專利名稱：中華鱘抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新天然抗菌肽，具體是指一種中華鱘抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗菌肽是一類小分子多肽，一般由小于100個氨基酸殘基組成，大多數(shù)帶有一定量的正電荷?？咕木哂幸种萍?xì)菌、真菌、原生生物(Nicolas et al.，1995)及抗病毒 (Mohan et al. , 2010)、抗腫瘤(Papo et al.，2005)等活性，是一類廣譜抗菌多肽，并對真核細(xì)胞無毒。目前抗菌肽成為近年來研究的新熱點(diǎn)，研究的內(nèi)容包括抗菌肽的分離與純化，氨基酸序列的分析，抗菌肽在各個組織中的表達(dá)水平，蛋白質(zhì)構(gòu)型與功能的關(guān)系，抗菌肽的作用機(jī)理(Cammue et al. , 1994 ；Cuesta et al.，2008)，動植物轉(zhuǎn)抗菌肽基因工程(李文楚等，1996)，改造合成抗菌肽基因并應(yīng)用基因工程表達(dá)抗菌肽基因?？咕挠捎诰哂歇?dú)特的殺菌機(jī)制，穩(wěn)定的理化性質(zhì)，廣譜抗菌活性，不容易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，被認(rèn)為是抗菌藥物的潛在替代品，存在于動物體上的抗菌肽是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有重要的生物學(xué)作用，主要表現(xiàn)在具有廣譜抗菌活性、抗病毒作用、抗原蟲作用、抗腫瘤活性、免疫佐劑等幾個方面。抗菌肽具有廣譜抗菌活性。大量的研究報道了抗菌肽的抗菌功能，幾乎所有的抗菌肽對一些革蘭氏陽性菌和陰性菌都有抑制作用。抗菌肽的氨基酸帶有正電荷，而細(xì)菌細(xì)胞膜脂質(zhì)富含磷脂首基而帶有負(fù)電荷，因此抗菌肽可以選擇性的吸附在細(xì)菌細(xì)胞膜表面， 降解細(xì)胞膜，已經(jīng)證明抗菌肽epinecidin-Ι及其類似的合成物，可以破壞革蘭氏陰性菌外膜(Pan et al.，2009)。研究表明，合成的印inecidin-l，THl_5和TH2-3多肽可以降解鴨疫里默氏桿菌的外膜(Pan et al. ,2010) 0日本比目魚hepcidin的研究結(jié)果表明26個氨基酸的JF2短肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和格氏乳球菌具有抗菌活性，但對遲緩愛德華氏菌沒有抗菌活性；另一個19個氨基酸的JFl短肽沒有表現(xiàn)出抗菌活性(Hirono et al.，2005)。表達(dá)羅非魚肝臟抗菌多肽 (TH) 2-3的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，可以抵抗革蘭氏陰性菌海洋弧菌的感染(Hsieh et al.，2010)。 在羅非魚，大西洋鮭和其他一些種類的魚上發(fā)現(xiàn)了編碼h印cidin多拷貝的區(qū)域(Douglas et al. ,2003 ；Huang et al. ,2007) 除此之外，細(xì)菌內(nèi)毒素和脂多糖(LPS)能夠誘導(dǎo)THs， TH2-3基因的表達(dá)，但是卻不能誘導(dǎo)TH1-5，TH2-2基因的表達(dá)(Huang et al.，2007)，可能是hepcidin的多拷貝在魚類進(jìn)化過程中演變?yōu)椴煌墓δ?而hepcidin在哺乳動物中主要參與鐵離子調(diào)控和宿主防御。與哺乳動物不同的是，JFl的功能可能是鐵離子調(diào)控，JF2 的功能可能是抗菌，當(dāng)然還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)這個假說。目前，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)與中華鱘天然抗菌肽相似的蛋白質(zhì)多肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是要提供一種中華鱘抗菌肽和編碼該氨基酸的基因序列，以及從中華鱘血液總RNA中克隆獲得該抗菌肽基因pen-hepcidin及其重組表達(dá)蛋白的方法和該蛋白多肽在制備治療感染性疾病藥物和抗菌飼料添加劑中的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供的一種中華鱘抗菌肽，其特殊之處在于其核苷酸序列如序列表SEQ NO 1所示；插入載體的核苷酸序列如序列表SEQ NO 2所不；其氣基酸序列如序列表SEQNO :3所不；其擴(kuò)增pen-hepcidin基因的引物，它的DNA序列如下所示正向引物5'ACAYCAGAACffAACAYTC3;，反向引物5'CYACTITTAYAAGGCWTA3'。作為優(yōu)選方案，其DNA序列及其編碼的氨基酸序列如下DNA 序列GM TTC AGC AGA ACG AAC ACT CGA CAG MA CMCAG AAA CAC AGG GAC AM CAA ATC CCC TGG CAT TTT TCA GGACM AAC GTC AAA GCC ATC TTT CCC TGT GCA GAT ACT GCT GCAACT GCT GTC GTA ACA AAG GCT GTG GAT ATT GCT GTA AAT TAA編碼的相應(yīng)氨基酸序列SRTNTRQKQQKHRDKQIPWHFSGQNVKAIFPCADTAATAVVTKAVDIAVN本發(fā)明還提供一種制備中華鱘抗菌肽核苷酸的方法，其特殊之處在于它包括以下步驟(I)設(shè)計PCR引物，所述的引物對的DNA序列如下正向引物5'ACAYCAGAACffAACAYTC3;，反向引物5'CYACTTTTAYAAGGCWTA3'；(2)提取中華鱘血液總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化和測序，獲得如序列表SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種中華鱘抗菌肽的應(yīng)用，其特殊之處在于所述的中華鱘抗菌肽在制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或耐藥菌株感染性疾病的藥物中或者作為飼料添加劑的應(yīng)用。本發(fā)明使用的微生物巴斯德畢赤氏酵母GS115/pPICZ a A-pen-hepcidin Pichiapastoris GS115/ pPICZaA-pen-h印cidin，已于2012年I月11日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為NO. M2012007。本發(fā)明用RT-PCR方法，從中華鱘血液總RNA中克隆獲得該抗菌肽基因 pen-hepcidin及其重組表達(dá)蛋白。根據(jù)序列的保守性，設(shè)計一對兼并引物(Fl，Rl);表達(dá)引物(F2，R2)加入EcoR I 和Not I酶切位點(diǎn)，并在下游引物中加入終止密碼子。引物設(shè)計如下Fl :5，-ACAYCAGAACWAACAYTC-3’Rl :5，-CYACTTTTAYAAGGCWTA-3’F2 :5，-CGGAATTCAYCAGAACffAACAYTCG-3 EcoR IR2 :5’ -TAGCGGCCGCTTAATTTACAGCAATATCCAC-3’Not I用表達(dá)引物(F2，R2)對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段與表達(dá)載體pPICZ a A都經(jīng)過限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I分步雙酶切，T4連接酶16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 T0P10,構(gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ a A-抗菌肽，并送華大基因公司測序鑒定。重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α A-抗菌肽通過BstX I單酶切線性化、電泳，純化回收酶切產(chǎn)物。電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的畢赤酵母工程菌GS115，轉(zhuǎn)化后涂布含ZeocinTM培養(yǎng)基，篩選具有高抗性的轉(zhuǎn)化子。先用BMGY培養(yǎng)液(含甘油)激活培養(yǎng)約24h，OD600值達(dá)2_6時，收集菌液，換BMMY培養(yǎng)液，在28°C，250rpm條件下開始甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。每隔24h，向錐形瓶中加入終濃度為O. 8%的甲醇，并補(bǔ)充適量的無菌水，同時誘導(dǎo)pPICZ a A空載體酵母菌。72h后收集上述甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后的上清液，用飽和度為85%的硫酸銨濃縮酵母誘導(dǎo)菌表達(dá)上清，對重組酵母菌表達(dá)上清液進(jìn)行抑菌活性、抑菌效價和熱穩(wěn)定性測定，初步判斷中華鱘抗菌肽的生物活性。本發(fā)明的抗菌肽對部分革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有抑菌活性，且對耐藥菌株也有明顯的作用，可用于制備治療感染性疾病的藥物或作為飼料添加劑等應(yīng)用。


圖I :是本發(fā)明中華鱘抗菌肽pen-kpcidin基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2 :是本發(fā)明中重組抗菌肽對金黃色葡萄球菌抑菌活性測定圖3 :是本發(fā)明中重組抗菌肽對大腸桿菌抑菌活性測定圖4 :是本發(fā)明中重組抗菌肽對無乳鏈球菌抑菌活性測定圖5 :是本發(fā)明中重組抗菌肽對溫和氣單胞菌抑菌活性測定圖6 :是本發(fā)明中重組抗菌肽對嗜水氣單胞菌抑菌活性測定圖7 :是本發(fā)明中核苷酸序列的序列表SEQ NO 1圖8 :是本發(fā)明中插入載體的核苷酸序列的序列表SEQ NO 2圖9 :是本發(fā)明中氨基酸序列的序列表SEQ NO 3圖中圖I中M :DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)；1、2 :中華鱘抗菌肽pen-hepcidin擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2中重組抗菌肽對金黃色葡萄球菌抑菌活性測定1 :氨芐青霉素10yg;2 pPICZ αΑ酵母轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物；3 :pPICZ a A-pen-hepcidin轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物I ;4 pPICZ a A-pen-hepcidin 轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物 II。圖3中重組抗囷妝對大腸桿囷抑囷活性測定I :氣節(jié)青霉素10 μ g ;2 pPICZ a A酵母轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物；3 pPICZ a A-pen-hepcidin轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物I ;4 pPICZ a A-pen-hepcidin 轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物 II。圖4中重組抗菌肽對無乳鏈球菌抑菌活性測定1 :氨芐青霉素10yg;2 pPICZ a A酵母轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物；3 pPICZ a A-pen-hepcidin轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物I ;4 pPICZ a A-pen-hepcidin 轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物 II。圖5中重組抗菌肽對溫和氣單胞菌抑菌活性測定1 :氨芐青霉素10μ g ;2 pPICZ a A酵母轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物；3 pPICZ a A-pen-hepcidin轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物I ;4 pPICZ a A-pen-hepcidin 轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物 II。圖6中重組抗菌肽對嗜水氣單胞菌抑菌活性測定1 :氨芐青霉素10μ g ;2 pPICZ a A酵母轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物；3 pPICZ a A-pen-hepcidin轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物I ;4 pPICZ a A-pen-hepcidin 轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物 II。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :中華鱘抗菌肽基因的克隆(I)引物設(shè)計根據(jù)NCBI/GenBank上已登錄魚類hepcidin序列信息，根據(jù)序列的保守性， 用Primer 5. O軟件在cDNA序列ORF的上下游區(qū)域，設(shè)計一對兼并引物(Fl，Rl) ；F1 5， -ACAYCAGAACWAACAYTC-3， Rl : 5，-CYACTTTTAYAAGGCWTA-3，。(2) Trizol法提取血液總RNA從中華鱘尾動脈用無菌一次性注射器吸取血液，常溫靜置一段時間后，常溫下 IOOOrpm離心30min,棄上清液,沉淀即為血細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿經(jīng)O. I %的DEPC水處理，150°C烘烤4h。塑料器皿經(jīng)O. I % DEPC 水浸泡過夜，121°C、20min高溫高壓滅菌。金屬用具經(jīng)lmol/L的NaOH浸泡2h，經(jīng)O. 01 %的 DEPC水徹底沖洗后，37 °C烘干。各試劑用無RNase的O. 01 % DEPC水配置?？俁NA抽提按 Trizol說明書進(jìn)行。(3) cDNA第一條鏈的合成及PCR擴(kuò)增I)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，以提取的中華鱘血液總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為40 μ L,即
權(quán)利要求
1.一種中華鱘抗菌肽，其特征在于其核苷酸序列如序列表SEQNO 1所示；插入載體的核苷酸序列如序列表SEQ NO 2所示；其氨基酸序列如序列表SEQ NO 3所示；其擴(kuò)增 pen-epcidin基因的引物,它的DNA序列如下所示正向引物5' ACAYCAGAACffAACAYTC ，反向引物5' CYACTTTTAYAAGGCffTA 。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的中華鱘抗菌肽，其特征在于其DNA序列及其編碼的氨基酸序列如下DNA 序列GM TTC AGC AGA ACG AAC ACT CGA CAG MA CMCAG MA CAC AGG GAC AAA CAA ATC CCC TGG CAT TTT TCA GGACAA AAC GTC AAA GCC ATC TTT CCC TGT GCA GAT ACT GCT GCAACT GCT GTC GTA ACA AAG GCT GTG GAT ATT GCT GTA AAT TAA編碼的相應(yīng)氨基酸序列SRTNTRQKQQKHRDKQIPWHFSGQNVKAIFPCADTAATAVVTKAVDIAVNo
3.—種如權(quán)利要求I或2所述的制備中華鱘抗菌肽核苷酸的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)設(shè)計PCR引物，所述的引物對的DNA序列如下正向引物5' ACAYCAGAACffAACAYTC 3'，反向引物5' CYACTTTTAYAAGGCffTA 3'；(2)提取中華鱘血液總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化和測序，獲得如序列表SEQ ID NO 1所不的核苷酸序列。
4.一種如權(quán)利要求I或2所述的中華鱘抗菌肽的應(yīng)用，其特征在于所述的中華鱘抗菌肽在制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或耐藥菌株感染性疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中華鱘抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用，具體是指一種新的中華鱘天然抗菌肽pen-hepcidin和編碼該基因的氨基酸序列，以及該蛋白在制備治療感染性疾病藥物和飼料添加劑中的應(yīng)用。本發(fā)明用RT-PCR方法，從中華鱘血液總RNA中克隆獲得該抗菌肽基因pen-hepcidin，其DNA序列如序列表中SEQ ID1序列所示。該基因編碼的蛋白(pen-hepcidin)，其氨基酸序列如序列表SEQ ID3序列所示。經(jīng)氨基酸序列分析，在目前的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)有與該抗菌肽相似的蛋白質(zhì)多肽，屬于一種新型的抗菌肽。本發(fā)明的抗菌肽對部分革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有抑菌活性，且對耐藥菌株也有明顯的作用，可用于制備治療感染性疾病的藥物或作為抗菌飼料添加劑等應(yīng)用。
文檔編號A61K38/17GK102584974SQ201210040919
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月22日
發(fā)明者袁改玲, 陳思思, 高宇 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)