專利名稱：一種胚胎營養(yǎng)素的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是雞胚營養(yǎng)素(chicken embryonin，CENIN)的技術(shù)領(lǐng)域。
本發(fā)明的目的在于提供一種采用生化提取和中空纖維超濾制備高濃度，高產(chǎn)量，低成本和活性高的雞胚營養(yǎng)素(CENIN)的制備方法，原材料選用健康禽類動物如雞、鴨、鴿、鵝等的孵化蛋胚胎組織，可以制成口服液，也可制備注射藥。
本發(fā)明的目的可通過以下的技術(shù)措施來達(dá)到選用健康禽類動物如雞、鴨、鴿、鵝等的孵化蛋胚胎組織，用任何機(jī)械方法搗碎→-20℃深凍→加熱70-90℃，15-30min→恢復(fù)至室溫，凍存→融化后，離心，取上清液→過正壓截留柱→取濾液→除菌→分裝，包裝→制備注射藥/或加調(diào)味劑制作抗衰老口服液/或膠囊/或加賦型劑制造美容護(hù)膚品。。
本發(fā)明的目的也可通過以下的技術(shù)措施來達(dá)到在上述方案中，健康禽類動物可選自雞、鴨、鴿、鵝等在上述方案中，加熱溫度可從40-95℃優(yōu)選70-90℃和時(shí)間從10-100min，優(yōu)選15-30min。
在上述方案中，截留柱的截止分子量為1000-100,000道爾頓。正壓0.1-1.0×104Pa，其組合方式為單柱或多柱組合使用。
在上述方案中，所制備的雞胚營養(yǎng)素(CENIN)，截止分子量≤1,000,000道爾頓時(shí)，在制備過程到除菌一步時(shí)加入調(diào)味劑分裝成品可制成抗衰老口服液和截止分子量≤20,000道爾頓時(shí)可制成注射液，或與其它藥物配伍靜脈滴入給藥。
本發(fā)明方法進(jìn)一步的優(yōu)選方案如下選用健康禽類動物如雞、鴨、鴿、鵝等的孵化蛋胚胎組織，用任何機(jī)械方法搗碎→-20℃深凍→加熱70-90℃，15-30min→恢復(fù)至室溫，-10℃凍存→融化后，離心，取上清液→過0.1-1.0×104Pa正壓截留柱，截止分子量為1000-100,000道爾頓→取濾液→除菌→分裝，包裝→制備注射藥/或加調(diào)味劑制作抗衰老口服液/或膠囊/或加賦型劑制造美容護(hù)膚品。。
實(shí)施例1雞胚提取物的制造禽類胚胎組織，勻漿，-20℃深凍→融解后加熱→恢復(fù)至室溫，-10℃凍存→融解后，離心→取上清液→過正壓截留柱→取濾液→除菌→分裝→制成注射液/口服液，每毫升含蛋白5.0mg(蛋白含量測定采用改良Lowry′s法)。
本發(fā)明的目的是采用生化提取利用中空纖維超濾技術(shù)制備雞胚營養(yǎng)素(CENIN)；同目前最先進(jìn)的方法相比，具有濃度高，產(chǎn)量高，活性高和成本低的特點(diǎn)。
實(shí)施例2雞胚提取物的生物學(xué)活性鑒定1、雞胚成纖維細(xì)胞的分離取10齡雞胚，去頭及內(nèi)臟，剪碎，加入0.25％的胰酶，室溫下消化30-60min；分離懸浮的單個細(xì)胞，離心，去胰酶，用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為5-10×108/L；用培養(yǎng)瓶培育2小時(shí)，倒去上清，加含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，等細(xì)胞長滿后，用胰酶消化貼壁細(xì)胞做活性測定試驗(yàn)。
2、生物學(xué)活性測定調(diào)細(xì)胞濃度為4.0-8.0×108/L接種于96孔培養(yǎng)板，0.1ml/孔。置37℃5％CO2，24小時(shí)后換液，加入添加0.5、1.25、2.5、5、10、20％的雞胚提取物，以1.0×106μ/L FGF為陽性對照，以生理鹽水為陰性對照孔。72小時(shí)后，棄上清。96孔板加含0.15g/LMTT和2mci/L3H-Tdr F12培養(yǎng)液0.05ml。培養(yǎng)4小時(shí)，分別做MTT比色和3H-Tdr摻入的技術(shù)操作。
3、結(jié)果3.1雞胚提取物對培養(yǎng)72小時(shí)雞成纖維細(xì)胞增殖的影響。
在普通培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加0.5、1.25、2.5、5、10、20％的雞胚提取物，觀察它們對雞成纖維細(xì)胞DNA合成的影響(表1)。表1雞胚提取物對成纖維細(xì)胞3H-TdR摻入的影響(X±SD，n=8) 濃度(％)cpm20 1194±15210 1805±2805 2755±431*2.5 3506±1302**1.25 3019±1381**0.5 2713±834*bFGF 3135±727**對照組1641±334注*，P＜0.05，**，P＜0.01，同對照組比較。
結(jié)果顯示雞胚提取物能明顯促進(jìn)雞成纖維細(xì)胞的DNA合成。3.2雞胚提取物對培養(yǎng)72小時(shí)雞成纖維細(xì)胞活力的影響。在普通培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加0.5、1.25、2.5、5、10、20％的雞胚提取物，觀察它們對雞成纖維細(xì)胞增殖的影響(表2)。表2雞胚提取物對雞成纖維細(xì)胞脫氫酶活力的影響(x±s，n＝5)濃度(％)0D值20 0.180±0.03610 0.199±0.0485 0.219±0.0482.5 0.250±0.0921.250.248±0.0830.5 0.184±0.029bFGF0.248±0.047對照組(0) 0.185±0.046注*，P＜0.05，**，P＜0.01，同對照組比較。
實(shí)施例3雞胚提取物對雞胚胎干細(xì)胞生長的影響1、材料1.1新鮮美國海南白雞種蛋(由廣東力康農(nóng)工商集團(tuán)公司提供)，按Eyal-Giladi和Kochav方法[3]分期為IX～XI期，分離雞胚盤細(xì)胞限產(chǎn)蛋后5hr以內(nèi)。
1.2進(jìn)口特級胎牛血清(FBS，Gibco)、國產(chǎn)FBS和國產(chǎn)新生小牛血清(NCS；由杭州四季青生物工程材料研究所提供)。DMEM(高糖，無丙酮酸鈉，sigma)，非必需氨基酸(×100，Gibco)，鼠白血病抑制因子(mouse leukiemia inhibitory factor，mLIF，106M，Gibco)和人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，10ug，Gibco)，β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol，β-ME；Nacalai Tesoue INC Kyota，Japan)，伴白蛋白(Conalbumin，Sigma)。快藍(lán)BB鹽(Fast blue BB salt，Sigma)和萘酚-AS-MX(Naphthol ASMXphosphate，Sigma)。
1.3 ES細(xì)胞培養(yǎng)基10％國產(chǎn)NCS，40ng.ml-1伴白蛋白，1％非必需氨基酸，1000u.ml-1mLIF，10ng.ml-1的人bFGF，5％FBS(國產(chǎn)或進(jìn)口)和0.14mM的β-ME的高糖DMEM培養(yǎng)基。
2.雞胚成纖維細(xì)胞(chicken embryonic fibroblast，CEF)飼養(yǎng)層的制備取雞胚(8～12日齡)，去除內(nèi)臟及頭，剪碎，胰酶分步消化。按1×105～2×105.ml-1分板或分瓶培養(yǎng)，12hr換液。細(xì)胞長滿后應(yīng)及時(shí)用胰酶傳代。用做ES細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞，大約應(yīng)為80％～90％滿瓶生長。用前用含10ug.ml-1絲裂霉素-C培養(yǎng)基處理2～3hr，PBS洗滌三次后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)直至用于分離或傳代ES細(xì)胞。
3.雞胚盤細(xì)胞分離 分離的胚盤用0.25％的胰酶消化成小細(xì)胞團(tuán)，用含5.6nM的D-葡萄糖(PBS-G)洗滌三次后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，24小時(shí)后換液，3～5d后傳代至絲裂霉素-C處理過的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)。改換完全ES細(xì)胞培養(yǎng)基。
4.雞胚胎干細(xì)胞培養(yǎng) 雞胚盤細(xì)胞于37℃、5％CO2、濕度99％中常規(guī)培養(yǎng)，每24hr換液一半。3～5d傳代一次，傳代時(shí)先用PBS-G洗滌三次，0.25％胰酶37℃消化5～10min。分離的ES細(xì)胞團(tuán)重新接種于絲裂霉素-C處理過的飼養(yǎng)層細(xì)胞，用完全ES細(xì)胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。于細(xì)胞傳代時(shí)用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)ES細(xì)胞集落數(shù)。
5.堿性磷酸酶反應(yīng)取傳代胚盤細(xì)胞分別于第一代，第三代，第九代終止培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞用PBS洗滌三次，用冷的4％多聚甲醛于4℃固定15min。PBS洗滌，于AKP液(配方①5mg快藍(lán)BB鹽+50μlHCl+200μl雙蒸水。②2.5mg萘酚-AS-MX+100μl DMSO+5ml 0.1MTrisHCl(pH8.2-9.2)+100μl 10％MgCl2。將①+②混合，調(diào)pH至8.4)中37℃孵化5～30min，用10nM EDTA終止反應(yīng)，PBS沖洗，用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)ES細(xì)胞陽性集落。
6、結(jié)果6.1雞胚盤細(xì)胞初次傳代時(shí)的表現(xiàn)從新鮮海南白雞種蛋的胚盤細(xì)胞中分離培養(yǎng)雞ES細(xì)胞，從細(xì)胞的生長方式、形態(tài)學(xué)特征和AKP染色觀察識別，可見以下4種集落ES細(xì)胞集落，細(xì)胞小，排列緊密，界限不清，集落呈團(tuán)狀、山丘狀或鳥巢狀生長。此外還可見滋養(yǎng)層細(xì)胞集落，上皮樣細(xì)胞集落，內(nèi)皮樣細(xì)胞集落。ES細(xì)胞集落在最初幾代的傳代過程中很容易分化，需多次傳代才能得到穩(wěn)定的ES細(xì)胞系。
6.2條件培養(yǎng)基對ES細(xì)胞建系的影響(表3)6.2.1.血清對ES細(xì)胞增殖的影響 實(shí)驗(yàn)時(shí)選用進(jìn)口FBS，國產(chǎn)FBS和國產(chǎn)NCS。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用10％國產(chǎn)NBS+5％進(jìn)口FBS時(shí)，ES細(xì)胞傳至第3代即消失，而10％國產(chǎn)NBS+5％國產(chǎn)FBS時(shí)，ES細(xì)胞可傳至第9代并呈增多趨勢，單純10％國產(chǎn)NBS也可見細(xì)胞傳至4代。因此，分離ES細(xì)胞時(shí)，篩選血清對成功克隆ES細(xì)胞是非常重要的。
表3各種血清條件培養(yǎng)基對ES細(xì)胞集落數(shù)的影響傳代數(shù) 0123456ES細(xì)胞培養(yǎng)基-24 158300ES細(xì)胞培養(yǎng)基-19 30000+5％進(jìn)口FBSES細(xì)胞培養(yǎng)基-28 19 14 12 1621+5％國產(chǎn)FBS
6.2.2. 雞胚提取物對ES細(xì)胞集落數(shù)的影響在飼養(yǎng)層細(xì)胞存在的條件下，雞胚提取物對ES細(xì)胞集落數(shù)的影響見表4。
表4雞胚提取物對雞ES細(xì)胞集落數(shù)的影響傳代數(shù)0 12 3 4 5 6ES細(xì)胞培養(yǎng)基 - 36 28 15 8 1 0ES細(xì)胞培養(yǎng)基 - 31 19 14 18 21 41+雞胚提取物結(jié)果顯示在其它條件一致的情況下，加用雞胚提取物的培養(yǎng)液中，雞ES細(xì)胞集落數(shù)于5代后呈上升趨勢。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的促進(jìn)生長發(fā)育和延緩衰老的雞胚營養(yǎng)素(chickenembryonin，CENIN)的制備方法，其特征是所述的制備方法，是選用健康禽類動物的孵化蛋胚胎組織，用任何機(jī)械方式搗碎→-20℃深凍→融解后攪拌均勻→加熱→恢復(fù)至室溫，-10℃凍存→融解后，離心→取上清液→過正壓截留柱→取濾液→除菌→分裝，包裝，制備注射藥/或加調(diào)味劑制作抗衰老口服液/或膠囊/或加賦型劑制造護(hù)膚品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)生長發(fā)育和延緩衰老的雞胚營養(yǎng)素的制備方法，其特征是加熱溫度可從40-95℃和時(shí)間從10-200min不等。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)生長發(fā)育和延緩衰老的雞胚營養(yǎng)素的制備方法，其特征是截留柱的截止分子量為1000-1,000，000道爾頓。正壓0.1-1.0×104Pa，其組合方式為單柱或多柱組合使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)生長發(fā)育和延緩衰老的雞胚營養(yǎng)素的制備方法，其特征是制備的雞胚營養(yǎng)素，截止分子量≤1,000,000道爾頓時(shí)，在制備過程到除菌一步時(shí)加入調(diào)味劑分裝成品可制成口服液/或膠囊和加入賦型劑可制作美容護(hù)膚品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)生長發(fā)育和延緩衰老的雞胚營養(yǎng)素的制備方法，其特征在于，將所制備的截止分子量≤20,000道爾頓時(shí)可制成注射液，或與其它藥物配伍靜脈滴入給藥。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞胚營養(yǎng)素(CENIN)的制備方法，其特征是制備的雞胚營養(yǎng)素(CENIN)是一類具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、增強(qiáng)端粒酶活性和延緩衰老的分子量為1000-100,000的多肽或蛋白混合物。臨床上可用于治療老年性癡呆、少兒智力障礙和發(fā)育不良等疾病。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞胚營養(yǎng)素(CENIN)的制備方法，其特征是制備的雞胚營養(yǎng)素(CENIN)，在體外能促進(jìn)雞和小鼠的成纖維細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的生長，以及雞胚胎干細(xì)胞的生長。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)生長發(fā)育和延緩衰老的雞胚營養(yǎng)素(CENIN)的制備方法，其特征在于，選用健康禽類動物如雞、鴨、鴿、鵝等的孵化蛋胚胎組織，用任何機(jī)械方式搗碎→-20℃深凍→融解后攪拌均勻→70-90℃加熱15-30min→恢復(fù)至室溫，-10℃凍存→融解后，離心→取上清液→過0.1-1.0×104Pa正壓截留柱，截留柱的截止分子量為1000-1,000，000道爾頓→取濾液→除菌→分裝，包裝，制備注射藥/或加調(diào)味劑制作抗衰老口服液/或膠囊/或加賦型劑制造美容護(hù)膚品。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種促進(jìn)生長發(fā)育、煥發(fā)青春活力和延緩衰老的口服液、膠囊及護(hù)膚品的生產(chǎn)工藝和制備方法,它是一種從健康禽類動物孵化蛋胚胎組織中,在低溫條件下用生物化學(xué)技術(shù)提取,中空纖維超濾制備的具有促進(jìn)正常細(xì)胞和干細(xì)胞生長,延緩細(xì)胞衰老的生物活性物質(zhì)的方法。該方法提取的分子量為1萬和/1～20萬道爾頓的產(chǎn)物,和現(xiàn)有方法生產(chǎn)的產(chǎn)品相比,具有產(chǎn)量高、濃度高、活性高、成本低可滿足大規(guī)模生產(chǎn)和廣大人民群眾的健康保護(hù)需要,可用于改善少兒生長發(fā)育不良、煥發(fā)青年人的生命活力、治療老年性體弱癡呆和延緩衰老等作用。
文檔編號A61P3/02GK1342461SQ0011740
公開日2002年4月3日 申請日期2000年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月8日
發(fā)明者鄒清雁 申請人:鄒清雁