專(zhuān)利名稱(chēng)：一種西藏琵蝎抗單純皰疹病毒活性多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及西藏琵蝎抗單純皰疹病毒活性多肽。本發(fā)明還涉及了一種治療治療單純皰疹、口唇皰疹、生殖器皰疹、帶狀皰疹外用凝膠。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒(HSV)是一種常見(jiàn)的人類(lèi)傳染病病毒，主要感染口、眼、唇的皮膚和粘膜、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、生殖器、內(nèi)臟器官等，引起口唇皰疹、腦炎、角膜結(jié)膜炎、生殖器皰疹等疾病。皰疹的治療手段多為外用藥，內(nèi)服藥，或內(nèi)服藥與外用藥結(jié)合，亦采用物理方法治療，但總體上治療效果不理想，用后不良反應(yīng)較多。目前皰疹主要采用抗病毒藥物治療。如阿昔洛韋(ACV)是一種開(kāi)鏈嘌呤核苷，能抑制病毒脫氧核糖核酸合成，而對(duì)宿主細(xì)胞DNA的合成作用較少。被認(rèn)為是目前最有效的抗HSV藥物。病情嚴(yán)重者可靜脈給藥。能使病毒迅速減少，癥狀減輕，愈合時(shí)間縮短。外用3%-5% ACV軟膏也能減輕癥狀和縮短病程。對(duì)復(fù)發(fā)次數(shù)較為頻繁的患者，可預(yù)防性的服藥。近年來(lái)新開(kāi)發(fā)出無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷的類(lèi)似物，如萬(wàn)乃洛韋(valaciclovir)、法昔洛韋(famicidovir)、潘昔洛韋(pencidovir)等，具有療效確切、生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)。另外，三氮唑核苷是一種鳥(niǎo)嘌呤核苷的類(lèi)似物，有抗DNA和RNA病毒的作用，口服能減輕疼痛和縮短病程。但這些抗病毒藥物的使用產(chǎn)生病毒的耐藥性，當(dāng)前許多治療皰疹藥物大部分療效不佳是由于耐藥病毒株感染所導(dǎo)致。陽(yáng)離子防御肽是一類(lèi)由宿主生成，并且在天然免疫中特異性發(fā)揮防御性作用的一類(lèi)小肽。這一類(lèi)小分子多肽通常由10-50個(gè)氨基酸構(gòu)成，靜電荷從+2到+9不等，在生物體抵御微生物的入侵中發(fā)揮重要的作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)的差別，陽(yáng)離子防御肽可以分為如下幾類(lèi)含有2-4個(gè)β片層的兩親性分子、兩親性α螺旋、卷曲結(jié)構(gòu)、以及含有高級(jí)結(jié)構(gòu)的分子。陽(yáng)離子防御肽在體內(nèi)對(duì)細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)、以及病毒的侵染均有有效的抵御作用。研究表明，蜂毒溶血肽Melitiin和天蠶素Cecropins在亞毒性濃度下通過(guò)阻遏基因表達(dá)來(lái)抑制HIV-I病毒的增殖，爪蟾抗病毒多肽Magainin-2對(duì)皰疹病毒HSV和HSV-2有一定的抑制效果，這些多肽都是α螺旋類(lèi)陽(yáng)離子防御肽。目前的研究表明，α螺旋類(lèi)陽(yáng)離子防御肽特異性作用于有包膜的RNA病毒及DNA病毒，其作用方式通常是作用于病毒進(jìn)入的過(guò)程，或者是直接作用于病毒的包膜。例如，Dermas印tin就是通過(guò)作用于HIV的包膜而引起HIV的失活，從而達(dá)到抗病毒的作用。所以，陽(yáng)離子防御肽不再是傳統(tǒng)的疫苗防治，而是通過(guò)直接抑制病毒達(dá)到抗病毒的目的。蝎子中陽(yáng)離子防御肽的研究也已經(jīng)有多年的歷史。其中除了從淋巴系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的防御肽外，更多的是從蝎毒腺中分離到的防御月太，例如 Hadrurin, Scorpine, Opistoporin, Parabutoporin, ISCT, Pandinin0這些被稱(chēng)為多肽的生物活性物質(zhì)，因?yàn)榫哂屑兩镂镔|(zhì)、穩(wěn)定性強(qiáng)、殺病毒強(qiáng)、廣譜、無(wú)抗藥耐藥性、無(wú)毒副作用和“三致”作用特點(diǎn)。AHSVPl是從西藏琵蝎獲得的一個(gè)天然抗病毒分子，由于產(chǎn)生機(jī)制、抗病毒機(jī)制和作用方式與傳統(tǒng)抗病毒藥物不同，可很快殺滅病毒而自身不產(chǎn)生耐藥性，且肽水解后的氨基酸有利于皮膚組織的生成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供蝎源抗單純皰疹病毒活性高的陽(yáng)離子多肽及其治療單純皰疹、口唇皰疹、生殖器皰疹、帶狀皰疹的外用凝膠制劑。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，首先構(gòu)建高質(zhì)量西藏琵蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)，具體包括蝎毒腺總RNA的分離和mRNA純化，cDNA的第一鏈和第二鏈合成，雙鏈cDNA與pSPORTl載體的連接和轉(zhuǎn)化，獲得蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)。在構(gòu)建文庫(kù)的基礎(chǔ)上，隨機(jī)挑選2000克隆子進(jìn)行測(cè)序，序列分析發(fā)現(xiàn)第1283克隆子為一個(gè)新的西藏琵蝎抗病毒多肽基因，命名為AHSVP1。本發(fā)明公開(kāi)了一種分離的西藏琵蝎多肽基因AHSVP1，其序列為SEQ IDNO :1所示的核苷酸序列ttcctctgtgaaagtaagttctgtgaaactcactcttcgataaaatgaaatctcagacctttttccttctttttctagttgttttattattagcaatttcacaatcagaagctttcattagtaaagttgctagtcttctcaaaagtatttttggaaaaagaagtatgagagatatggatactatgaaatacttatatgaaccaagtttgagtgcagctgacttgaaaaccttacaaaaactaatggaaaattactgattatttgaatataataatgttatctctattttagattataaatatttcttttgaaaaaaaaaaaaaaaa( 0 1) 0本發(fā)明公開(kāi)了一種西藏琵蝎AHSVPl多肽，其序列為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。AHSVPl的前體組織形式編碼70個(gè)氨基酸殘基，由三個(gè)部分組成，即信號(hào)肽(23個(gè)殘基)、成熟肽(13個(gè)殘基)和前體肽(34個(gè)殘基)。如

圖1所示，cDNA序列下方為推斷的對(duì)應(yīng)氨基酸序列；信號(hào)肽氨基酸以斜體標(biāo)記；成熟肽氨基酸為陰影部分氨基酸；下劃線部分氨基酸為C端前體肽。因此，本發(fā)明提供一個(gè)西藏琵蝎抗病毒多肽FIRKIARLLKRIF(SEQ IDNO 2)。本發(fā)明另一目的是公開(kāi)了一組蝎源AHSVPl多肽的同源結(jié)構(gòu)多肽，其序列為SEQID NO :3所示的氨基酸序列。根據(jù)AHSVPl的成熟肽序列(FIRKIARLLKRIF)，使用在線NPSOserver [DSC 法(Discrimination of protein Secondary structure Class)]對(duì)其進(jìn) 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并利用軟件AHTHEPR0T2000顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)圖像。結(jié)果表明，AHSVPl含有100%的α-Helix結(jié)構(gòu)，具有典型的兩親性(amphiphilic) α-Helix結(jié)構(gòu)，含有大量帶凈正電荷的堿性殘基(Arg和Lys)。根據(jù)螺旋圖像圖2，然后對(duì)AHSVPl多肽序列FIRKIARLLKRIF進(jìn)行大量點(diǎn)突變(表1)，發(fā)現(xiàn)FIX1X2IAX3LLX4X5IF(X1，X3和)(5為任意堿性氨基酸；X2和X4為任意氨基酸)(SEQ ID NO 3)序列并不影響其雙親性的特征(圖3)。因此，本發(fā)明提供了一組蝎源AHSVPl多肽的同源結(jié)構(gòu)多肽(SEQ IDNO :3)。本發(fā)明公開(kāi)了高效抗單純皰疹病毒的AHSVPl多肽及其結(jié)構(gòu)同源多肽。通過(guò)固相化學(xué)合成的辦法，得到了純度達(dá)95%以上的合成多肽AHSVPl及其結(jié)構(gòu)同源多肽(圖3、圖4和表1)?？共《窘Y(jié)果表明合成多肽AHSVPl及其結(jié)構(gòu)同源多肽對(duì)單純皰疹病毒增殖具有高效抑制作用，AHSVPl及其大部分結(jié)構(gòu)同源多肽對(duì)單純皰疹病毒的IC50小于2 μ g/ml (圖5和表2)。本發(fā)明也提供一種外用抗病毒凝膠制劑。按照AHSVPl多肽或其結(jié)構(gòu)同源多肽有效成分重量百分比為0. 5%與羥甲基纖維素基質(zhì)配制。具體處方配制如下=AHSVPl多肽或其結(jié)構(gòu)同源多肽0. 5克、丙二醇10克、乙醇20克、羥甲基纖維素1. 5克、三乙醇胺1克、羥苯乙酯0. 1克，無(wú)菌水加至100克。本發(fā)明提供的一種高效抗單純皰疹病毒的外用凝膠制劑。抗病毒結(jié)果表明其外用
4凝膠制劑對(duì)單純皰疹病毒具有高效抑制作用，其半數(shù)抑制濃度IC50均小于2 μ g/ml (按照制劑中有效成分抗病毒多肽AHSVPl或其結(jié)構(gòu)同源多肽計(jì)算)(表3)。本發(fā)明提供的一種高效治療皰疹的外用凝膠制劑。選用來(lái)武漢大學(xué)人民醫(yī)院治療的單純皰疹患者為對(duì)象，所有病人隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組用西藏琵蝎多肽凝膠劑，對(duì)照組常規(guī)用藥(給予3%阿昔洛韋ACV軟膏)。采用隨機(jī)雙盲對(duì)照試驗(yàn)對(duì)200例顏面部復(fù)發(fā)性單純皰疹患者進(jìn)行臨床療效觀察。其中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照各100例。結(jié)果顯示，用藥2天時(shí)，西藏琵蝎多肽凝膠劑實(shí)驗(yàn)組有效率(42%)高于阿昔洛韋軟膏對(duì)照組(7%)。在用藥的第4、6和10天時(shí)，西藏琵蝎多肽凝膠劑實(shí)驗(yàn)組有效率分別為86%，98%和100%，而阿昔洛韋軟膏對(duì)照組的有效率僅為32%、43%和53%。兩組間有效率差異明顯。而且西藏琵蝎多肽凝膠比阿昔洛韋軟膏起效快。西藏琵蝎多肽凝膠實(shí)驗(yàn)組丘疹停止出現(xiàn)時(shí)間和疼痛緩解時(shí)間較阿昔洛韋軟膏對(duì)照組短(P < 0. 01)，水皰停止出現(xiàn)時(shí)間及瘙癢緩解時(shí)間西藏琵蝎多肽凝膠實(shí)驗(yàn)組也早于阿昔洛韋軟膏對(duì)照組(P < 0. 01)。完全結(jié)痂時(shí)間西藏琵蝎多肽凝膠比阿昔洛韋對(duì)照組短(P < 0. 01)，表明西藏琵蝎多肽凝膠外用治療復(fù)發(fā)性單純皰疹較阿昔洛韋軟膏外用起效快、程療短。本發(fā)明是以傳統(tǒng)中藥材蝎的活性多肽為有效成分配制的更為有效的治療單純皰疹病毒引起皰疹的新藥劑，用于治療皰疹見(jiàn)效明顯，治療效果顯著。本發(fā)明療效效果好，對(duì)治療單純皰疹、口唇皰疹、生殖皰疹等有效率達(dá)到100%，且治愈后不復(fù)發(fā)。本發(fā)明所采用的原料均為傳統(tǒng)中藥材蝎的活性成分，無(wú)毒副作用，不留后遺癥。此藥物能夠真正達(dá)到見(jiàn)效快、無(wú)副作用、治愈后不復(fù)發(fā)的效果。表1 西藏琵蝎抗病毒多肽AHSVPl及其結(jié)構(gòu)同源多肽
權(quán)利要求
1.一種分離的西藏琵蝎抗單純皰疹病毒多肽基因，其序列為SEQ ID NO :1所示的基因序列。
2.一種分離的西藏琵蝎抗單純皰疹病毒多肽AHSVP1，其序列為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
3.—組以西藏琵蝎抗單純皰疹病毒多肽AHSVPl為模版的結(jié)構(gòu)同源多肽，其序列為SEQID NO 3 所示的氨基酸序列，但序列 FIGAIARLLSKIF，F(xiàn)IKRIARLLRKIF 和 FIGAIARLLRKIF 除外。
4.西藏琵蝎抗單純皰疹病毒多肽AHSVPl及其結(jié)構(gòu)同源多肽的所有核酸編碼序列，但序列 ttcctctgtgaaagtaagttctgtgaaactcactcttcgataaaatgaaatctcagacctttttccttct ttttctagttgttttattattagcaatttcacaatcagaagctttcattggtgctgttgctagtcttctctctaaaatttttggaaaaagaagtatgagagatatggatactatgaaatacttatatgaaccaagtttgagtgcagctgacttgaaaaccttacaaaaactaatggaaaattactgattatttgaatataataatgttatctctattttagattataaatatttc1111gaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa ^P ttcctctgtgaaagtaagttctgtgaaactcactcttcgataaaatgaaatctcagacctttttccttctttttctagtt gttttattattagcaatttcacaatcagaagctttcattggtgctgttgctagtcttctcagaaaaatttttggaaaaagaagtatgagagatatggatactatgaaatacttatatgaaccaagtttgagtgcagctgacttgaaaaccttacaaaaactaatggaaaattactgattatttgaatataataatgttatctctattttagattataaatatttcttttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa @々卜。
5.西藏琵蝎活性多肽AHSVPl及其同系物多肽在制備治療或預(yù)防單純皰疹病毒感染引起的疾病中的應(yīng)用，其中西藏琵蝎活性AHSVPl同源結(jié)構(gòu)多肽包含序列FIGAIARLLSKIF，F(xiàn)IKRIARLLRKIF 和 FIGAIARLLRKIF。
6.一種治療皰疹外用凝膠制劑，該凝膠劑由重量百分比為0. 5%的西藏琵蝎抗單純皰疹病毒多肽或其結(jié)構(gòu)同源多肽與重量百分比為1.5%凝膠劑基質(zhì)配制而成，其中西藏琵蝎活性 AHSVPl 同源結(jié)構(gòu)多肽包含序列 FIGAIARLLSKIF，F(xiàn)IKRIARLLRKIF 和 FIGAIARLLRKIF。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的治療皰疹外用凝膠制劑，其特征在于是所述的凝膠劑基質(zhì)是羥甲基纖維素。
8.根據(jù)權(quán)利要求6、7所述的治療皰疹外用凝膠制劑，其特征在于是由下述原料組成西藏琵蝎抗單純皰疹病毒多肽AHSVPl或其結(jié)構(gòu)同源多肽0. 5克、丙二醇10克、乙醇20克、羥甲基纖維素1. 5克、三乙醇胺1克、羥苯乙酯0. 1克，無(wú)菌水加至100克，其中西藏琵蝎活性 AHSVPl 同源結(jié)構(gòu)多肽包含序列 FIGAIARLLSKIF，F(xiàn)IKRIARLLRKIF 和 FIGAIARLLRKIF。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種西藏琵蝎抗病毒多肽及用途，通過(guò)分子生物學(xué)和化學(xué)合成的方法，獲得西藏琵蝎抗單純皰疹病毒多肽AHSVP1，然后噬斑法測(cè)定了該西藏琵蝎活性多肽對(duì)單純皰疹病毒(HSV)的抗病毒活性，在低濃度可以有效抑制HSV病毒感染。本發(fā)明還公開(kāi)了一種抗單純皰疹病毒外用凝膠，由重量百分比為0.5％的藥物AHSVP1與重量百分比為1.5％羥甲基纖維素基質(zhì)配制而成。本發(fā)明提供的凝膠劑用于抗單純皰疹病毒感染，產(chǎn)品穩(wěn)定，適于貯放與運(yùn)輸；生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便、合理，生產(chǎn)成本低，適用于大批量工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K38/10GK102382839SQ20111032841
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者吳英亮, 曹志賤, 李文鑫 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)