái)源組織(皮膚、跟腱、鼠尾等)提取的膠原具有降解速度快，細(xì)胞黏附性好的特點(diǎn)，是一種天然的生物材料，最適合于半月板組織工程學(xué)重建。該類型膠原經(jīng)過(guò)重構(gòu)、交聯(lián)以及酶切處理后，不僅不會(huì)改變其天然的三螺旋結(jié)構(gòu)，而且可以降低其抗原性，并能增強(qiáng)其對(duì)抗膠原酶消化的能力。而具有天然來(lái)源的脫細(xì)胞基質(zhì)膜材料，能夠保持其特有的生物活性成分及活性因子，在降解過(guò)程中，可釋放促進(jìn)機(jī)體組織再生及功能重建的細(xì)胞因子，提高損傷組織的愈合能力。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)修復(fù)半月板撕裂損傷臨床治療的現(xiàn)狀及存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種組織工程半月板撕裂修復(fù)的新生物材料及其制備方法。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一.本發(fā)明修復(fù)半月板撕裂的生物材料，由多層結(jié)構(gòu)組成，S卩，依次由內(nèi)層的脫細(xì)胞基質(zhì)膜、中間層多孔膠原結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜、外層的軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片構(gòu)成。中間層與內(nèi)層之間，通過(guò)注模、流延或刮板復(fù)合，中間層與外層之間，通過(guò)軟骨細(xì)胞接種膠原基質(zhì)膜復(fù)合。內(nèi)層的脫細(xì)胞基質(zhì)膜，其在該材料中起“支架”作用，同時(shí)保留細(xì)胞基質(zhì)的活性成分，含有特殊的蛋白分子(如纖維粘連素、層粘連素、膠原、EGF、bFGF等)，可促進(jìn)損傷愈合及細(xì)胞增殖、表型維持。外層的軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片，可使細(xì)胞在移植后存活時(shí)間更長(zhǎng)并具有半月板組織結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)。軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層，可通過(guò)細(xì)胞間及細(xì)胞與周圍半月板基質(zhì)間建立聯(lián)系；軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞膜片，方便臨床治療半月板撕裂過(guò)程中與撕裂兩端組織細(xì)胞間通訊連接的建立，促進(jìn)材料中細(xì)胞與自體組織細(xì)胞遷入融合。中間層的多孔膠原結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜，提供了細(xì)胞遷入及細(xì)胞因子復(fù)合的空間，有利于誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷入，發(fā)揮在半月板損傷修復(fù)中軟骨細(xì)胞及周圍環(huán)境中干細(xì)胞的生物活性作用，促進(jìn)損傷組織再生及功能重建。該生物材料，以內(nèi)層為“支架”，通過(guò)注模、流延或刮板等，與中間層的多孔膠原涂層復(fù)合，構(gòu)建具有多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜。通過(guò)細(xì)胞雙面接種以及旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，構(gòu)建具有誘導(dǎo)細(xì)胞遷入，實(shí)現(xiàn)半月板撕裂重建。由于具有附合雙層多孔結(jié)構(gòu)的脫細(xì)胞基質(zhì)膜，以及細(xì)胞因子和具有半月板組織特征的軟骨細(xì)胞膜片，可促進(jìn)半月板撕裂部位尤其是白區(qū)的組織愈合及其組織再生。二.本發(fā)明之修復(fù)半月板撕裂生物材料的制備方法，依下述步驟完成步驟一、脫細(xì)胞基質(zhì)膜的制備該脫細(xì)胞基質(zhì)膜可選用動(dòng)物源性脫細(xì)胞基質(zhì)膜或人源性的脫細(xì)胞羊膜等，如，脫細(xì)胞小腸粘膜下層、脫細(xì)胞心包膜、脫細(xì)胞腹膜等。此脫細(xì)胞基質(zhì)膜采用現(xiàn)有工藝方法即可制備。步驟二 具有多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜的制備配置濃度為3 15mg/mL、pH值為3 6的膠原溶液在脫細(xì)胞基質(zhì)膜致密面，通過(guò)注模、流延或刮板制備多孔膠原涂層；通過(guò)預(yù)凍溫度設(shè)定、冷凍速度和凍干工藝來(lái)調(diào)節(jié)膠原層孔徑大小，使其孔徑大小可控制在50 600 u m之間，更優(yōu)在200 400 y m之間，制備并獲得具有附合多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜。所述的膠原溶液，是用牛跟腱、皮膚、鼠尾等動(dòng)物源性材料制備而成的。步驟三、軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片的制備細(xì)胞層軟骨細(xì)胞接種用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液浸潤(rùn)步驟二制備的膠原基質(zhì)膜后，按
IX IO4 2 X IoVcm2密度接種軟骨細(xì)胞于膠原涂層多孔表面，靜置0. 5 4小時(shí)，加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液2 4mL，液面下培養(yǎng)2 4天，待細(xì)胞在多孔膠原基質(zhì)膜內(nèi)膠原纖維束貼附后，去除培養(yǎng)基。后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)參照步驟四完成制備。細(xì)胞膜片制備待完成細(xì)胞層接種后，翻轉(zhuǎn)膠原基質(zhì)膜，置于細(xì)胞培養(yǎng)用孔板。采用同樣方法將軟骨細(xì)胞接種脫細(xì)胞基質(zhì)材料疏松面表層，液面下培養(yǎng)2 7天。后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)參照步驟四完成制備。所述軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸鈉lmmol/L、L_谷氨酰胺10 500 y g/mL、維生素c(Vc)為50 100 ii g/mL、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-0 :)為5pg/mL 20ng/mL、堿性成纖維生長(zhǎng)因子-2 (bFGF-2)為5 50ng/mL，血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF-bb)為I 10ng/mL、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1) I 50ng/mL。所述的軟骨細(xì)胞，可選擇軟骨細(xì)胞或可向軟骨細(xì)胞分化的間充質(zhì)干細(xì)胞。該間充質(zhì)干細(xì)胞可為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞、牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、臍帶、臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞或者胚胎干細(xì)胞等的任何一種。步驟四、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)將接種軟骨細(xì)胞的膠原基質(zhì)膜加入旋轉(zhuǎn)細(xì)胞維持培養(yǎng)液中，該旋轉(zhuǎn)細(xì)胞維持培養(yǎng)液為軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)轉(zhuǎn)速10 25轉(zhuǎn)/分；每2天排空在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡；每2 3天換液一次，培養(yǎng)5 10天后，更換維持培養(yǎng)液，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5 15天，完成半月板損傷修復(fù)材料的制備。所述旋轉(zhuǎn)細(xì)胞維持培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸 10ml/L、L-谷氨酰胺 10 300 u g/mL,Vc 為 75 150 u g/mL,TGF- ^為 Ing 20ng/mL、bFGF-2 為 I 50ng/mL,血小板源性 roGF-bb 為 5pg 5ng/mL。前面步驟二所述制備多孔結(jié)構(gòu)膠原涂層的方法是對(duì)復(fù)合后材料采用物理交聯(lián)或化學(xué)交聯(lián)，或者二者結(jié)合的方式；物理交聯(lián)一采用紫外光照射交聯(lián)(4 15小時(shí))或者重度脫水交聯(lián)(如乙醇、丙酮、異丙醇);化學(xué)交聯(lián)一采用異氰酸鹽類(HDI)、?；B氮類(DPPA)、醌類(NDGA)、碳化二亞胺(EDC)、環(huán)氧化合物(EC)及其低聚物、聚乙二醇等化學(xué)交聯(lián)劑，也可以采用葡萄糖、核糖等生物交聯(lián)劑；交聯(lián)材料采用PBS緩沖液、生理鹽水、純水清洗后，凍干，環(huán)氧乙烷滅菌后備用。該修復(fù)半月板撕裂的生物材料，由脫細(xì)胞基質(zhì)膜、具有細(xì)胞因子及軟骨細(xì)胞復(fù)合的多孔結(jié)構(gòu)膠原基質(zhì)膜以及表層軟骨細(xì)胞膜片構(gòu)成內(nèi)層為含有生物活性蛋白并能夠保存細(xì)胞基質(zhì)成分的脫細(xì)胞基質(zhì)膜；中間層為脫細(xì)胞基質(zhì)膜致密面復(fù)合膠原并交聯(lián)，形成具有一定孔隙率及孔徑的特異性多孔支架結(jié)構(gòu)，復(fù)合具有誘導(dǎo)關(guān)節(jié)腔間充質(zhì)細(xì)胞定向遷入并促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)分泌的細(xì)胞因子，并接種軟骨細(xì)胞，形成細(xì)胞、因子、膠原復(fù)層結(jié)構(gòu)；采用細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)，在材料雙面結(jié)構(gòu)外層誘導(dǎo)形成軟骨細(xì)胞及其分泌基質(zhì)構(gòu)建的膜片，細(xì)胞密度更大，存活能力更強(qiáng)，組織結(jié)構(gòu)更好的生物材料，從而誘導(dǎo)該復(fù)合材料在半月板撕裂損傷修復(fù)過(guò)程中，實(shí)現(xiàn)損傷組織(特別是無(wú)血供區(qū)的組織)再生及功能重建。本發(fā)明之組織工程材料，為組織工程技術(shù)在半月板損傷功能重建中的應(yīng)用提供了新的方向。該發(fā)明的特點(diǎn)如下(I)采用脫細(xì)胞基質(zhì)膜作為該產(chǎn)品的“支架”，提供了膠原材料及細(xì)胞接種的材料。脫細(xì)胞基質(zhì)膜，其保留了細(xì)胞基質(zhì)活性成分，含有特殊的蛋白分子如纖維粘連素、層粘連素、膠原、EGF、bFGF等，可促進(jìn)損傷愈合及細(xì)胞增殖、表型維持的重要影響因素，其良好的韌性，能夠方便臨床操作。(2)通過(guò)預(yù)凍溫度設(shè)定、冷凍速度和凍干工藝等技術(shù)制備出具有多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜，提供了細(xì)胞遷入及細(xì)胞因子復(fù)合的空間，有利于誘導(dǎo)關(guān)節(jié)腔間充質(zhì)干細(xì)胞的遷入，發(fā)揮在半月板損傷修復(fù)中細(xì)胞的生物活性作用。(3)雙層軟骨細(xì)胞的接種培養(yǎng)，方便臨床治療半月板撕裂過(guò)程中與撕裂兩端組織細(xì)胞間通訊連接的建立，促進(jìn)材料中細(xì)胞與自體組織細(xì)胞遷入融合。同時(shí)，提高采用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)，促進(jìn)了細(xì)胞因子在材料中的復(fù)合及細(xì)胞在支架材料中的增殖速率及其基質(zhì)分泌能力，細(xì)胞膜片在材料表面的形成，可明顯促進(jìn)細(xì)胞間隙連接及組織形成，提高撕裂組織間建立聯(lián)系的能力，縮短重建時(shí)間，適用于半月板撕裂損傷特別是白區(qū)及紅白區(qū)損傷的治療和修復(fù)。


圖I、采用外科手術(shù)制備的兔半月板白區(qū)撕裂動(dòng)物模型；圖2、本發(fā)明實(shí)施例制備之修復(fù)半月板撕裂用生物材料示意圖；圖3、本發(fā)明實(shí)施例制備之生物材料的有效性示意圖。圖中，I為半月板紅區(qū)；2為半月板撕裂區(qū)域；3為半月板白區(qū)；4為正常半月板組織；5為再生半月板組織；6為正常半月板組織；7為軟骨細(xì)胞；8為正常半月板組織與新生半月板融合部位(膠原纖維連接);9為新生半月板組織。
具體實(shí)施例方式實(shí)例I、一種修復(fù)兔半月板撕裂的生物材料及其制備方法本實(shí)施例之半月板撕裂的生物材料，由內(nèi)層的脫細(xì)胞基質(zhì)膜、中間層的的多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜、外層的軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片構(gòu)成。中間層與內(nèi)層之間，通過(guò)注模、流延或刮板復(fù)合，中間層與外層之間，通過(guò)軟骨細(xì)胞接種膠原基質(zhì)膜復(fù)合。該修復(fù)兔半月板撕裂的生物材料的制備方法，依下述步驟進(jìn)行步驟一、脫細(xì)胞基質(zhì)膜的制備脫細(xì)胞人羊膜基質(zhì)的制備方法可參考文獻(xiàn)宋永周，崔慧先，王振顯，等.羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)的制備及其生物相容性[J].中國(guó)組織工程研究與、臨床康復(fù)，2008，12 (Ol) :51 55。羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)的制備無(wú)菌操作下取胎膜，鈍性分離去除絨毛膜組織，保留羊膜層。生理鹽水反復(fù)沖洗干凈后置于l%TritonX-100溶液中，置于恒溫水浴振蕩器中振蕩24小時(shí)，PBS漂洗后于0. 25%胰蛋白酶+0. 02%EDTA中37°C振蕩4小時(shí)，PBS充分漂洗，純水漂洗，冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒備用。取部分制備好的羊膜進(jìn)行小時(shí)E染色檢測(cè)。步驟二 具有多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜制備配置濃度為8mg/mL、pH值為3的膠原溶液所述的膠原溶液，用牛跟腱制備而成；將復(fù)水的脫細(xì)胞基質(zhì)材料(致密面向上)平整地平鋪固定于大小合適的醫(yī)用不銹鋼模具上，蓋上上蓋，脫細(xì)胞基質(zhì)材料與上蓋間有一定的空隙，形成可注入膠原溶液的毫米級(jí)薄層空腔，用注射器向空腔中注入上述膠原溶液，待膠原溶液充滿空腔后，將模具迅速放入可抽真空的容器中，抽真空脫氣。脫氣完全后，取出模具至于-80°C環(huán)境下，預(yù)冷3小時(shí)，卸去模具上蓋。然后用真空冷凍干燥機(jī)于_22°C條件下凍干24小時(shí)，再升溫至_2°C凍干16小時(shí)，最后升溫至20°C凍干10小時(shí)至材料完全干燥，控制使其孔徑300 600 ii m之間。該材料致密面多孔結(jié)構(gòu)成型,結(jié)合脫細(xì)胞基質(zhì)材料自身所具有的疏松面結(jié)構(gòu)，雙面多孔結(jié)構(gòu)得以實(shí)現(xiàn)。為了增加材料的強(qiáng)度及降解時(shí)間，該步驟對(duì)復(fù)合后材料采用化學(xué)交聯(lián)的方法以EDC為交聯(lián)劑，40%的酒精/NHS溶液為媒介，4°C條件下交聯(lián)處理24小時(shí)。然后用PBS緩沖液、生理鹽水、純水逐次清洗后，材料再次預(yù)凍，凍干，環(huán)氧乙烷滅菌后備用。步驟三、軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片制備分離培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞，獲取5代以內(nèi)軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，備用。細(xì)胞層軟骨細(xì)胞接種制備按2X IOVcm2密度接種于復(fù)合膠原涂層多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜表面，靜置4小時(shí)，加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液3mL，液面下培養(yǎng)2天，待細(xì)胞在多孔膠原膜內(nèi)膠原纖維束貼附后，去除培養(yǎng)基細(xì)胞膜片制備待完成細(xì)胞層接種后，翻轉(zhuǎn)膠原基質(zhì)膜，置于細(xì)胞培養(yǎng)用孔板。采用同樣方法將軟骨細(xì)胞接種脫細(xì)胞基質(zhì)材料疏松面表層，液面下培養(yǎng)3天。后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)參照步驟四完成制備。所述軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸鈉lmmol/L、L_谷氨酰胺10 u g/mL、維Vc為50 y g/ml,、TGF- |3 j 為 5pg/mL、bFGF-2 為 5ng/mL、roGF-bb 為 Ing/mL、IGF-I 為 Ing/mL。步驟四、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)將接種軟骨細(xì)胞的膠原材料加入旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，培養(yǎng)液為軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液；開始旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速15轉(zhuǎn)/分；每2天排空在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡；每2天換液一次，培養(yǎng)7天后，更換維持培養(yǎng)液，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)10天，完成半月板損傷修復(fù)材料的制備。所述維持培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸 10ml/L、L-谷氨酰胺 100 u g/mL、Vc 為 75 y g/mL, TGF-為 5ng/mL、bFGF_2為 10ng/mL, PDGF-bb 為 5pg/mL。該材料完成制備后植入兔關(guān)節(jié)半月板撕裂模型，縫合創(chuàng)口。12周取材標(biāo)本結(jié)果顯 示損傷缺損部位有較多類半月板組織形成，撕裂區(qū)域組織出現(xiàn)融合封閉，色澤與周圍正常的半月板組織相似。動(dòng)物生理活動(dòng)正常。實(shí)例2、一種修復(fù)兔半月板撕裂的生物材料及其制備方法
本實(shí)施例之生物材料，依次由內(nèi)層的脫細(xì)胞基質(zhì)膜、中間層的多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜、外層的軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片構(gòu)成。中間層與內(nèi)層之間，通過(guò)注模、流延或刮板復(fù)合，中間層與外層之間，通過(guò)軟骨細(xì)胞接種膠原基質(zhì)膜復(fù)合。該修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，依下述步驟完成步驟一、脫細(xì)胞基質(zhì)膜的制備該脫細(xì)胞基質(zhì)膜選用脫細(xì)胞豬小腸黏膜下層，其制備方法參考上述實(shí)施例I。步驟二 具有多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜制備配置濃度為3mg/mL、pH值為6的膠原溶液所述的膠原溶液，用牛皮制備而成；在脫細(xì)胞基質(zhì)材料致密面通過(guò)注模、流延或刮板制備多孔膠原涂層；通過(guò)預(yù)凍溫度設(shè)定、冷凍速度和凍干工藝來(lái)調(diào)節(jié)膠原層孔徑大小，使其孔徑大小控制在200 400 y m之間，制備并獲得具有附合多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜；該步驟對(duì)復(fù)合后材料采用物理+化學(xué)交聯(lián)的方法，即紫外交聯(lián)4小時(shí)后采用異氰 酸鹽類化學(xué)交聯(lián)劑；交聯(lián)材料采用PBS緩沖液、生理鹽水、純水清洗后，凍干，環(huán)氧乙烷滅菌后備用。步驟三、軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片制備分離培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞，獲取5代以內(nèi)軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，備用。細(xì)胞層制備按IXlOVcm2密度接種于復(fù)合膠原涂層多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜表面，靜置4小時(shí)，加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液2mL，液面下培養(yǎng)4天，待細(xì)胞在多孔膠原基質(zhì)膜內(nèi)膠原纖維束貼附后，去除培養(yǎng)基后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)參照步驟四完成制備。細(xì)胞膜片制備待完成細(xì)胞層接種后，翻轉(zhuǎn)膠原基質(zhì)膜，置于細(xì)胞培養(yǎng)用孔板。采用同樣方法將軟骨細(xì)胞接種脫細(xì)胞基質(zhì)材料疏松面表層，液面下培養(yǎng)7天。后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 參照步驟四完成制備。所述軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸鈉lmmol/L、L-谷氨酰胺IOOii g/mL、Vc為50 y g/mL.TGF-^ !為 Ing/mL、bFGF-2 為 50ng/mL、PDGF-bb 為 Ing/mL、IGF-I 為 Ing/mL。步驟四、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)將接種軟骨細(xì)胞的膠原材料加入旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，培養(yǎng)液為軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液；開始旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速20轉(zhuǎn)/分；每2天排空在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡；每2天換液一次，培養(yǎng)7天后，更換維持培養(yǎng)液，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)15天，完成半月板損傷修復(fù)材料的制備。所述維持培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸 10ml/L、L-谷氨酰胺 100 u g/mL,Vc 為 50 y g/mL,TGF- ^ :為 10ng/mL、bFGF_2為 25ng/mL, PDGF-bb 為 Ing/mL。完成材料制備后，采用手術(shù)法植入制備的兔半月板紅白區(qū)(低血供區(qū))撕裂部位?？p合創(chuàng)口后12周取材觀察修復(fù)效果。手術(shù)后動(dòng)物無(wú)死亡發(fā)生，3-4周兔步態(tài)恢復(fù)正常。12周時(shí)動(dòng)物生理活動(dòng)正常，行動(dòng)自如。取材標(biāo)本顯示，在半月板撕裂部位有新生組織形成，其質(zhì)地、色澤與周圍正常半月板組織相似，可見缺損處愈合良好；損傷部位相對(duì)應(yīng)的股骨及脛骨關(guān)節(jié)面光滑，該材料實(shí)現(xiàn)了半月板撕裂的組織再生及功能重建。實(shí)例3、一種修復(fù)兔半月板撕裂的生物材料及其制備方法本實(shí)施例之生物材料，依次由內(nèi)層的脫細(xì)胞基質(zhì)膜、中間層的多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜、外層的軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片構(gòu)成。中間層與內(nèi)層之間，通過(guò)注模、流延或刮板復(fù)合，中間層與外層之間，通過(guò)軟骨細(xì)胞接種膠原基質(zhì)膜復(fù)合。該修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，依下述步驟完成步驟一、脫細(xì)胞基質(zhì)膜的制備該脫細(xì)胞基質(zhì)膜選用人源性的脫細(xì)胞羊膜；制備方法同實(shí)施例I ;步驟二 具有多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜制備配置濃度為15mg/mL、pH值為3的膠原溶液，此膠原溶液，用鼠尾制備而成；在脫細(xì)胞基質(zhì)材料致密面通過(guò)注模、流延或刮板制備多孔膠原涂層；通過(guò)預(yù)凍溫度設(shè)定、冷凍速度和凍干工藝來(lái)調(diào)節(jié)膠原層孔徑大小，其孔徑大小可控制在50 300 ii m之間，制備并獲得具有附合多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜；該步驟對(duì)復(fù)合后材料采用物理交聯(lián)一采用紫外光照射交聯(lián)8小時(shí)，采用PBS緩沖液、生理鹽水、純水清洗后，凍干，環(huán)氧乙烷滅菌后備用。
步驟三、軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片制備分離培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞，獲取5代以內(nèi)軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，備用。細(xì)胞層軟骨細(xì)胞接種制備按I X IOfVcm2密度接種于復(fù)合膠原涂層多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜表面，靜置0. 5小時(shí)，加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液3mL，液面下培養(yǎng)2天，待細(xì)胞在多孔膠原基質(zhì)膜內(nèi)膠原纖維束貼附后，去除培養(yǎng)基后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)參照步驟四完成制備。細(xì)胞膜片制備待完成細(xì)胞層接種后，翻轉(zhuǎn)膠原基質(zhì)膜，置于細(xì)胞培養(yǎng)用孔板。采用同樣方法將軟骨細(xì)胞接種脫細(xì)胞基質(zhì)材料疏松面表層，液面下培養(yǎng)2天。后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)參照步驟四完成制備。所述軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸鈉lmmol/L、L-谷氨酰胺IOOii g/mL、Vc為75ii g/mL、TGF- ^ !為 Ing/mL、bF0000000000000GF-2 為 50ng/mL，PDGF-bb 為 10ng/mL、IGF-I 為50ng/mLo步驟四、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)將接種軟骨細(xì)胞的膠原材料加入旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，培養(yǎng)液為軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液；開始旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速25轉(zhuǎn)/分；每2天排空在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡；每3天換液一次，培養(yǎng)5天后，更換維持培養(yǎng)液，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5天，完成半月板損傷修復(fù)材料的制備。所述維持培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸 10ml/L、L-谷氨酰胺 100 u g/mL,Vc 為 75 y g/mL,TGF- ^ :為 10ng/mL、bFGF_2為 Ing/mL, PDGF-bb 為 5ng/mL。本實(shí)施例選用的軟骨細(xì)胞，為可向軟骨細(xì)胞分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，其誘導(dǎo)培養(yǎng)方法可參考Hyun Jung Yoo et al. Gene Expression Profile during Chondrogenesisin Human Bone Marrow der ived Mesenchymal Stem Cells us ing a cDNA Microarray.J Korean Med Sci. 2011;26(7) :851-858.。完成材料制備后，采用手術(shù)法植入制備的兔半月板白區(qū)(無(wú)血供區(qū))撕裂部位。在觀察期內(nèi)，新西蘭大白兔未出現(xiàn)術(shù)后感染，術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)無(wú)紅腫。術(shù)后2周步態(tài)基本恢復(fù)正常。實(shí)驗(yàn)組6周可見缺損處愈合良好，為白色新生組織所替代，質(zhì)地較堅(jiān)硬，相應(yīng)股骨和脛骨關(guān)節(jié)面光滑；12周可見缺損處已被半月板樣組織所替代，質(zhì)地、彈性和光澤度與周圍正常半月板幾乎無(wú)明顯差別，對(duì)應(yīng)股骨和脛骨關(guān)節(jié)面光滑，無(wú)明顯的摩擦征象。圖I為驗(yàn)證本發(fā)明制備的用于修復(fù)半月板撕裂的生物材料的有效性，采用外科手術(shù)制備的兔半月板白區(qū)撕裂動(dòng)物模型。圖中I為半月板紅區(qū)；2為半月板撕裂區(qū)域；3為半月板白區(qū)。在進(jìn)行動(dòng)物有效性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，將用本發(fā)明制備的修復(fù)半月板撕裂用生物材料，植入半月板撕裂區(qū)。圖2為采用本發(fā)明方法制備的修復(fù)半月板撕裂用生物材料，植入兔半月板撕裂區(qū)域后12周取材結(jié)果。圖中4為正常半月板組織；5為再生半月板組織。大體照結(jié)果顯示在兔半月板撕裂損傷部位有新生組織形成，撕裂縫隙基本消失，兩側(cè)半月板組織融合，表面平整度良好。該結(jié)果顯示采用本發(fā)明制備的用于修復(fù)半月板撕裂的生物材料具有良好的組織損傷再生及功能恢復(fù)能力，可實(shí)現(xiàn)半月 板撕裂的再生修復(fù)；圖3為采用本發(fā)明方法制備的生物材料有效性驗(yàn)證12周取材組織學(xué)檢測(cè)圖片，圖中6為正常半月板組織；7為軟骨細(xì)胞；8為正常半月板組織與新生半月板融合部位(膠原纖維連接);9為新生半月板組織?？梢钥闯觯瑢?shí)驗(yàn)組撕裂部位有較多類似半月板組織形成，膠原纖維排列不規(guī)則，可見大量軟骨細(xì)胞，愈合組織與正常組織之間以膠原纖維相連，新生組織與正常組織融合，色澤與周圍正常半月板組織相似但有分界。該組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明采用本發(fā)明制備的用于修復(fù)半月板撕裂的生物材料能夠在體內(nèi)環(huán)境下，對(duì)半月板撕裂損傷進(jìn)行有效的修復(fù)及組織再生。下面是采用本發(fā)明之修復(fù)半月板撕裂的生物材料進(jìn)行動(dòng)物有效性試驗(yàn)的簡(jiǎn)況選取約2. 5-3kg重新西蘭白兔，麻醉后雙側(cè)膝關(guān)節(jié)部位剪毛，活動(dòng)兔膝關(guān)節(jié)捫及兔膝關(guān)節(jié)后方股骨與與脛骨成角的頂點(diǎn)，據(jù)此捫及關(guān)節(jié)間歇，在膝關(guān)節(jié)后外側(cè)緣沿關(guān)節(jié)間歇向前約3mm標(biāo)記進(jìn)針位置。常規(guī)消毒鋪巾，用小針刀垂直刺入關(guān)節(jié)間隙皮膚上的標(biāo)記點(diǎn)，刺入深度約4mm，刺入過(guò)程中初入時(shí)有比較韌的阻力感，隨后阻力感降低消失。針刀刃在與半月板長(zhǎng)軸垂直的方向上下劃動(dòng)切割外側(cè)半月板體部，刀刃上下劃動(dòng)抵至脛骨與股骨骨質(zhì)完全橫斷白區(qū)半月板。植入所制備的兔半月板撕裂修復(fù)生物材料，縫合，另一只兔膝半月板造白區(qū)撕裂，縫合后為空白對(duì)照；手術(shù)后動(dòng)物不作固定，籠中飼養(yǎng)自由活動(dòng)。12周后取材進(jìn)行大體觀察移植半月板撕裂部位有新生組織生成，裂口被線狀白色纖維瘢痕完全連接愈合，局部微凹陷，有光澤其顏色、質(zhì)地、平整度均與自體半月板組織趨于一致，與周圍正常半月板幾乎無(wú)明顯差別，對(duì)應(yīng)股骨和脛骨關(guān)節(jié)面光滑，無(wú)明顯的摩擦征象。
權(quán)利要求
1.一種修復(fù)半月板撕裂的生物材料，其特征在于由多層結(jié)構(gòu)組成，即，依次由內(nèi)層的脫細(xì)胞基質(zhì)膜、中間層的多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜、外層的軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片構(gòu)成；中間層與內(nèi)層通過(guò)注模、流延或刮板工藝方法復(fù)合，外層通過(guò)軟骨細(xì)胞接種膠原基質(zhì)膜制備復(fù)合結(jié)構(gòu)，完成生物材料制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于，依下述步驟完成 步驟一、脫細(xì)胞基質(zhì)膜的制備該脫細(xì)胞基質(zhì)膜選用動(dòng)物源性脫細(xì)胞基質(zhì)膜或人源性的脫細(xì)胞羊膜，以傳統(tǒng)工藝制備而成； 步驟二、具有多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜的制備配置濃度為3 15mg/mL、pH值為3 6的膠原溶液，在脫細(xì)胞基質(zhì)材料致密面通過(guò)注模、流延或刮板制備多孔膠原涂層；通過(guò)預(yù)凍溫度設(shè)定、冷凍速度和凍干工藝來(lái)調(diào)節(jié)膠原層孔徑大小，控制其孔徑大小在50 600 y m之間； 步驟三、軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片的制備 細(xì)胞層軟骨細(xì)胞接種用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液浸潤(rùn)步驟二制備的膠原基質(zhì)膜后，按I X IO4 2 X IOVcm2密度接種軟骨細(xì)胞于膠原涂層多孔表面，靜置0. 5 4小時(shí)，加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液2 4mL，液面下培養(yǎng)2 4天，待細(xì)胞在多孔膠原基質(zhì)膜內(nèi)膠原纖維束貼附后，去除培養(yǎng)基；隨后，將接種軟骨細(xì)胞的膠原基質(zhì)膜加入旋轉(zhuǎn)細(xì)胞維持培養(yǎng)液中，該旋轉(zhuǎn)細(xì)胞維持培養(yǎng)液為軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，完成半月板損傷修復(fù)材料的制備 細(xì)胞膜片制備待完成細(xì)胞層接種后，翻轉(zhuǎn)膠原基質(zhì)膜，置于細(xì)胞培養(yǎng)用孔板。采用同樣方法將軟骨細(xì)胞接種脫細(xì)胞基質(zhì)材料疏松面表層，液面下培養(yǎng)2 7天；后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)參照步驟四完成制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟I所述的動(dòng)物源性脫細(xì)胞基質(zhì)膜或人源性的脫細(xì)胞羊膜，是脫細(xì)胞小腸粘膜下層、脫細(xì)胞心包膜、脫細(xì)胞腹膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟二所述調(diào)節(jié)膠原層孔徑，控制孔徑大小更優(yōu)在200 400 y m之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟二所述的膠原溶液，是用牛跟腱、皮膚、鼠尾的動(dòng)物源性材料制備而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟二所述制備多孔膠原涂層的方法是對(duì)復(fù)合后材料采用物理交聯(lián)或化學(xué)交聯(lián)，或者二者結(jié)合的方式； 所述物理交聯(lián)一采用紫外光照射交聯(lián)(4 15小時(shí))或者重度脫水交聯(lián)(如乙醇、丙酮、異丙醇); 所述化學(xué)交聯(lián)一采用異氰酸鹽類(HDI)、?；B氮類(DPPA)、醌類(NDGA)、碳化二亞胺(EDC)、環(huán)氧化合物(EC)及其低聚物、聚乙二醇等化學(xué)交聯(lián)劑，也可以采用葡萄糖、核糖等生物交聯(lián)劑；交聯(lián)材料采用PBS緩沖液、生理鹽水、純水清洗后，凍干，環(huán)氧乙烷滅菌后備用。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟三所述軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸鈉lmmol/L、L-谷氨酰胺10-500 y g/mL、維生素c (Vc)為50 100 V- g/mL、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF- P J為5pg/mL 20ng/mL、堿性成纖維生長(zhǎng)因子-2(bFGF-2)為5 50ng/mL,血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF-bb)為I 10ng/mL、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I) I 50ng/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟三所述的軟骨細(xì)胞，是軟骨細(xì)胞或可向軟骨細(xì)胞分化的間充質(zhì)干細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟三所述進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，其旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速為10-25轉(zhuǎn)/分；每2天排空在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡；每2-3天換液一次，培養(yǎng)5 10天后，更換維持培養(yǎng)液，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5 15天； 步驟三所述旋轉(zhuǎn)細(xì)胞維持培養(yǎng)液為軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、L-谷氨酰胺10 300 u g/mL、Vc為75 150 u g/mL、TGF-^ 為 Ing 20ng/mL、bFGF-2 為 I 50ng/mL，血小板源性 PDGF-bb為 5pg 5ng/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟三所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞、牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、臍帶、臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞或者胚胎干細(xì)胞的任何一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種修復(fù)半月板撕裂的生物材料及其制備方法。該材料由內(nèi)層的脫細(xì)胞基質(zhì)膜、中間層的多孔結(jié)構(gòu)膠原基質(zhì)膜、外層的軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片構(gòu)成。該修復(fù)材料，具有一定的彈性、韌性和良好的生物活性，軟骨細(xì)胞可以自行分泌細(xì)胞因子，并可通過(guò)關(guān)節(jié)腔滑液直接獲得營(yíng)養(yǎng)成分，加快半月板撕裂過(guò)程中與撕裂兩端組織細(xì)胞間通訊連接的建立，促進(jìn)材料中細(xì)胞與自體組織細(xì)胞遷入融合，縮短組織再生及功能重建時(shí)間，為臨床修復(fù)半月板撕裂(包括血供區(qū))損傷中特別是無(wú)血區(qū)及低血區(qū)的組織再生及功能重建提供了一種理想的新材料和材料的制備方法。
文檔編號(hào)A61L27/24GK102716515SQ20121022472
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月2日
發(fā)明者田智泉 申請(qǐng)人:陜西博鴻生物科技有限公司