專利名稱：類胰高血糖素促胰島素的多肽類似物組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用于藥物研究和開發(fā)的有機(jī)和多肽化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了用于向上調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的胰島素表達(dá)和治療糖尿病的新型的多肽衍生物和組合物。
胰島中激素的分泌受復(fù)雜的控制機(jī)制調(diào)節(jié)，其不僅受血載代謝產(chǎn)物如葡萄糖、氨基酸和兒茶酚胺的作用，也受局部旁分泌的影響。主要的胰島激素，胰高血糖素，胰島素和促生長激素釋放抑制因子與特定的胰腺細(xì)胞類型(分別為A，B和D細(xì)胞)相互作用，調(diào)節(jié)分泌應(yīng)答。雖然胰島素的分泌主要受血液葡萄糖水平的控制，但促生長激素釋放抑制因子抑制葡萄糖介導(dǎo)的胰島素的分泌。除胰島素分泌的島間旁泌調(diào)節(jié)外，有證據(jù)表明腸道中存在著促胰島素因子。這一概念源自下列事實(shí)的發(fā)現(xiàn)，即口服葡萄糖與相應(yīng)量的靜脈注射葡萄糖相比是更有效的胰島素分泌的刺激物。
人胰高血糖素是由胰腺A細(xì)胞產(chǎn)生的29個(gè)氨基酸的激素，該激素屬于多基因族的結(jié)構(gòu)相關(guān)的多肽，這些多肽包括促胰液素，胃抑制多肽，血管作用的腸肽和glicentin。這些多肽多方面調(diào)節(jié)糖代謝，胃腸運(yùn)動(dòng)和分泌過程。然而，胰腺胰高血糖素主要的已認(rèn)知作用是促進(jìn)肝糖原分解和糖原生成，從而導(dǎo)致血糖水平的提高。從這一角度看，胰高血糖素的作用是胰島素的反向調(diào)節(jié)并可能導(dǎo)致伴隨糖尿病的高血糖癥(Lund，P.K.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，79345-349(1982))。
當(dāng)胰高血糖素與其在胰島素產(chǎn)生的細(xì)胞上的受體結(jié)合時(shí)，產(chǎn)生的CAMP增加，其反過來刺激胰島素的表達(dá)(Korman，L.Y.，等人，Diabetes，34 717-722(1985))。并且，高水平的胰島素通過反饋抑制機(jī)理向下調(diào)節(jié)胰高血糖素合成(Ganong，W.F.，Reviewof Medical Physiology，Lange Publications，Los Altos，California，P.273(1979))。因此，胰高血糖素的表達(dá)受胰島素的細(xì)微調(diào)節(jié)，并最終受血清葡萄糖水平的調(diào)節(jié)。
前胰高血糖素原，即胰高血糖素的前體，是由360個(gè)堿基對(duì)基因編碼并被加工形成胰高血糖素原(Lund，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79345-349(1982))。Patzelt，等人(Nature，282 260-266(1979)證明了胰高血糖素原可進(jìn)一步加工成胰高血糖素及另一個(gè)多肽。較后來的實(shí)驗(yàn)證明胰高血糖素原是羧基端裂解掉Lys-Arg或Arg-Arg殘基形成(Lund，P.K.，等人，Lopez L.C.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，805485-5489(1983)，和Bell，G.I.，等人，Nature 302716-718(1983)。Bell，G.I.，等人還發(fā)現(xiàn)胰高血糠素原含有三個(gè)分離的高度同源的肽區(qū)域，其被稱為胰高血糖素，類胰高血糖素肽1(GLP-1)和類胰高血糖素肽2(GLP-2)。Lopez.等人證明了GLP-1是-37個(gè)氨基酸的多肽，GLP-2是-34個(gè)氨基酸的多肽。對(duì)鼠前胰高血糖素原的結(jié)構(gòu)的類似研究揭示了蛋白水解斷裂點(diǎn)在Lys-Arg或Arg-Arg殘基處的相似行為，從而形成胰高血糖素，GLP-1和GLP-2(Heinrich，G.，等人，Endocrinol.，1152176-2181(1984))。最終發(fā)現(xiàn)，人、鼠、牛和倉鼠的GLP-1序列是相同的(Ghiglione，M.，等人，Diabetologia，27599-600(1984))。
由Lopez，等人得到的有關(guān)GLP-1的大小結(jié)論是通過研究人胰腺中發(fā)現(xiàn)的GLP-1的分子形式來確證的(Uttenthal，L.O.，等人，J.Clin.Endocrinol.Metabol.61472-479(1985))。他們的研究表明胰腺中的GLP-1和GLP-2分別為37和34氨基酸的多肽。
GLP-1和胰高血糖素的相似性使早期的研究者設(shè)想GLP-1可能具有生物活性。雖然一些研究者發(fā)現(xiàn)GLP-1能誘導(dǎo)鼠腦細(xì)胞合成cAMP(Hoosein，N.M.，等人，F(xiàn)ebs Lett.17883-86(1984))，但另一些研究者卻沒有識(shí)別出GLP-1的任何生理作用(Lopez.L.C.，等前述)。由于沒有能識(shí)別出GLP-l的任何生理學(xué)作用，使得一些研究者對(duì)GLP-1是否確實(shí)是一種激素產(chǎn)生疑問，并懷疑胰高血糖素和GLP-1的相關(guān)性是否可能是人為造成的。
現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)GLP-1的生物加工的形式具有促胰島素的特性并會(huì)推遲胃的排空。GLP-1(7-34)和GLP-l(7-35)由美國專利U.S.5,118,666公開，在此引為參考文獻(xiàn)。GLP-1(7-37)由美國專利U.S.5,120712公開，在此引為參考文獻(xiàn)。
GLP-1的變異體和類似物在本領(lǐng)域已公知。這些變異體和類似物包括，例如，GLP-1(7-36)，Gin9-GLP-1(7-37)，D-Gln9-GLP-1(7-37)，乙?；?Lys9-GLP-1(7-37)，Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)和Lys18-GLP-1(7-37)。GLP-1的衍生物包括，例如，酸加成鹽，羧酸鹽，低級(jí)烷基酯和酰胺(參見例如WO 91/11457)。通常已知各種已公開的GLP-1形式均可刺激胰島素分泌(促胰島素作用)和cAMP的形成(參見，例如，Mojsov，S.，Int.J.Peptide Protein Research，40333-343(1992))。
更為重要的是，許多研究者已證明各種體外實(shí)驗(yàn)與哺乳動(dòng)物，特別是人類的促胰島素應(yīng)答與外源給藥GLP-1，GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)酸之間具有可預(yù)見的關(guān)系(參見，例如，Nauck，M.A.，等人，Diabetologia，36741-744(1993)；Gutniak，M.，等人，NewEngland J.of Medicine，326(20)1316-1322(1992)；Nauck.M.A.等人，J.Clin.Invest.，91301-307)(1993)；和Thorens，B.，等人，Diabetes，421219-1225(1993))。
在發(fā)作糖尿病的成年人中引起高血糖癥的基本缺陷包括內(nèi)源胰島素分泌的減少和肌肉及肝組織對(duì)胰島素所產(chǎn)生的效果的反抗作用(Galloway，J.S.，Diabetes Care，131209-1239，(1990))。后者導(dǎo)致肝中過多的葡萄糖產(chǎn)生。因此，當(dāng)一個(gè)正常人以大約2mg/kg/分鐘的速率釋放葡萄糖時(shí)，已發(fā)作糖尿病的病人以超過2.5mg/kg/min的速率釋放葡萄糖，從而導(dǎo)致每24小時(shí)至少過量70g的葡萄糖。
如通過糖血紅蛋白的測量所顯示的，因?yàn)楦纹咸烟橇?、空腹時(shí)血液中葡萄糖水平和全身代謝控制間存在著高度相關(guān)性，(Galloway，J.A.，前述；和Galloway，J.A.，等人，Clin.Therap.，12460-472(1990))，顯而易見，要得到足以防止高血糖并發(fā)癥的全身代謝的正常水平，對(duì)空腹時(shí)血糖葡萄糖的控制是至關(guān)重要的。而現(xiàn)存的胰島素療法很少能在不引起明顯的血胰島素過多和低血糖的情況下使肝中葡萄糖量達(dá)到正常(Galloway，J.A.，和Galloway，J.A.，等人，前述)，因此需要采用其它療法。基于給藥GLP-1類似物的療法是所擇方法之一，并且也是本發(fā)明目的所在。
目前，含有使用GLP-1型分子的療法已存在明顯的問題，因?yàn)檫@類肽的血清半衰期很短。例如，GLP-1(7-37)的血清半衰期僅3至5分鐘。目前，除了腸道使用后被快速吸收和清除外，人們認(rèn)為二肽-肽酶IV(DPPIV)的活性很易使GLP-1(7-37)失活。因此急需具有生物活性的GLP-1(7-37)類似物，其可在非腸道使用后形成延長的藥效曲線。
因此，本發(fā)明的首要目的是提供新型的、化學(xué)修飾的多肽，其不僅能刺激II型糖尿病的胰島素分泌，還可產(chǎn)生其它有利的促胰島素反應(yīng)。本發(fā)明化合物在血清中比天然GLP-1(1-37)可保持較長的時(shí)間，這通過該化合物對(duì)DPP IV顯示的抵抗性或非腸道使用后比天然GLP-1(7-37)吸收和清除得較慢來達(dá)到。最令人驚訝的是，當(dāng)GLP-1(7-37)的單一取代物加和起來不能顯示出含所有取代物的化合物的生物活性時(shí)，本發(fā)明的一些化合物證明有協(xié)同效果。
本發(fā)明提供了具有下列通式的化合物R1-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe-Ile- (式1)其中R1選自4-咪唑丙?；?脫氨基組氨酰)，4-咪唑乙?；?-咪唑-α，α二甲基-乙?；?；R2選自C6-C10的無支鏈?；虿淮嬖?；R3選自Gly-OH或NH2；和
Xaa為Lys或Arg。
本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含本發(fā)明化合物與藥物上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑。本發(fā)明進(jìn)一步地提供一種對(duì)需要非胰島素依賴型糖尿病治療的哺乳動(dòng)物治療的方法，該方法包括對(duì)所說哺乳動(dòng)物使用有效量的本發(fā)明化合物。
在一種實(shí)施方案，本發(fā)明提供天然GLP-1(7-37)的類似物，通過在式1的肽部分的氨基末端以肽鍵連接上不同的R基?？蛇x擇地，本發(fā)明的另外的化合物是通過?；疞ys34殘基的ε氨基和通過在26位進(jìn)行限定的氨基酸的替換或改變羧基末端來制備。因此，當(dāng)制備本發(fā)明化合物時(shí)邏輯上第一步是制備式1所示的多肽骨架。
應(yīng)注明的是，本說明書所采用的命名圖式源于GLP-1的演變格式。本圖式中，已知的GLP-1(7-37)OH的氨基末端被指定為7位，羧基末端記為37位。因此，式1的第一位Ala殘基對(duì)應(yīng)于GLP-1(7-37)OH的8位殘基。同樣式1的Xaa對(duì)應(yīng)于GLP-1(7-37)OH的26位殘基，依次類推。
根據(jù)給出的此處公開的序列信息和本領(lǐng)域的固相蛋白質(zhì)合成技術(shù)，式1所示的蛋白部分可通過化學(xué)合成方法制備。重組DNA技術(shù)也可用來表達(dá)式1所示的蛋白質(zhì)骨架。
多肽的固相化學(xué)合成原理已為公知技術(shù)并可在本領(lǐng)域通常的教課書中找到，如Dugas H.和Penney，C.，Bioorganic Chemistry(1981)Springer-Verlag，NeW York，pgs，.54-92，Merrifield，J.M.，Chem.Soc.，852149(1962)，和Stewart和Young，Solid PhasePeptideSynthesis，pp.24-66，F(xiàn)reeman(San Francisco，1969)。
例如，式1的蛋白質(zhì)部分可通過使用430A肽合成儀(PE-AppliedBiosystems，Inc.，850 Lincoln Centre Drive，F(xiàn)oster City，CA 94404)和使用PE-Applied Biosystems提供的合成循環(huán)的固相技術(shù)進(jìn)行合成。Boc氨基酸和其它試劑從PE-Applied Biosystems和其它化學(xué)產(chǎn)品公司購得。采用雙偶方式的順序Boc化學(xué)被用于以對(duì)-甲基二苯甲基胺樹脂為原料制得C-末端酰胺。制備C-末端酸，使用相應(yīng)的PAM樹脂。使用已制備的羥基苯并三唑酯偶聯(lián)Asn，Gln和Arg。可使用下列所示的側(cè)鏈保護(hù)基Arg，甲苯磺酰基Asp，環(huán)己基Glu，環(huán)己基Ser，芐基Thr，芐基Tyr，4-溴羰苯氧基Boc的脫保護(hù)可在二氯甲烷中用三氟乙酸來實(shí)現(xiàn)。肽合成完成后可用含10％的間-甲酚的無水氟化氫(HF)將肽脫保護(hù)并從樹脂上裂解下來。側(cè)鏈保護(hù)基裂解和肽從樹脂上的裂解在-5℃至5℃時(shí)進(jìn)行，優(yōu)選冰上進(jìn)行60分鐘。除去HF后，肽/樹脂以乙醚清洗，用冰醋酸提取多肽并凍干。
保護(hù)、非保護(hù)和部分保護(hù)的GLP-1分子制備已為現(xiàn)有技術(shù)所描述。見美國專利U.S.5,120,712和5,118,666，在此引為參考文獻(xiàn)和Orskov，C.，等人，J.Bilo.Chem.，264(22)12826-12829(1989)和WO91/11457(Buckley，D.I.，等人，1991年8月8日公開)。
同樣，分子生物學(xué)的現(xiàn)有技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了另一途徑，通過該途徑能夠合成式1的蛋白質(zhì)部分。雖然采用固相肽合成或重組方法均可生產(chǎn)該蛋白質(zhì)部分，但優(yōu)選使用重組的方法，因?yàn)榭赡塬@得高產(chǎn)率。重組方法生產(chǎn)的基本步驟是a)分離編碼GLP-1的天然DNA序列或構(gòu)建合成的或半合成的編碼GLP-1的DNA，b)將編碼序更以適于或單獨(dú)的或是作為融合蛋白的表達(dá)蛋白的方式置于表達(dá)載體。
c)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適合的真核或原核生物宿主細(xì)胞，d)在允許GLP-1中間產(chǎn)物表達(dá)的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，并e)回收并純化重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
如前所述，編碼序列可以是全合成的或是對(duì)更長的天然胰高血糖素的編碼DNA修飾的結(jié)果。編碼前胰高血糖素原的DNA序列描述于Luns等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79345-349(1982)中，并且通過改變天然序列以獲得所需結(jié)果，它可用作本發(fā)明的化合物的半合成生產(chǎn)的起始原料。
合成基因，其在體外或體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯最終形成式l所示的蛋白質(zhì)部分可由領(lǐng)域所熟知的技術(shù)來進(jìn)行。由于基因密碼子的本身所具有的簡并性，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到可以構(gòu)建出大量的確定數(shù)目的DNA序列，所有這些序列均可編碼式1所示的多肽。
合成基團(tuán)構(gòu)建的方法已為本領(lǐng)域所熟知。見Brown，等人(1979)Methods in Enzymology，Academic Press，N.Y.，Vol.68，pgs.109-151。根據(jù)本文公開的氨基酸序列可以設(shè)計(jì)出編碼式1的蛋白骨架的DNA序列。一旦設(shè)計(jì)出來，則可用常規(guī)DNA合成儀器如Model380A或380B DNA合成儀(PE-Applied Biosystems，Inc.，850Lincoln Center Drive，F(xiàn)oster City，CA 94404)來生成該序列本身。
為有效地表達(dá)式1的多肽，通過使用合適的限制在許多適于重組DNA表達(dá)的任一載體中插入已設(shè)計(jì)的DNA序列。參見(Maniatis等人(1989)Molecular Cloning；A Laboratory Manual，ColdSprings Harbor Laboratory Press，N.Y.，Vol.1-3。限制性內(nèi)切酯的切割位點(diǎn)設(shè)計(jì)入編碼GLP-1中間體的DNA的任一末端以便于分離出或整合入已知的擴(kuò)增和表達(dá)載體。根據(jù)限制性內(nèi)切酯對(duì)所用的母體表達(dá)載體的切割方式選用特定的限制性內(nèi)切酶。選擇限制性位點(diǎn)以便用控制序列正確定向編碼序列來使所需蛋白質(zhì)的得到正確的框架閱讀和表達(dá)。編碼序列必須定位，以使其和啟動(dòng)子與表達(dá)載體的核糖體結(jié)合位點(diǎn)一起處于正確的閱讀框內(nèi)，啟動(dòng)子和表達(dá)載體的核糖體結(jié)合位點(diǎn)兩者均在表達(dá)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中起作用。
為使合成基因得到充分轉(zhuǎn)錄，其必須通過操作與啟動(dòng)子-操縱子區(qū)域相結(jié)合。因此，考慮到合成基因的ATG起始密碼子，合成基因的啟動(dòng)子-操縱基因區(qū)域處于同樣的序列方向。
本領(lǐng)域已熟知有大量的用于轉(zhuǎn)化原核和真核生物細(xì)胞的表達(dá)載體。見The Promega Biological Research ProductsCatalogue(1992)(promega Corp.，2800 Woods Hollow Road，Madison，WI，53711-5399)；和The Stratagene CloningSystems Catalogue(1992)(Stratagene Corp.，11011 NorthTorrey Pines Road，La Jolla，CA，92037)。美國專利U.S.4,710,473也描述了用于外源基因在E.Coli中高水平表達(dá)的環(huán)狀DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體。這些質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)化載體在重組DNA技術(shù)和下述過程中是非常有用的。
(a)賦予質(zhì)粒的在宿主細(xì)胞中的自述復(fù)制能力，(b)控制與宿主細(xì)胞培養(yǎng)物保養(yǎng)相關(guān)的溫度下的自主質(zhì)粒復(fù)制；(c)穩(wěn)定在宿主細(xì)胞群體中質(zhì)粒的保養(yǎng)；(d)直接合成宿主細(xì)胞群體中質(zhì)粒保養(yǎng)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)指示物。
(e)提供一系列限制性內(nèi)切酶的對(duì)質(zhì)粒的單一識(shí)別位點(diǎn)，和(f)終止mRNA轉(zhuǎn)錄。
這些環(huán)狀DNA質(zhì)粒在重組DNA技術(shù)中為保證外源基團(tuán)的高水平表達(dá)可做為有用的載體。
構(gòu)建完式1蛋白質(zhì)的表達(dá)載體后，下一步是將載體放入適當(dāng)?shù)募?xì)胞中，從而構(gòu)建得一個(gè)表達(dá)多肽的重組宿主細(xì)胞。用重組DNA載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的技術(shù)在本領(lǐng)域已熟知，并可見于通常的參考文獻(xiàn)如Maniatis等人，前述。宿主細(xì)胞可由真核生物或原核生物細(xì)胞構(gòu)建。
原核生物細(xì)胞通?？梢暂^高的速率生產(chǎn)蛋白質(zhì)并易于培養(yǎng)。在高水平細(xì)菌表達(dá)體系中表達(dá)的蛋白質(zhì)以顆粒有特點(diǎn)地集聚或包含高水平過度表達(dá)的蛋白質(zhì)的內(nèi)含物。這種蛋白質(zhì)集聚物典型地必須使用本領(lǐng)域熟知技術(shù)進(jìn)行溶解、變性和重折疊。見Kreuger等(1990)于Protein Folding，Gierasch和king編，pgs 136-142，American Association for the Advancement of SciencePublication No.，89-185，Washington，D.C；美國專利U.S.4,923,967。
制得式1的多肽骨架后，正如上述“本發(fā)明概述”中所定義的咪唑被加在肽的氨基末端生成本發(fā)明各種實(shí)施方案中的產(chǎn)物，用化學(xué)合成手段將味唑基團(tuán)偶聯(lián)于式1的多肽上。因?yàn)楸景l(fā)明中使用的所有有機(jī)基團(tuán)含有羧酸，所以可以通過類似于在多肽N-末端加氨基酸的固相蛋白合成方法加咪唑基。可選擇地，能夠用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)反應(yīng)方法加咪唑基的活化酯。
本發(fā)明優(yōu)選的咪唑基為4-咪唑丙?；?脫氨基組氨酰) 4-咪唑乙?；?，和 和4-咪唑-α，α-二甲基-乙酰基
最優(yōu)選基團(tuán)為4-咪唑丙?；景l(fā)明的另一實(shí)施方案是?；疞ys34殘基的ε氨基。優(yōu)選含有6至10個(gè)碳原子的直鏈?；映晌?，且最優(yōu)選無支鏈的C8。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括在式1的26位(Xaa)的氨基酸替代物。在該位置Lys和Arg是可接受的，優(yōu)選Arg。
本發(fā)明中也包括羧基末端的修飾。因?yàn)镽3可以是Gly-OH或NH2，Gly-OH比羧基末端為酰胺的實(shí)施方案更為優(yōu)選。
用本領(lǐng)域熟知的各種方法之一來實(shí)現(xiàn)在Lys34的ε氨基上加?；?。見Bioconjugate Chem“Chemical Modifications ofProteinsHistory and Applications”Pages 1，2-12(1990)；Hashimoto等，Pharmacuetical Res.“Synthesis ofPalmitoyl Derivatives of Insulin and their BiologicalActivity”Vol.6.No.2.171-176(1989)。
例如，在硼酸鹽緩沖液中用50％乙腈將辛酸的N-羥基-琥珀酰亞胺酯加到Lys-ε胺上。可在加咪唑基之前或之后將肽?；?。并且，若是用重組技術(shù)制備的多肽，在酶促裂解之前進(jìn)行?；强赡艿?。
本發(fā)明還包括GLP-1(7-37)類似物的鹽的形式。本發(fā)明的化合物可以具有充分的酸性或堿性，能與任一無機(jī)堿，無機(jī)及有機(jī)酸反應(yīng)形成鹽。通常采用的形成酸加成鹽的酸為無機(jī)酸，如鹽酸，氫溴酸，氫碘酸，硫酸，磷酸等，和有機(jī)酸如對(duì)-甲苯磺酸，甲磺酸，草酸，對(duì)溴苯基磺酸，碳酸，琥珀酸，檸檬酸，苯甲酸，乙酸等。這類鹽的例子包括硫酸鹽，焦硫酸鹽，硫酸氫鹽，亞硫酸鹽，亞硫酸氫鹽，磷酸鹽，磷酸氫鹽，磷酸二氫鹽，偏磷酸鹽，焦磷酸鹽，鹽酸鹽，溴化物，碘化物，乙酸鹽，丙酸鹽，癸酸鹽，辛酸鹽，丙烯酸鹽，甲酸鹽，異丁酸鹽，己酸鹽，庚酸鹽，丙炔酸鹽，草酸鹽，丙二酸鹽，丁二酸鹽，辛二酸鹽，癸二酸鹽，富馬酸鹽，馬來酸鹽，丁炔-1，4-二酸鹽，己炔-1，6-二酸鹽，苯甲酸鹽，氯苯甲酸鹽，甲基苯甲酸鹽，二硝基苯甲酸鹽，羥基苯甲酸鹽，甲氧基苯甲酸鹽，苯乙酸鹽，苯丙酸鹽，苯丁酸鹽，檸檬酸鹽，乳酸鹽，γ-羥基丁酸鹽，甘醇酸鹽，酒石酸鹽，甲磺酸鹽，丙磺酸鹽，萘-1-磺酸鹽，萘-2-磺酸鹽，扁桃酸鹽等，優(yōu)選的酸加成鹽是那些與無機(jī)酸如鹽酸，氫溴酸，尤其是鹽酸形成的鹽。
堿加成鹽包括那些由無機(jī)堿衍生物的鹽，如銨或堿金屬或堿土金屬的氫氧化物，碳酸鹽，碳酸氫鹽等。用于制備本發(fā)明鹽的這類堿包括氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化銨，碳酸鉀等。GLP-1(7-37)類似物的鹽的形式是特別優(yōu)選的。當(dāng)本發(fā)明化合物用于治療目的時(shí)，那些化合物也可使用鹽的形式，但鹽須是藥物上可接受的。
本發(fā)明的GLP-1(7-37)類似物證明具有促胰島素的活性。“促胰島素活性”一詞是指一種物質(zhì)刺激胰島素合成或表達(dá)的能力或引起該刺激的能力。
通過將化合物提供給動(dòng)物細(xì)胞，或?qū)⒒衔镒⑸淙雱?dòng)物體內(nèi)并分別監(jiān)測免疫反應(yīng)性的胰島素(IRI)釋放入培養(yǎng)基或動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)中的量來確定該化合物的促胰島素性質(zhì)。
雖然可使用能夠檢測IRI的任一種放射免疫測定法，但也使用該測定法改性方法。見J.D.M.等Acta Endocrinol.，70487-509(1972)，化合物的促胰島素性質(zhì)可由胰腺浸劑測定。見Penhos，J.C.等人，Diabetes，18733-738(1969)。
本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含與藥物上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑結(jié)合的本發(fā)明的化合物。使用制藥學(xué)領(lǐng)域熟知的技術(shù)來制備這種藥物組合物，優(yōu)選通過非腸道途徑，將本發(fā)明的藥物組合物，單獨(dú)給藥或與其它治療劑結(jié)合使用。尤其優(yōu)選的途徑是皮下給藥方式。
雖然給藥劑量可低些或高些，非腸道劑量的范圍為約1pg/kg至約1,000μg/kg體重。所需劑量依病人的病情的嚴(yán)重性和下列各種標(biāo)準(zhǔn)如病人的身高，體重，性別，年齡及病史情況而定。
在制備本發(fā)明的組合物時(shí)，通常含有至少一種本發(fā)明化合物的活性成份與一種賦形劑混合或被一種賦形劑稀釋，當(dāng)賦形劑用作稀釋劑時(shí)，它可以是半固體或液體材料，其作為活性成份的液體載體，固體載體或介質(zhì)。優(yōu)選液體賦形劑。
在制備制劑時(shí)，有必要將活性化合物磨粉使其與其它成份結(jié)合之前具有適當(dāng)?shù)念w粒大小。如果活性化合物基本上不溶，則它通常被磨成小于200目的顆粒。如果活性化合物基本上是水溶性的，則顆粒大小通常通過研磨調(diào)節(jié)以提供一種在制劑中基本上均一的分布，如約40目。
采用本領(lǐng)域熟知的方法將本發(fā)明的組合物進(jìn)行配制以便病人在給藥后活性成份得到快速、持續(xù)或延緩釋放。組合物優(yōu)選以單位劑量形式進(jìn)行配制，每劑通常含有約50μg至100mg的，更為普遍的是約1mg至10mg的活性成分。“單位劑量形式”一詞指物理上分離的單元，適于作為用于人或其它哺乳動(dòng)物時(shí)的單元?jiǎng)┝?，每一單位含有預(yù)定的活性物質(zhì)的量，該量是通過與適宜的藥物賦形劑一起可產(chǎn)生所需的治療效果而計(jì)算出的。
為非腸道給藥的目的，含有本發(fā)明化合物的組合物優(yōu)選在一適當(dāng)PH時(shí)與蒸餾水組合。可采用另外的制藥方法控制作用持續(xù)時(shí)間。通過使用聚合物配合或吸收本發(fā)明化合物的方法獲得控制釋放制劑。通過選擇適合的大分子(如聚酯，聚氨基酸，聚乙烯吡咯烷酮，乙烯乙酸乙烯酯，甲基纖維素，羧甲基纖維素和硫酸魚精蛋白)和大分子的濃度以及為了控制釋放目的結(jié)合的方法來實(shí)施控制釋放。
通過控制釋放制劑控制作用持續(xù)時(shí)間的另一種可能的方法是將本發(fā)明化合物結(jié)合入聚合物質(zhì)的顆粒中，如聚酯，聚氨基酸，水凝膠，聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。
可選擇地，代替將化合物結(jié)合入這些聚合物顆粒的方法，可以是將本發(fā)明化合物埋入制好的微膠囊中，例如使用凝聚技術(shù)或界面聚合作用制備的微膠囊，如分別得到的羥甲基纖維素或明膠微囊，或者將本發(fā)明化合物置于膠體藥物送藥體系中，如脂質(zhì)體，白蛋白微球體，微乳液，纖顆粒和纖膠囊或?qū)⒈景l(fā)明化合物置于粗乳液中。這些技術(shù)均公開于Remington′s Pharmaceutical Sciences(1980)。
本發(fā)明化合物具有促胰島素的活性。因此，本發(fā)明的另一方面，是提供一種增強(qiáng)胰島素的表達(dá)的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物的胰腺B-型胰島細(xì)胞提供有效量的本發(fā)明化合物。
相似地，本發(fā)明提供一種對(duì)哺乳動(dòng)物特別是人在需要這種治療時(shí)治療糖尿病的方法，包括給予該哺乳動(dòng)物有效量的本發(fā)明化合物或組合物。
順便說明，下列實(shí)施例用以幫助描述如何實(shí)施本發(fā)明的各種實(shí)施方案。這些實(shí)施例并不意味著限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1(Arg 26)GLP-1(8-37)OH的合成在Model 430A多肽合成儀(PE-Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA)上用Boc保護(hù)策略以固相合成方法制備式1中當(dāng)Xaa為Arg和R3為Gly-OH時(shí)的多肽部分。側(cè)鏈保護(hù)基為Asp(Chxl)，Glu(OBzl)Ser(Bzl)，Thr(Bzl)，Lys(Cl-Z)，His(BOM)，Trp(CHO)，Tyr(Br-Z)和Arg(Tos)。除Asp(chxl)(Peptides Internationad)外所有的均得自PE-Applied Biosystems?；蛘哂肈CC起始的對(duì)稱酸酐或HOBT活化作用使每一殘基雙偶合，留下30個(gè)殘基中間體與樹脂連接。
實(shí)施例2N-咪唑基丙酰(Arg 26)GLP-1(8-37)OH的合成通過將0.5gm(1.8mmol)N-Cbz-咪唑-4-基丙酸置于兩組中的每一組組氨酸藥簡(cartridges)中，并在430A型多肽合成儀上進(jìn)行一般的組氨酸雙偶聯(lián)環(huán)反應(yīng)，從而將N-Cbz-咪唑-4-基丙酸(R.G.Jones，J.Amer.Chem.Soc.，71，383(1949)偶聯(lián)到實(shí)施例1中所描述的肽(8-37)肽基樹脂上。
在4℃下用20ml 20％哌啶的DMF(二甲基甲酰胺)溶液處理所制備的被改性肽基樹脂1小時(shí)以除去Trp(CHO)保護(hù)。用CH2Cl2將大約(2.6gm)被改性的肽基樹脂洗滌數(shù)次，轉(zhuǎn)置于一聚四氟乙烯反應(yīng)容器中并在真空中干燥。將2ml間甲酚和一個(gè)電磁攪拌棒加入與HF發(fā)生器(Pennisula Laboraties，Inc.)相連的反應(yīng)器中，冷卻至-78℃，抽真空，且20-25ml HF冷凝至反應(yīng)器中。在冰浴中將反應(yīng)混合物攪拌60分鐘；然后真空移去HF。將被改性的肽殘基(GLP-1類似物)懸浮在200ml乙醚中，并稍稍攪拌。然后用-60ml多孔玻璃濾斗將固體物濾出。用乙醚洗滌固體兩遍后，通過用50％乙酸水溶液和10％乙酸水溶液各40ml洗滌固體來增溶GLP-1類似物。將100ml合并的濾液水溶液移出，并用以下條件準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)的HPLC分析緩沖液A)0.1％TFAB)0.1％TFA/50％CH3CN柱Vydac C18(0.46×15cm)溫度45℃流速1.0ml/min檢測器214nm梯度0％B進(jìn)行5分鐘，然后從0至100％B進(jìn)行60分鐘。
剩余的濾流水溶液(大約90ml)分為兩部分，每一部分被裝載到2.2×25cm Vydac C18柱上，室溫下進(jìn)行制備色譜(PharmaciaFPLC)，在214nm處監(jiān)測。每5分鐘收集一級(jí)分，洗脫速度為4ml/分鐘，梯度由20％B開括(A和B如上文所定義)，以100％B終止，歷時(shí)790分鐘，在室溫下進(jìn)行。
用HPLC分析有UV吸收的級(jí)分，并將被選擇的級(jí)分(61-67)合并且凍干，得到114mg標(biāo)題化合物。用類似方式，由第二部分得到175mg。用快速原子轟擊(FAB)，質(zhì)譜分析，和氨基酸分析對(duì)GLP-1類似物進(jìn)行表征。分子離子峰的發(fā)現(xiàn)(3369.2)與理論分子量(3368.7)＋1相吻合。氨基酸的比例與所需要的產(chǎn)品一致
氧基酸理論值實(shí)測值A(chǔ)sp11.00Thr21.84Ser32.55Glu43.96Gly43.98Ala44.07Val21.95Ile10.9Leu21.94Tyr10.92Phe21.86Lys10.96Arg21.55實(shí)施例3N-咪唑基丙酰(Arg 26(Nε-辛?；?賴氨酰34)))GLP-1(8-37))OH的合成用以下方法用Lys34的Nε一氨基上的N-琥珀酰亞胺基辛酸酯使N-咪唑丙基(Arg 26)GLP-1(8-37)OH?；?。
將實(shí)施例1和2中制備的N-咪唑基丙酰(Arg 26)GLP-1(8-37)OH(70.5mg；0.021mmol)溶解在25m1二甲亞砜(DMSO)中。然后加入N-琥珀酰亞胺基辛酸酯(19.1mg；0.079mmol)并攪拌入溶液中。加入10倍摩爾過量的四甲基胍(26.2ml；0.21mmol)，以使ε-氨基完全去保護(hù)。室溫下攪拌混合物，并用HPLC檢測。45分鐘后用100ml的0.1N HCl終止反應(yīng)。使混合物通過一玻璃漏斗中的玻璃棉塞去除凝膠狀顆粒。
用以下條件在C4反相制備HPLC柱上從起始反應(yīng)物中分離標(biāo)題產(chǎn)物緩沖液A)0.1％TFA，5％乙腈B)0.1％TFA，95％乙腈柱vydac C4(2.2×25cm)溫度 室溫流速 2.0ml/分鐘監(jiān)測器280nm梯度 25-55％B歷時(shí)300分鐘。
如用HPLC分析各級(jí)分所測定的，在44.6至46.7％乙腈下洗脫標(biāo)題產(chǎn)物。收集合適的級(jí)分，冷凍并凍干。反應(yīng)得到22.7mg(32％)，用HPLC分析純度大約為87％的標(biāo)題產(chǎn)物。
用以下條件，用第二次制備HPLC步驟，在pH＝7.7條件下，進(jìn)行進(jìn)一步的純化緩沖液A)0.1M(NH4)HCO3，10％乙腈B)0.1M(NH4)HCO3，50％乙腈柱Vydac C18(2.2×25cm)溫度 室溫流速 2.0ml/分鐘監(jiān)測器280nm梯度 50-90％B歷時(shí)300分鐘。
將樣品(22.7mg)溶解在20ml緩沖液A中，并裝載上柱。用上述梯度分離各組份。如HPLC分析測定的在34.8和35.6％乙腈之間洗脫出標(biāo)題產(chǎn)物。合并合適的級(jí)分并凍干。得到10.46mg(46.1％)標(biāo)題產(chǎn)物，HPLC純度大約為99％，RP-HPLC兩步驟的總收率以重量計(jì)為14.8％。
實(shí)施例4N-咪唑基乙酰(Arg 26)GLP-1(8-37))OH的合成用下面的方法，通過用叔丁氧羰基保護(hù)咪唑環(huán)，由4-咪唑乙酸制備[N-(叔丁氧羰基)-咪唑-4-基]乙酸。碳酸氫二叔丁酯(1.1當(dāng)量/當(dāng)量的胺)被加入到游離胺，碳酸鉀(1.1當(dāng)量)和50％二噁烷水溶液的混合物中，室溫下將反應(yīng)混合物攪拌4小時(shí)。所得混合物用二乙醚稀釋并分離各層。含水相用1.0N檸檬酸水溶液酸化并用二氯甲烷萃取三次，將萃取液干燥(MgSO4)并真空去除溶劑。所得油狀物用合適的溶劑結(jié)晶。
通過將大約0.5gm(1.8mmol)[N-(叔丁氧羰基)-咪唑-4-基]乙酸置于兩組中每一個(gè)組氨酸藥筒中并如在實(shí)施例2中所述在430A型肽合成儀上進(jìn)行正常組氨酸雙偶聯(lián)環(huán)反應(yīng)，將[N-(叔丁氧羰基)-咪唑-4-基]乙酸偶聯(lián)到實(shí)施例1中描述的(8-37)肽基樹脂上。
被改性肽基從樹脂上釋放下來，基本上根據(jù)實(shí)施例2純化。用HPLC分析UV吸收級(jí)分，然后合并凍干得到大約100mg標(biāo)題化合物。然后用快速原子轟擊(FAB)和質(zhì)譜分析對(duì)樣品進(jìn)行表征。發(fā)現(xiàn)分子離子峰與理論分子量相一致。
實(shí)施例5N-[咪唑-α，α-二甲基-乙酰]GLP-1(8-37)OH的合成如下由N-三苯甲基-α，α-二甲基-4-咪唑-乙腈[J.I.DeGraw，et al.，JMC，20，1671(1977)]制備α，α-二甲基-α-[N-(叔丁氧羰基)咪唑-4-基]乙酸。
將N-三苯甲基-α，α-二甲基-4-咪唑乙腈(3.97g，10.5mmol)加至5％濃鹽酸/甲醇溶液(25ml)中，并在真空濃縮之前回流3小時(shí)。殘余物分配在5N鹽酸水溶液(25ml)和乙酸乙酯(50ml)之間。將含水相分離并回流24小時(shí)。真空濃縮后，將α，α-二甲基-4-咪唑乙酸粗產(chǎn)品溶解于水并再濃縮。用上述的一般方法由該粗產(chǎn)品制得標(biāo)題化合物(1.88g，mp，155℃(分解))。
然后基本上根據(jù)上述實(shí)施例，將α，α-二甲基-α-[N-(叔丁氧羰基)咪唑-4-基]乙酸偶聯(lián)到(8-37)肽基樹脂上。
實(shí)施例6N-咪唑乙酰-GLP-1(8-36)NH2的合成在使用MBHA樹脂(ABI，Lot#AIA023，0.77mmol/g)的應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)(460A多肽合成儀上通過固相肽化學(xué)制備GLP-1(8-36)NH2。所有的氨基酸具有被叔丁氧羰基(t-Boc)保護(hù)的α氨基。帶反應(yīng)側(cè)鏈的氨基酸被如下保護(hù)Arg(tos)；Lys(C1-Z)；Trp(CHO)；Glu(CHex)；Tyr(Br-Z)；Ser(Bzl)；Asp(OBzl)；Thr(Bzl)。
每當(dāng)量氨基酸用二分之一當(dāng)量的二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)在二氯甲烷(DCM)中活化被保護(hù)氨基酸，得到氨基酸的對(duì)稱酸酐。但精氨酸，谷氨酰胺和甘氨酸殘基是通過生成這些氨基酸的1-羥基苯并三唑(HOBt)酯(在二甲基甲酰胺(DMF)中，氨基酸，HOBt和DCC的當(dāng)量比為1∶1∶1)而活化。
用一系列偶聯(lián)和去保護(hù)循環(huán)由C-末端至N-末端順序?qū)埢?lián)接。偶聯(lián)過程包括被活化氨基酸被先前被偶聯(lián)的氨基酸的自由伯胺進(jìn)行親核取代。用無水三氟乙酸(TFA)去除N-末端保護(hù)基Boc進(jìn)行去保護(hù)。用二異丙乙胺(DIEA)中和后產(chǎn)生一個(gè)自由胺基。
合成量是0.5mmol。MBHA-樹脂的官能位點(diǎn)的濃度是0.77mmol/g，用649mg樹脂。對(duì)所有的氨基酸使用了二倍摩爾過量的對(duì)稱酸酐。通過標(biāo)準(zhǔn)方法將C-末端精氨酸偶聯(lián)到MBHA-樹脂上。所有的殘基都是雙偶合的。即每一殘基偶聯(lián)到樹脂上兩次。第二次偶聯(lián)是在再加偶聯(lián)氨基酸之前沒有Boc去保護(hù)作用下進(jìn)行的。這有助于樹脂上所有游離胺基團(tuán)的完全反應(yīng)。色氨酸殘基被四倍偶合。
基本上根據(jù)上述實(shí)施例用肽基樹脂和實(shí)施例4中的R基團(tuán)制備標(biāo)題化合物。將R基團(tuán)加至氨基酸殘基且甲?；蝗コ?，通過用聚四氟乙烯反應(yīng)容器用氫氟酸液體(HF)把樹脂在0℃下水解1小時(shí)，使多肽從樹脂上解脫下來。對(duì)于每克肽基樹脂，加入lml間-甲苯酚清除劑并使用10ml HF液體。清除劑阻止側(cè)鏈保護(hù)基(作為碳陽離子被釋放)與多肽再反應(yīng)。一小時(shí)后，真空去除HF，剩下肽，樹脂和m-甲苯酚淤漿。
然后在冰冷的二乙醚在HF反應(yīng)器中將肽沉淀。將沉淀物移至-150ml燒結(jié)玻璃漏斗中并用乙醚淋洗幾次。肽/樹脂物理混合物用冷乙醚洗滌幾次去除殘余的HF和間-甲苯酚。第二步是用10％的乙酸水溶液(V/V)從樹脂中將肽萃取出來。真空抽濾，濾液濾到一干凈圓底燒瓶中得粗產(chǎn)品肽溶液。
實(shí)施例7體外受體結(jié)合測定(cAmp測定)a)鼠，GLP-1受體，膜制備使用被公開的鼠GLP-1受體DNA序列(Thorens B.，et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.898641-8645(1992))和二氫葉酸還原酶抵抗標(biāo)記基因與PCR技術(shù)結(jié)合構(gòu)建一個(gè)表達(dá)媒介。用該媒介轉(zhuǎn)化中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系的DXB-11變種，得到表達(dá)鼠GLP-1膜受體的重組CHO細(xì)胞系。
生長細(xì)胞并采集之，首先用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，然后用冷的緩沖液(25mM HEPES，2mM MgCl2，1mM EDTA，20μg/ml亮肽素，1mMPMSF，2μg/ml抑肽酶，50μg/ml胰蛋白酶抑制劑，pH8.0)洗滌二次并再懸浮于緩沖液中，得到膜制品。在玻璃聚四氟乙烯均化器中將細(xì)胞懸浮液進(jìn)行細(xì)胞溶解。將所得樣品在4℃以353,00Xg離心30分鐘。移去上清液，將沉淀物再懸浮于冷緩沖液中并均化。分成等份在-80℃下保存。b)環(huán)AMP(cAMP)測定一膜制品的樣品與被試化合物和對(duì)比化合物一起在緩沖液(25mM HEPES，0.2％(W/V)BSA，pH7.6)中在32℃預(yù)溫育10分鐘。加入反應(yīng)緩沖液(終濃度25mM HEPES，0.2％(W/V)BSA，2.6mM Mg，0.8mM ATP，0.1mM GTP，5mM磷酸肌酸，肌酸激酶50u/ml，0.2mMIBMX，pH7.6)，再溫育30分鐘。通過加入10mM EDTA終止溫育。
用熒光示蹤免疫測定方法測定cAMP產(chǎn)物。簡單地說，停止溫育后，加入熒光示蹤物(cAMP-b藻紅素共軛物)，然后加入被親合純化的抗-cAMP免抗血清。室溫溫育45分鐘后，加入抗兔IgG涂層的測定小球，再溫育15分鐘。然后將平片抽真空并在Pandex PFCIA讀數(shù)器上讀數(shù)。
在該測定中，由于增長的cAMP濃度，已知的促胰島素劑如GLP-1(7-37)OH顯示出降低的熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度值與cAMP產(chǎn)物的比例相關(guān)(pmol/min/mg)。相反，沒有促胰島素作用的試劑沒有激發(fā)cAMP產(chǎn)物，因而沒有顯示熒光強(qiáng)度的降低。
表1cAMP測定化合物％相對(duì)效力GLP-1(7-37)OH 100.0±18Arg26-GLP-1(7-37)OH 140.8±28.7N-咪唑基丙酰基-GLP-1 21.9±7.8(8-37)OHN-咪唑基丙?；?Arg2689.0±12.6GLP-1(8-37)OHN-咪唑并丙酰Arg26-8.8±1.4aLys34-Nε-辛酰基-GLP-1(8-37)OHGLP-1(7-36)NH288.4±29.4N-咪唑基乙酰-GLP-1(8-36)NH224.2±9.8N-咪唑基乙酰-Arg26- 95.0±14.3GLP-1(8-37)OHα，α-咪唑基乙酰- 108.2±22.4GLP-1(8-37)OHa酰基化化合物由于非特定結(jié)合，通常給出人為低的效力值。
實(shí)施例8狗體內(nèi)測定a)高血糖抑制研究在整夜禁食的神志清醒成年(1-2歲)體重8-15kg雄性和雌性小獵兔犬身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在研究前至少十天，用異氟烷麻醉動(dòng)物，并在左邊或右邊的腹股溝處切口。將硅橡膠導(dǎo)液管插入股動(dòng)脈和近側(cè)的尾股靜脈，并用4-0絲縫合線固定。導(dǎo)液管的自由端用套針針頭經(jīng)皮下穿至背部。然后用甘油/肝素溶液(3∶1，V/V；肝素終濃度為250KIU/ml)裝滿導(dǎo)管，將自由端打結(jié)并置于皮下囊袋中使皮膚完全閉合。KeflexR術(shù)前(20mg/kg/，IV和20mg/kg，I.M.)和術(shù)后(250mgP.O.，一日一次，連用七天)均施用以防感染。術(shù)后施用Torbugesic(1.5mg/kg，I.M.)以減輕疼痛。
在研究的前一天抽血檢查動(dòng)物的鍵康狀況，只有血細(xì)胞比容大于38％且白血球數(shù)低于16,000/nm3的動(dòng)物才能被使用。
實(shí)驗(yàn)前的下午，局部麻醉下(2％利多卡因)通過一小切口從皮下囊袋中將導(dǎo)液管自由端外置。用束縛系統(tǒng)套將狗固定并集合上頸圈。
實(shí)驗(yàn)的早晨，將導(dǎo)管內(nèi)容物吸收，并用鹽水沖洗內(nèi)容物，讓延長線(用不銹鋼鏈保護(hù))與導(dǎo)管接連。IV注射實(shí)驗(yàn)的早上，將經(jīng)針頭(over-the-needle)的聚四氟乙烯導(dǎo)管經(jīng)皮插入頭側(cè)靜脈，以準(zhǔn)備施用測試物質(zhì)的靜脈藥團(tuán)(bolus)。將狗置于代謝籠子中，導(dǎo)管延長部分和鏈與一鏈的轉(zhuǎn)節(jié)系統(tǒng)連接使狗能在籠內(nèi)自由走動(dòng)。這時(shí)，(-60分鐘)通過連接的靜脈導(dǎo)管進(jìn)行葡萄糖的外源輸注(50％W/V水溶液)。在研究的第一個(gè)六分鐘內(nèi)以向下點(diǎn)滴的形式注入葡萄糖，使血漿葡萄糖濃度快速升到150mg/dl。在剩余的研究中自始至終每2.5至7.5分鐘測定血漿葡萄糖濃度，并適當(dāng)調(diào)節(jié)葡萄糖輸液速度以保持血漿葡萄糖濃度在150mg/dl。
葡萄糖輸注起始(0時(shí))后六十分鐘，或通過事先插入的聚四氟乙烯導(dǎo)管的靜脈內(nèi)給藥(1.0，2.9，5.0或10.0μg/kg，溶解在2ml含0.3％狗血蛋白的鹽水中的劑型，W/V)或在頸背側(cè)皮下給藥(10μg/kg，150μM的磷酸緩沖鹽水溶液)施用測試物質(zhì)。
靜脈內(nèi)研究期間在-30，-15，0，2.5，5，7.5，10，12.5，15，20，30，45，60，75，90，105和120分鐘抽取動(dòng)脈血樣(3.5ml)，在皮下研究期內(nèi)在-30，-15，0，3，6，9，12，15，20，30，45，60，75，90，105和120分鐘抽取動(dòng)脈血樣(3.5ml)。將樣品采集在含EDTA二鈉的真空血采樣試管中，并立即置于冰中。為防止血漿樣品中GLP-1(7-37)蛋白分解的分裂，將含血的1.5ml EDTA轉(zhuǎn)移至一含40μl抑肽酶(10,000 KIU/ml)的聚丙烯試管中并混合均勻。將樣品離心，所得血漿轉(zhuǎn)至聚丙烯試管中并在冰中保存整個(gè)研究持續(xù)期。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將動(dòng)物麻醉(異氟烷)，用新鮮鹽水沖洗導(dǎo)液管并裝入甘油/肝素混合物；將導(dǎo)液管自由端打結(jié)并如前所述經(jīng)皮放置；并施用抗生素(300mg KeflexR，I.M.)。
在研究的當(dāng)天，在貝克曼葡萄糖分析儀中用葡萄糖氧化酶測定血漿葡萄糖濃度。其它測定樣品在-70℃貯存直至分析的時(shí)刻。以豬胰島素為標(biāo)準(zhǔn)用商售放射免疫藥盒測定胰島素濃度。用雙抗體免疫測定GLP-1(7-37)水平。
以t時(shí)間島胰素的濃度和注射測試物質(zhì)之前以時(shí)間平均的胰島素濃度(基線)之間的不同計(jì)算胰島素的變化。用不規(guī)則四邊形規(guī)則計(jì)算胰島素變化曲線下的面積。以時(shí)間間隔X內(nèi)葡萄糖輸入的速度和注射測試物質(zhì)前30分鐘內(nèi)的平均葡萄糖輸入速度(基線)之間的不同計(jì)算葡萄糖注入速度的變化。用不規(guī)則四邊形規(guī)則計(jì)算葡萄糖輸入速度變化曲線下的面積。用平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)列出所得值。b)血糖正常的抑制研究除在研究的整個(gè)過程中血漿葡萄糖濃度保持在或接近正?；A(chǔ)水平外，用與高血糖SC研究相同的方法進(jìn)行血糖正常抑制實(shí)驗(yàn)。為完成該實(shí)驗(yàn)，注射測試物質(zhì)后每2.5至5分鐘測定血漿葡萄糖濃度。當(dāng)血漿葡萄糖濃度的減少大于從預(yù)處理值開始的5mg/dl，就開始通過靜脈內(nèi)導(dǎo)管由外部輸入葡萄糖。(50％葡萄糖的水溶液，W/V)以努力保持血漿葡萄糖濃度接近基線。因?yàn)殪o脈線及其延伸被肝素化鹽水裝滿而沒有葡萄糖，因此起始輸入時(shí)間和葡萄糖實(shí)際進(jìn)入狗體的時(shí)間之間有一明顯的置后期。因?yàn)檫@個(gè)原因，給藥后一個(gè)短時(shí)間葡萄糖濃度降低于基線。為得到實(shí)際輸給狗的葡萄糖量的更精確的估算，得到麻木空間的體積估算值(930μl)，從而校正了葡萄糖輸注速度。
以t時(shí)間胰島素濃度和注射測試物質(zhì)前時(shí)間平均體胰島素濃度(基線)之間的不同來計(jì)算胰島素的變化。用不規(guī)則四邊形規(guī)則計(jì)算胰島素變化曲線下的面積，用平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)列出所得值。c)口服葡萄糖耐藥量試驗(yàn)用一組四夜禁食，重12-14kg雄性或雌性的小獵兔犬進(jìn)行口服葡萄糖耐藥量試驗(yàn)。動(dòng)物的準(zhǔn)備與上述相同。放置于代謝籠后，在實(shí)驗(yàn)開始前讓動(dòng)物適應(yīng)二十分鐘。在這一適應(yīng)期末，抽取零樣品，將一根30英寸24Fr。橡膠結(jié)腸管通過食管插入動(dòng)物的胃。通過管給胃施用葡萄糖藥團(tuán)(1.5g/kg；50％葡萄糖W/V的水溶液)，然后注入20ml蒸餾水藥團(tuán)，并開始計(jì)時(shí)。兩分鐘后，在頸側(cè)面注射實(shí)驗(yàn)物質(zhì)皮下藥團(tuán)(3nmol/kg或大約10μg/kg；150μM的磷酸鹽緩沖鹽水溶液)。
除零樣品外，在施用葡萄糖后5，10，15，20，30，40，50，60，75，90，105，120，135，150，165，180，195，210，225，225，和240分鐘抽取動(dòng)脈血樣3.5ml。將樣品收集在含EDTA二鈉鹽的真空血液收集管中并按上述進(jìn)行處理。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將動(dòng)物麻醉(異氟烷)；用新鮮鹽水沖洗導(dǎo)管并裝入甘油/肝素混合物；將導(dǎo)液管自由端打結(jié)并如上所述經(jīng)皮下放置；施用抗生素(300mg KeflexR，I.M.)。
在三種不同情況下研究四條狗的每一條一次皮下施用磷酸鹽緩沖鹽水；一次用GLP-1(7-37)OH，一次用N-咪唑基丙酰(Arg 26(Nε-辛?；?賴氨酰34)))GLP-1(8-37))OH。最少相隔一周進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的再研究。在所有實(shí)驗(yàn)的前一天測定白細(xì)胞數(shù)和血細(xì)胞比容。
用不規(guī)則四邊形計(jì)算基線以上(零時(shí)胰島素值)曲線下胰島素面積。用不規(guī)則四邊形規(guī)則計(jì)算基線以上(零時(shí)葡萄糖值)曲線下葡萄糖面積。用平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)列出所得值。
表2狗靜脈內(nèi)高血糖(150mg/dl)抑制試驗(yàn)化合物劑量 胰島素效最大胰 胰島素GIR(μg/kg) n果持續(xù)時(shí)島素變 變化AUC 變化AUC間 化 (ng/ml.分； (mg/kg；(分鐘)a (ng/ml)b0-60分)c0-60分鐘)d賦形劑 0 7無活性 0.8±0.27±14 238±46GLP-1(7-36)NH21.072.5 3.4±0.632±8 414±73N-咪唑基丙酰- 1.037.5 3.1±0.852±18 399±63GLP-1(8-37)OHN-咪唑基丙酰-Arg26- 1.0312.52.6±0.638±16 419±122GLP-1(8-37)OHL)ys34-Nε-辛?；?.0315 3.8±1.050±2 463±12GLP-1(7-37)OHN-咪唑基丙酰-Arg26- 1.0442.52.3±0.890±40 350±93Lys34-Nε-辛?；?5.0372.53.8±0.2132±7 568±126GLP-1(8-37)OHN-咪唑基丙酰-Arg26- 5.02無活性 0.9±0.914±10 236±58Lys34-Nε癸酰基GLP-1(8-37)OHa 胰島素效果持續(xù)時(shí)間胰島素平均變化始終≥0.5ng/ml的時(shí)間。b.最大胰島素變化在120分鐘實(shí)驗(yàn)期內(nèi)發(fā)現(xiàn)的基線以上的胰島素的最大增加。c.胰島素變化AUC胰島素變化曲線下的面積，代表肽的總的親胰島素效果。d.GIR變化AUC葡萄糖輸入速度變化曲線下的面積；代表肽的總的代謝的效果。
表3狗皮下高血糖(150mg/dl)抑制試驗(yàn)化合物劑量胰島素效最大胰 胰島素GIR(μg/kg) n果持續(xù)時(shí)島素變 變化AUC 變化AUC間 化 (ng/ml.分； (mg/kg；(分鐘)a (ng/ml)b0-120分)c0-120分鐘)d賦形劑 0 5無活性 0.4±0.211±20 528±224GLP-1(7-36)OH 10527 1.6±0.864±33 696±145N-咪唑基丙酰-Arg26- 10442 3.6±1.097±39 811±216GLP-1(8-37)OHLys34-Nε-辛?；?105無活性 0.6±0.329±8 532±112GLP-1(7-37)OH-Arg26- 104無活性 0.6±0.411±26 659±182Lys34-Nε-辛?；鵊LP-1(8-37)OHN-咪唑基丙酰-Arg26- 105＞902.0±0.4113±24 926±268Lys34-Nε辛?；鵊LP-1(8-37)OHa 胰島素效果的持續(xù)時(shí)間胰島素平均變化始終≥0.5ng/ml的時(shí)間。b 最大胰島素變化在120分鐘實(shí)驗(yàn)期內(nèi)發(fā)現(xiàn)的基線以上的胰島素最大增加。c 胰島素變化AUC胰島素變化曲線下的面積；代表肽的總的親胰島素效果。d GIR變化AUC葡萄糖輸入速度變化曲線下的面積；代表肽總的代謝效果。
實(shí)施例9鼠的體內(nèi)測定a)葡萄糖耐藥性試驗(yàn)用整夜禁食的，神志正常的體重大約250(Sprague Dawley鼠)或300(Zucker Diabetic Fatty鼠)克的雄性Sprague Dawley(Charles River)或Zucker Diabetic Fatty(Genetic Models，Inc.)鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在研究前4至5天，用異氟烷麻醉鼠，并將聚乙烯(PE 50)導(dǎo)液管插入頸靜脈。用傷口鉗固定導(dǎo)管，裝入含肝素的鹽水(2％肝素鈉)，用小的不銹鋼塞封口。
16小時(shí)禁食后，將12只長期插套管的鼠每組三只鼠分為四組。從尾靜脈抽取0.4ml(血樣，收集到含肝素鋰的微容試管中并立即置于冰中(零時(shí)刻樣品)。通過插入頸靜脈的導(dǎo)管施用葡萄糖藥團(tuán)(1.0g/kg，50％葡萄糖(W/V水溶液)，并用200μl鹽水沖洗導(dǎo)管。二十秒后通過頸靜脈導(dǎo)管給予測試物質(zhì)的藥團(tuán)[每100g體重量100μl賦形劑(含0.3％(W/V)牛血清白蛋白的鹽水)或含類似物的賦形劑]，如前沖洗導(dǎo)液管。在給葡萄糖藥團(tuán)后2，5，10，20和30分鐘再從鼠的尾部取血，如上處理血樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將血樣離心，收集血漿。
用偶聯(lián)的己糖磷酸激酶方法在臨床化學(xué)分析儀中在實(shí)驗(yàn)的當(dāng)天測定血漿葡萄糖濃度。用零校準(zhǔn)器稀釋用于胰島素測定的血漿并在-20℃冷凍至分析時(shí)。用鼠胰島素為標(biāo)準(zhǔn)，用商售放射免疫測定藥盒測定胰島素濃度。
以t時(shí)刻胰島素濃度和零時(shí)刻胰島素濃度之間的不同計(jì)算胰島素變化(由基線值開始胰島素的變化)。用不規(guī)則四邊形規(guī)則計(jì)算胰島素變化曲線下的面積。以t時(shí)刻血漿葡萄糖濃度與零時(shí)刻血漿葡萄糖濃度之間的差異計(jì)算血漿葡萄糖變化(基線值以上血漿葡萄糖的增加)。用不規(guī)則四邊形規(guī)則計(jì)算血漿葡萄糖變化曲線下的面積。以平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)列出所得值。b)高血糖抑制研究在長期插入導(dǎo)管的體重大約350克正常的雄性Sprague Dawley鼠身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在研究前至少一個(gè)星期，在異氟烷麻醉下對(duì)小鼠手術(shù)。在頸靜脈埋值兩導(dǎo)液管以輸注葡萄糖和肽，一根導(dǎo)管插入頸動(dòng)脈以取血樣。通過頭頂皮將導(dǎo)管外置，充入甘油/肝素溶液(3∶1，V/V)，并用一厘米不銹鋼塞封口。分別在網(wǎng)籠內(nèi)在室內(nèi)喂養(yǎng)動(dòng)物，使其自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)鼠什錦餡餅和水。
在實(shí)驗(yàn)前使插管小鼠整夜禁食。實(shí)驗(yàn)的早晨，將鼠稱重并使樣品試管與長期導(dǎo)管連接。將試管裝入輕的不銹鋼彈簧片中以保護(hù)。研究期間，將鼠自由地放在帶大約1英寸鋪墊的塑料鞋盒籠中(12＂×10＂×12＂)。適應(yīng)15分鐘后，抽取基樣測定胰島素和葡萄糖含量。在-60分鐘時(shí)間時(shí)，給鼠20％葡萄糖藥團(tuán)將血漿葡萄糖升至150mg/dl。通過每五分鐘測定血漿葡萄糖濃度并相應(yīng)調(diào)節(jié)被校準(zhǔn)的變化的輸注泵，使血漿葡萄糖濃度在研究期間內(nèi)保持在該水平。在-15和0分鐘采集血樣用于基線測定。抽取零分鐘樣品后立即通過頸靜脈導(dǎo)管注入肽(130-155μM現(xiàn)有濃度，在磷酸緩沖鹽水中稀釋)。并用鹽水沖洗。在2，4，6，8，10，12，15，20，25，30，40，50，60，70，80和90分鐘抽取血樣測定胰島素和葡萄糖，所有血樣收集在肝素鈉涂層的注射器中，移至微離心試管并置于冰中。然后在微離心機(jī)中將血樣離心分離血漿成份。
研究的同一天，用貝克曼葡萄糖分析儀2用葡萄糖氧化酶方法測定血漿葡萄糖含量，同時(shí)用商售藥盒(Diagnostic ProductsCorporation)用鼠胰島素為標(biāo)準(zhǔn)測定胰島素濃度。
以t時(shí)刻胰島素濃度和注射實(shí)驗(yàn)物質(zhì)之前平均胰島素濃度之間的差異計(jì)算胰島素變化(由基線值開始胰島素的變化)。用不規(guī)則四邊形規(guī)則計(jì)算胰島素變化曲線下的面積。以t時(shí)刻葡萄糖輸入速度值和注入實(shí)驗(yàn)物質(zhì)前平均葡萄糖輸注速度值之間的差異，被注入實(shí)驗(yàn)物質(zhì)前平均葡萄糖輸注速度除，乘100，來計(jì)算葡萄糖輸入速度變化(由基線值開始葡萄糖輸注速度百分比變化)。用不規(guī)則四邊形規(guī)則以絕對(duì)葡萄糖輸注速度變化值為基礎(chǔ)(以t時(shí)刻葡萄糖輸注速度值和注射實(shí)驗(yàn)物質(zhì)前葡萄糖輸入速度間的差異計(jì)算)計(jì)算葡萄糖輸注速度變化值曲線下的面積。用平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)列出所得值。
表4鼠靜脈內(nèi)葡萄糖(1g/kg)耐藥性試驗(yàn)化合物劑量 胰島素變 最大胰 10分鐘時(shí)(mg/kg) n化AUC 島素變 胰島素變(ng/ml·分鐘 化 化0-15分鐘a(ng/ml)b(ng/ml)c賦形劑 0 196 33±1 2.9±0.12.2±0.1GLP-1(7-36)NH20.2534±4 4.0±0.81.8±0.50.3450±13 6.1±0.72.2±1.20.4573±14 7.7±1.03.8±1.00.6667±11 7.7±1.23.4±0.90.8397±25 11.3±2.8 4.1±1.81.0889±16 11.4±2.3 3.9±0.72.05106±1111.7±1.3 4.9±0.7GLP-1(7-37)OH 0.6379±8 7.8±1.15.4±1.20.92 275±12 8.4±0.23.5±1.21.2377±17 8.4±1.64.2±1.3N-咪唑基丙酰- 0.05 349±6 4.9±0.92.5±0.20.15 355±8 5.9±1.42.8±0.1GLP-1(8-36)NH20.3398±29 10.5±2.3 5.5±1.40.63105±4 13.0±0.4 4.8±0.10.92 395±11 12.0±1.2 4.0±0.51.22117±6 13.7±0.5 6.0±0.4N-咪唑基丙酰-Arg26- 1.2285±13 9.8±2.53.6±0.52.43170±1616.5±3.9 9.8±2.5GLP-1(8-37)OHN-咪唑基丙酰- 0.1370±4 7.8±0.33.2±0.50.2992±6 10.2±0.6 5.0±0.6GLP-1(8-37)OH 0.4674±12 7.7±1.64.8±0.70.86121±1613.3±1.8 7.5±1.11.0498±11 12.4±1.6 5.4±0.42.04127±2416.1±3.0 5.9±1.1N-咪唑基丙酰-Arg26- 0.62114±1311.8±2.1 7.7±0.80.92 385±7 9.2±1.85.5±0.9GLP-1(8-37)OH 1.26127±1312.9±1.8 8.2±1.1Lys34-Nε-辛酰基 0.6333±8 5.0±2.31.3±0.2GLP-1(7-37)OH 1.23136±3013.1±2.0 10.0±2.8N-咪唑基丙酰-Arg26- 1.26100±188.5±1.78.3±1.5Lys34-Nε辛?；? 1.6360±11 5.9±1.64.3±0.7GLP-1(8-37)OH 2.43128±2212.9±2.5 10.1±1.6a 胰島素變化AlC胰島素變化曲線下的面積；代表肽總的親胰島素活性。b 最大胰島素變化基線以上胰島素的最大增加(通常是注射后五分鐘)。c 10分鐘時(shí)胰島素變化注射后10分鐘由基線測定胰島素的變化。在活性類似物中，該值越接近最大胰島素變化(百分比)，類似物作用時(shí)間越長。
表5鼠靜脈內(nèi)高血糖(150mg/dl)抑制試驗(yàn)化合物劑量 胰島素效 最大胰 胰島素 GIR(μg/kg) n果持續(xù)時(shí) 島素變 變化AUCc 變化AUC間化 (ng/ml.分鐘； (mg/kg；(分鐘)a (ng/ml)b0-15分)c0-30分鐘)d賦形劑 0 4無活性0.1±0.10.5±1.7 39±10GLP-1(7-37)OH 0.05 4 6 1.6±0.33.0±1.6 48±220.14 6 3.6±1.27.3±2.8 150±250.23 6 2.8±0.15.8±0.9 154±100.64 6 4.9±1.314.9±2.9 151±161.05 6 7.7±0.816.7±4.0 131±192.04 6 3.6±0.911.5±1.0 152±364.04 40 2.0±0.410.4±5.0 139±27N-咪唑基丙酰-Arg26- 1.05 15 0.6±2.226.0±3.6 321±15GLP-1(8-37)OHLys34-Nε-辛?；?1.04 4 2.4±0.813.2±2.5 132±38GLP-1(7-37)OHN-咪唑基丙酰- 1.05 5 1.0±0.22.0±2.5 183±38Lys34-Nε-辛酰GLP-1(8-37)OH-Arg26- 0.05 4 30 0.3±0.26.3±1.4 75±32Lys34-Nε辛酰1.04 20 5.2±1.835.5±10.9 294±252.05 10 3.8±0.932.5±10.4 245±58GLP-1(7-37)OH 4.05 20 4.7±0.835.7±4.8 271±71N-咪唑基丙酰-Arg26- 0.05 4 8 0.5±0.33.3±1.4 121±31Lys34-Nε-辛酰 1.05 30 4.2±1.326.5±7.8 218±412.04 60 5.2±2.145.4±15.5 351±664.04 40 6.0±3.035.5±13.8 380±10GLP-(8-37)OHN-咪唑基丙酰-Arhg26- 1.04 15 0.8±0.11.5±2.0 83±17Lys34-Nε-癸酰GLP-1(8-37)OHa 胰島素效果的持續(xù)時(shí)間胰島素平均變化＞0ng/ml期間內(nèi)的時(shí)間。b 最大胰島素變化90分鐘試驗(yàn)期內(nèi)，基線上胰島素最大增加。c 胰島素變化AUC胰島素變化曲線下的面積；代表肽總的親胰島素效果。d GIR變化AUC葡萄糖輸注速度變化(以mg/kg/分鐘表示)曲線下的面積；代表肽的總的代謝效果。
權(quán)利要求
1.一種式R1-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe-Ile- (式1)所示的化合物或其藥物上可接受的鹽，其中R1選自4-咪唑丙酰基，4-咪唑乙?；?-咪唑-α，α-二甲基-乙酰基；R2選自C6-C10的無支鏈?；虿淮嬖?；R3選自Gly-OH或NH2；和Xaa為Lys或Arg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R1為4-咪唑乙?；騌2為C8無支鏈酰基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的化合物，其中R2不存在。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R1是4-咪唑丙?；琑2是C8無支鏈?；?，R3是Gly-OH，Xaa是Arg。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R2不存在。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R1是4-咪唑-α，α-二甲基-乙酰基，R2是C8無支鏈?；?。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的化合物，其中R2不存在。
8.一種藥物制劑，包括作為活性成分的式1化合物或一種其藥物可接受的鹽，如權(quán)利要求1-7中所要求的任一化合物，與一種或多種藥物上可接受的載體結(jié)合。
9.如權(quán)利要求1-7中所要求的任一式1的化合物，用于治療糖尿病。
10.一種制備如權(quán)利要求1-7中所要求的任一式1的化合物的方法，包括用合成或重組手段制備式1的適合的蛋白質(zhì)骨架；在R1化合物的羧酸衍生物上偶聯(lián)上述蛋白質(zhì)骨架；并且可選擇地，?；疞ys(27)的ε氨基。
全文摘要
本文公開了類胰高血糖素促胰素的多肽(GLP-1(7-37)類似物和衍生物。類似物包括氨基酸替代，氨基和羧基末端的修飾及C
文檔編號(hào)A61K38/26GK1129224SQ9511995
公開日1996年8月21日 申請(qǐng)日期1995年10月17日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月18日
發(fā)明者V·J·陳, R·D·迪馬奇, A·V·克里西尤納斯, D·L·施邁利, R·D·施塔奇 申請(qǐng)人:伊萊利利公司