專利名稱：用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及再生醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿 生基質(zhì)材料及使用方法。
背景技術(shù)：
由創(chuàng)傷或骨病所致關(guān)節(jié)部位軟骨缺損臨床常見，現(xiàn)有治療措施均存在明顯缺陷， 快速發(fā)展的組織工程學技術(shù)為其再生修復提供了新技術(shù)。1984年瑞典醫(yī)學家Peterson等 首次報道在兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中，用可吸收縫合線將自體骨膜縫合于軟骨缺損周緣，然 后將自體軟骨細胞懸液注入缺損中，術(shù)后16周檢測證實關(guān)節(jié)軟骨缺損被透明軟骨修復。 1987年瑞典歌德堡醫(yī)療中心Brittberg等報道采用該技術(shù)成功治療人關(guān)節(jié)軟骨缺損，這為 隨后深入開展的軟骨組織工程推廣應(yīng)用創(chuàng)造了有利條件。1995年美國Genzyme公司改良該 技術(shù)用于制備較原始的軟骨組織工程產(chǎn)品，并注冊為Carticel 產(chǎn)品，1997年通過美國 FDA批準后逐漸在臨床推廣應(yīng)用，2000年瑞典Sahlgrenska醫(yī)院Peterson等報告了 101例 膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的患者接受ACT技術(shù)的治療情況，其中94例經(jīng)過2 9年隨訪，臨床有效 率達87.5%。至今已有上萬名患者受益于該技術(shù)。該技術(shù)的基本過程為，在關(guān)節(jié)鏡下采集 患者關(guān)節(jié)非負重區(qū)少量軟骨(約黃豆大小)，進行軟骨細胞分離、培養(yǎng)及增殖，然后將軟骨 細胞種植在生物膜(I/III膠原膜)上構(gòu)建組織工程軟骨，這個過程約一月。在組織工程中，支架材料起到細胞外基質(zhì)的作用，有利于細胞的黏附、增殖乃至分 化，為植入細胞新陳代謝提供適宜的生產(chǎn)微環(huán)境，因此支架材料一直是組織工程組織研究 的重點內(nèi)容。針對組織工程軟骨的支架材料，目前主要有兩種策略，即可注射型支架和三維 多孔支架?？勺⑸湫椭Ъ芤话闶菍⒓毎c流動性和生物相容性好的材料復合，然后直接注 射到軟骨缺損部位，注入的材料原位形成一種具有一定形狀、機械強度的支架，體液可在支 架內(nèi)交換并為支架內(nèi)的細胞提供生長所需要的營養(yǎng)，進而細胞進行生長、分化和增殖并形 成組織。相對于三維多孔支架而言，可注射型支架因注射植入，手術(shù)難度低，創(chuàng)面小，是目前 組織工程支架研究的重要方向之一。近年來，水凝膠作為可注射支架材料廣泛用于軟骨組織工程，它即可以直接植入 體內(nèi)作為軟骨組織的替代材料，也可以在水凝膠凝膠化之前與細胞懸液混合以形成水凝膠 與細胞的復合體，此類復合體或者在體外進行軟骨細胞的三維立體培養(yǎng)，或者注入體內(nèi)軟 骨缺損處，并通過條件改變在體內(nèi)原位交聯(lián)，進而修復受損的軟骨組織。水凝膠類可注射支 架主要包括溫敏型和交聯(lián)型。交聯(lián)型水凝膠需要添加交聯(lián)劑或者引發(fā)劑，然后通過適當條 件使分子鏈之間交聯(lián)，形成水凝膠。交聯(lián)型水凝膠的凝膠化時間可通過加入物質(zhì)的量來調(diào) 節(jié)，其強度相對較高，但引發(fā)劑及交聯(lián)劑具有的生物毒性會對細胞成活及生長造成不利影 響。溫敏型水凝膠無需添加任何助劑，植入后生物相容性及安全性更高。溫敏型水凝膠具體又分為升溫型水凝膠(如聚氧化乙烯水凝膠)和降溫型水凝膠 (如瓊脂凝膠)，而升溫型水凝膠因凝膠過程為從低溫到高溫，操作易控，更適宜用于可注 射軟骨支架的制備。升溫型水凝膠中，合成水凝膠相對于天然水凝膠具備性能穩(wěn)定、強度高和易操作的優(yōu)點，但生物相容性較低，細胞粘附效果差。合成溫敏型水凝膠及天然水凝膠改 性獲得溫敏型水凝膠均為現(xiàn)今研究的熱點。例如王東武、楊柳等向殼聚糖酸性溶液中加入 甘油磷酸鈉得到軟骨組織工程用可注射溫固化支架，用于修復兔膝關(guān)節(jié)面缺損，12周后可 見較好的修復效果。李石保、楊維東等采用丙二醇及聚氧化乙烯_聚氧化丙烯_聚氧化乙 烯三嵌段共聚物制得合成溫固化水凝膠，注射入裸鼠背部皮下組織后12周可見有大量成 熟的軟骨組織。研究表明，正常關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細胞和細胞外基質(zhì)組成，兩者協(xié)調(diào)配合，保證了關(guān) 節(jié)軟骨的正常生理功能。軟骨細胞占整個組織體積的5%，主要功能為分泌胞外基質(zhì)，保持 基質(zhì)的更新。細胞外基質(zhì)70%由水構(gòu)成，其余由膠原和蛋白多糖組成，主要負責承載軟骨 細胞，調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化，緩沖關(guān)節(jié)應(yīng)力。膠原占軟骨干重的60% -80%，其中95%為 II型膠原。蛋白多糖聚合物占透明軟骨干重的20% -40%，主要包括硫酸軟骨素和透明質(zhì) 酸，兩者結(jié)合形成蛋白多糖聚合物。聚合物中的氨基葡聚糖殘基帶有負電荷，分子間相互排 斥，具有強烈的親水性，這是軟骨基質(zhì)保持大量水分的重要原因。硫酸軟骨素和膠原纖維之 間的鍵連接，避免了基質(zhì)過度水化，進而防止軟骨軟化。綜上所述，用三維多孔支架方式構(gòu)建軟骨，接種細胞后需要進行體外培養(yǎng)，且使用 不方便，必須事先塑形使之與軟骨缺損相匹配且以往研究所用生物材料多為人工合成的高 分子材料，與正常的軟骨基質(zhì)成分存在顯著的差異，生物相容性和安全性較差。有必要克服所述缺陷，提供一種用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料， 該材料在低溫條件下呈溶膠態(tài)、具有流動性，近似體溫條件下(36-38°C )發(fā)生相變呈凝膠 狀；可作為種子細胞載體，于低溫條件下與一定比例的自體骨髓間充質(zhì)干細胞或軟骨細胞 混合并注入軟骨缺損部位，通過升高缺損區(qū)域溫度使溶膠發(fā)生相變，從而將種子細胞固定 于缺損處發(fā)揮再生修復作用。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材 料及其使用方法，該材料在低溫條件下(0_4°C)呈溶膠態(tài)、具有流動性，近似體溫條件下 (36-380C )發(fā)生相變呈凝膠狀、不具流動性，可作為種子細胞載體，于低溫條件下與一定比 例的自體骨髓間充質(zhì)干細胞或軟骨細胞混合并注入軟骨缺損部位，通過升高缺損區(qū)域溫度 使溶膠發(fā)生相變，從而將種子細胞固定于缺損處發(fā)揮再生修復作用，具有使用方便、操作簡 單、手術(shù)損傷小、修復作用好等優(yōu)點。本發(fā)明所述用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料，是通過如下步驟制 得a.按質(zhì)量百分比取65 75%的II型膠原蛋白、20 30%的硫酸軟骨素和1 5%的透明質(zhì)酸作為原料；b.于0 4°C無菌條件下，將步驟a所取原料用濃度為O.Olmol/L 0. Imo 1/L 的冰醋酸或鹽酸溶解，得原料質(zhì)量分數(shù)為10% 30%酸性溶液；c.于0 4°C無菌條件下，將所述酸性溶液用濃度為lmol/L 2mol/L的氫氧化 鈉或氫氧化鉀水溶液中和至pH為7. 0 7. 5，得所需用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生 基質(zhì)材料，于0 4°C溫度下保存。
進一步，所述原料中各成分的質(zhì)量百分比為68 73%的II型膠原蛋白、24 29%的硫酸軟骨素和1 3%的透明質(zhì)酸；進一步，步驟b中所用冰醋酸或鹽酸的濃度為0. 03-0. 08mol/L，所述酸性溶液中 原料的質(zhì)量分數(shù)為12-18%。使用所述用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料的方法，包括如下步驟1)將分離所得自體或異體的骨髓間充質(zhì)干細胞或軟骨細胞于0_4°C無菌條件下 與所述注射型軟骨仿生基質(zhì)材料混合，制得細胞濃度為5 X 106-5 X IO7個/ml的細胞材料復 合物；2)將所述復合物于0_4°C無菌條件下注入軟骨缺損部位，并保持所述部位的溫度 在36-38°C直至注射入所述部位的復合物相變?yōu)槟z。本發(fā)明的有益效果在于所述用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料可 作為種子細胞載體，于低溫條件下與一定比例的干細胞或軟骨細胞混合并注入軟骨缺損部 位，通過升高缺損區(qū)域溫度使溶膠_細胞復合物發(fā)生相變，從而將種子細胞固定于缺損處 發(fā)揮再生修復作用，與固態(tài)三維支架相比，具有使用方便、操作簡單、手術(shù)損傷小、修復作用 好的優(yōu)點；原料所用成分均為動物源性仿生生物材料，具有良好的生物相容性和安全性； 各種仿生材料以不同比例進行混合，并在本發(fā)明提供的制備條件下發(fā)生分子之間的鍵合， 解決單一仿生材料降解過快問題；將種子細胞可以直接與材料混合后，無需體外培養(yǎng)，即可 注入軟骨缺損，縮短了種子細胞在體外滯留時間，提高了臨床應(yīng)用的安全性。本發(fā)明的其他優(yōu)點、目標和特征在某種程度上將在隨后的說明書中進行闡述，并 且在某種程度上，基于對下文的考察研究對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的，或者可 以從本發(fā)明的實踐中得到教導。


圖1為實施例5所得產(chǎn)品用于修復豬膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)髁軟骨缺損16周后標本；圖2為對照組標本；圖3為圖1標本石蠟包埋切片的組織顯微觀察照片；圖4為圖2標本石蠟包埋切片的組織顯微觀察照片。
具體實施例方式以下將對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。應(yīng)當理解，優(yōu)選實施例僅為了說 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。實驗材料II型膠原蛋白、硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸均購自美國sigma公司。實施例1本實施例的用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料通過如下步驟制得a.按質(zhì)量百分比取70%的II型膠原蛋白、28%的硫酸軟骨素和2%的透明質(zhì)酸作 為原料；b.于0°C條件下在超凈臺上將步驟a所取原料用濃度為0.05mol/L的冰醋酸 溶解，得到原料質(zhì)量分數(shù)為10%酸性溶液；當然，本步驟中酸性溶液的原料質(zhì)量分數(shù)可在10% 30%范圍之內(nèi)；c.于0°C條件下在超凈臺上將步驟b所得酸性溶液用濃度為lmol/L的氫氧化鈉 水溶液滴定中和至PH為7.0后，得所需用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料；此 處所用氫氧化鈉也可采用氫氧化鉀替代，氫氧化鈉或氫氧化鉀的濃度在lmol/L 2mol/L 均可；步驟b和步驟c均于0-4°C條件下操作，利于溶液保持溶膠狀態(tài)。所得用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料于0-4°C條件下密封保存?zhèn)溆谩嵤├?本實施例的用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料通過如下步驟制得a.按質(zhì)量百分比取75%的II型膠原蛋白、24%的硫酸軟骨素和的透明質(zhì)酸作 為原料；b.于4°C條件下在超凈臺上將步驟a所取原料用濃度為0. lmol/L的鹽酸溶解，得 到原料質(zhì)量分數(shù)為15%酸性溶液；c.于4°C條件下在超凈臺上將步驟b所得酸性溶液用濃度為lmol/L的氫氧化鉀 水溶液滴定中和至PH為7. 5后，得所需用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料。所得用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料于低溫(0_4°C )條件下密封 保存?zhèn)溆?。實施?本實施例的的用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料通過如下步驟制 得a.按質(zhì)量百分比取65%的II型膠原蛋白、30%的硫酸軟骨素和5%的透明質(zhì)酸作 為原料；b.于0°C條件下在超凈臺上將步驟a所取原料用濃度為0. 01mol/L的鹽酸溶解， 得到原料質(zhì)量分數(shù)為20%酸性溶液；c.于4°C條件下在超凈臺上將步驟b所得酸性溶液用濃度為2mol/L的氫氧化鉀 水溶液滴定中和至PH為7. 3后，得所需用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料。所得用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料于0-4°C條件下密封保存?zhèn)溆?。實施?本實施例的的用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料通過如下步驟制 得a.按質(zhì)量百分比取75%的II型膠原蛋白、20%的硫酸軟骨素和5%的透明質(zhì)酸作 為原料；b.于0°C條件下在超凈臺上將步驟a所取原料用濃度為0. 01mol/L的鹽酸溶解， 得到原料質(zhì)量分數(shù)為20%酸性溶液；c.于4°C條件下在超凈臺上將步驟b所得酸性溶液用濃度為2mol/L的氫氧化鉀 水溶液滴定中和至PH為7. 3后，得所需用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料。所得用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料于0-4°C條件下密封保存?zhèn)溆?。實施?本實施例的的用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料通過如下步驟制 得a.按質(zhì)量百分比取68%的II型膠原蛋白、29%的硫酸軟骨素和3%的透明質(zhì)酸作 為原料；b.于4°C條件下在超凈臺上將步驟a所取原料用濃度為0. 03mol/L的鹽酸溶解， 得到原料質(zhì)量分數(shù)為12%酸性溶液；c.于0°C條件下在超凈臺上將步驟b所得酸性溶液用濃度為1. 5mol/L的氫氧化 鉀水溶液滴定中和至PH為7. 5后，得所需用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料。所得用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料于低溫(0_4°C )條件下密封 保存?zhèn)溆?。實施?本實施例的的用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料通過如下步驟制 得a.按質(zhì)量百分比取73%的II型膠原蛋白、26%的硫酸軟骨素和的透明質(zhì)酸作 為原料；b.于0°C條件下在超凈臺上將步驟a所取原料用濃度為0. 08mol/L的鹽酸溶解， 得到原料質(zhì)量分數(shù)為18%酸性溶液；c.于0°C條件下在超凈臺上將步驟b所得酸性溶液用濃度為Imo 1/L的氫氧化鉀 水溶液滴定中和至PH為7. 5后，得所需用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料。所得用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料于低溫(0_4°C )條件下密封 保存?zhèn)溆谩嵤├?本實施例的的用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料通過如下步驟制 得d.按質(zhì)量百分比取73%的II型膠原蛋白、24%的硫酸軟骨素和3%的透明質(zhì)酸作 為原料；e.于0°C條件下在超凈臺上將步驟a所取原料用濃度為0. 05mol/L的鹽酸溶解， 得到原料質(zhì)量分數(shù)為15%酸性溶液；f.于0°C條件下在超凈臺上將步驟b所得酸性溶液用濃度為2mol/L的氫氧化鉀 水溶液滴定中和至PH為7. 5后，得所需用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料。所得用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料于低溫(0_4°C )條件下密封 保存?zhèn)溆谩？疾焐鲜龈鲗嵤├卯a(chǎn)品用于修復軟骨組織缺損的效果，操作如下1、按常規(guī)操作方法分離、獲取豬骨髓間充質(zhì)干細胞，分別與上述各實施例所得注 射型軟骨仿生基質(zhì)材料于低溫條件下(0 4°C)混合，制備得到細胞材料復合物，與各實施 例所得基質(zhì)材料對應(yīng)的細胞復合物濃度見表1。表 權(quán)利要求
一種用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料，其特征在于通過如下步驟制得a.按質(zhì)量百分比取65～75％的II型膠原蛋白、20～30％的硫酸軟骨素和1～5％的透明質(zhì)酸作為原料；b.于0～4℃無菌條件下，將步驟a所取原料用濃度為0.01mol/L～0.1mol/L的冰醋酸或鹽酸溶解，制得原料質(zhì)量分數(shù)為10％～30％酸性溶液；c.于0～4℃無菌條件下，將所述酸性溶液用濃度為1mol/L～2mol/L的氫氧化鈉或氫氧化鉀水溶液中和至pH為7.0～7.5，得所需用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料，于0～4℃溫度下密封保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料，其特征在 于所述原料中各成分的質(zhì)量百分比為68 73%的II型膠原蛋白、24 29%的硫酸軟骨 素和1 3%的透明質(zhì)酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料，其特征在 于步驟b中所用冰醋酸或鹽酸的濃度為0. 03-0. 08mol/L,所述酸性溶液中原料的質(zhì)量分 數(shù)為 12-18%。
4.使用權(quán)利要求1所述的用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料的方法，其特 征在于包括如下步驟1)將分離所得自體或異體的骨髓間充質(zhì)干細胞或軟骨細胞于0-4°C無菌條件下與所 述注射型軟骨仿生基質(zhì)材料混合，制得細胞濃度為5X 106-5X 107個/ml的細胞材料復合 物；2)將所述復合物于0-4°C無菌條件下注入軟骨缺損部位，并保持所述部位的溫度在 36-38°C直至注射入所述部位的復合物相變?yōu)槟z。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于軟骨再生修復的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料及其使用方法，選取與正常關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)主要成分相同的材料作為原料，通過溶解及pH調(diào)節(jié)，制得低溫條件下為溶膠態(tài)、體溫為凝膠態(tài)的注射型軟骨仿生基質(zhì)材料；以其為載體于低溫條件下與種子細胞混合并注入軟骨缺損部位，通過升高缺損區(qū)域溫度使注入材料相變?yōu)槟z，從而將種子細胞固定于缺損發(fā)揮再生修復作用，該方法簡單易行，產(chǎn)品使用方便、手術(shù)損傷小、缺損部位修復效果好；原料具有良好的生物相容性和安全性，各組份可在本發(fā)明制備條件下發(fā)生分子間鍵合，解決單一仿生材料降解過快問題；種子細胞直接與材料混合，無需體外培養(yǎng)，縮短了種子細胞在體外滯留時間，臨床應(yīng)用更安全。
文檔編號A61L27/52GK101934092SQ20101026429
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者寧志剛, 崔運利, 張穎, 戴剛, 楊柳, 段小軍, 王富友 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院