專利名稱：綴合的凝血因子viii的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及綴合形式的凝血因子VIII。
背景技術(shù)：
因子VIII (FVIII)是必不可少的凝血因子，也被稱為抗血友病因子(AHF)。對(duì)人類而言，因子VIII由F8基因編碼。在該基因上的缺陷會(huì)導(dǎo)致血友病A，這是一種眾所周知的隱性X染色體連鎖的凝血異常，影響著大約1/5000的男性。X染色體連鎖的F8基因編碼來自26個(gè)外顯子的具有2351個(gè)氨基酸的多肽，該多肽在被切割了信號(hào)肽之后形成具有2332個(gè)氨基酸的成熟FVIII分子(Wang et al. Int.J. Pharmaceutics, 259:1-15 (2003))。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FVIII被合成并通過肝臟的血管細(xì)胞、血管小球細(xì)胞(glomerular cells)、管狀內(nèi)皮細(xì)胞(tubular endothelium cells)和竇內(nèi)皮細(xì)·胞(sinusoidal cells)釋放到血液中,但是人體內(nèi)FVIII的初始釋放位點(diǎn)在哪里仍然存在很大爭(zhēng)議。FVIII分子由六個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域組成；NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。成熟的分子含有許多翻譯后修飾，包括N-連接和O-連接的糖基化，磺基化以及二硫鍵的形成。FVIII總共含有23個(gè)半胱氨酸殘基，其中16個(gè)半胱氨酸殘基在蛋白質(zhì)的A和C結(jié)構(gòu)域中形成了 8個(gè)二硫鍵(McMullen et al. Protein Science, 4:740-746 (1995))。由于蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，基于糖基化的水平和類型，它的循環(huán)分子量(circulation molecular weight)能夠多達(dá)330kDa。FVIII也會(huì)經(jīng)歷蛋白水解過程，從而使得血液循環(huán)中的種類是由重鏈(A1-A2-B)和輕鏈(A3-C1-C2)組成的異二聚體。當(dāng)FVIII被分泌進(jìn)入血液循環(huán)時(shí)，它以非共價(jià)的形式與血管性血友病因子(von Willebrand Factor, vffF)結(jié)合。兩個(gè)分子的結(jié)合涉及FVIII的輕鏈的 A3 和 C2 結(jié)構(gòu)域(Lacroix-Desmazes et al. Blood, 112:240-249 (2008))。與 vWF 的結(jié)合增加了 FVIII的穩(wěn)定性和循環(huán)半衰期(circulatinghalf-life)。雖然與vWF的結(jié)合能夠增加FVIII的循環(huán)半衰期，它的天然半衰期僅為15-19小時(shí)。因子VIII是參與內(nèi)源性凝血途徑必不可少的輔因子。在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中它的作用是作為“成核模板”，以使得FX酶復(fù)合物的組分在活化的血小板的表面以正確的空間方向有機(jī)排布(Shen et al. Blood, 111:1240-1247(2008))。FVIII 首先由凝血酶(因子 II a)或者FXa活化，然后它以FVIIIa的形式從vWF解離。然后，F(xiàn)VIIIa在血管損傷的位置與活化的血小板結(jié)合，并通過A2和A3介導(dǎo)的相互作用與FIXa結(jié)合。當(dāng)血小板表面存在Ca2+離子時(shí)，F(xiàn)IXa與FVIII的結(jié)合使得FIXa的蛋白水解活性增加了大約200000倍。然后，該復(fù)合物將FX活化為FXa。然后因子Xa和它的輔因子因子Va活化更多的凝血酶。凝血酶轉(zhuǎn)而將纖維蛋白原切割為纖維蛋白，然后纖維蛋白聚合并交聯(lián)(利用因子XIII)成為纖維蛋白血塊。由于不再受vWF的保護(hù)，在過程中活化的FVIII被蛋白水解而失活(最主要是通過活化的蛋白質(zhì)C和因子IXa)并迅速從血流中被清除。蛋白質(zhì)聚乙二醇化方法已由PolyTherics有限公司開發(fā),并被稱為TheraPEG ,在該產(chǎn)品中，通過蛋白質(zhì)中的一對(duì)半胱氨酸殘基的還原型二硫鍵，PEG聚合物與目的蛋白相連接(WO 2005/007197)。這一技術(shù)已被用于制備無因子FIXa污染的因子IX的聚乙二醇化變體(WO 2009/130602)。然而，對(duì)于使用同樣的技術(shù)制備聚乙二醇化的FVIII而言，則被認(rèn)為是重要的或者非常規(guī)的。從活性角度來看，F(xiàn)VIII與FIX存在某些關(guān)鍵的區(qū)別，這就意味著這種蛋白質(zhì)和生物相容性聚合物的綴合并不是一個(gè)簡單的步驟。例如，F(xiàn)IXa是一種絲氨酸蛋白酶，而FVIII則沒有酶活性。一旦活化，F(xiàn)IX僅需要與它的輔因子形成結(jié)合，而FVIII則需要參與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。而且，F(xiàn)VIII是輔因子，且能夠形成“模板”，其它凝血因子(包括FIXa)組裝在該“模板”上從而增強(qiáng)它們的催化活性。為了發(fā)揮FVIII的功能，它必須能夠與FX、FXa、FIXa和磷脂相結(jié)合。而且，為了使FVIII在血液循環(huán)中穩(wěn)定，它必須能夠與血管性血友病因子結(jié)合。因此，由于實(shí)現(xiàn)分子間相互作用的FVIII所有的結(jié)構(gòu)域中都有二硫化物存在，該蛋白的半胱氨酸殘基上的二硫化物進(jìn)行聚乙二醇化就會(huì)在空間上阻礙這些相互作用。因而，因子FVIII的聚乙二醇化存在一些不同于FIX的獨(dú)特的和不同的挑戰(zhàn)。使用TheraPEG 技術(shù)對(duì)FIX進(jìn)行聚乙二醇化獲得成功的事實(shí)，對(duì)于使用同樣的方法能否成功制備聚乙二醇化的FVIII而言并沒有指導(dǎo)意義，因?yàn)镕VIII是結(jié)構(gòu)和功能上都不相同的蛋白質(zhì)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過將FVIII和一種或多種生物相容性聚合物綴合可以增強(qiáng)因子VIIK本文中稱為FVIII)的操作性。增強(qiáng)的操作性能也包括制備高純度FVIII綴合物的能力。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了通過一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基與FVIII綴合的生物相容性聚合物。生物相容性聚合物可選自由聚乙二醇(PEG)、聚磷脂酰膽堿(PC)、聚丙二醇(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚環(huán)氧乙烷(PEO)、聚氧乙烯醇(polyoxyethylated polyol)、聚烯 IKpolyolefinic alcohol)、聚輕燒基丙烯酸甲酯(polyhydroxyalkylmethacrylate)、多糖、聚α _輕基酸、聚乙烯醇、聚磷腈(polyphosphosphasphazene)、聚 N-丙烯酰嗎啉、聚烯烴氧化物聚合物(polyalkyene oxidepolymers)、聚馬來酸、聚DL-丙氨酸、羧甲基纖維素、右旋糖酐、淀粉或淀粉衍生物、透明質(zhì)酸甲殼素(hyaluronic acid chitin)、聚甲基丙烯酸酯、聚唾液酸(PSA)、聚輕基羧酸鈉(polyhydroxy alkanoates)、聚氨基酸以及它們的組合組成的組中。所述生物相容性聚合物可以具有線性或分支狀結(jié)構(gòu)。在另一種實(shí)施方式中，所述生物相容性聚合物為蛋白質(zhì)，選自但不限于由FVII、·白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、免疫球蛋白(包括單克隆抗體)、抗體片段如單結(jié)構(gòu)域抗體、\、VH、Fab、F(ab，)2、Fab’、Fab3、scFv、di-scFv、sdAb、Fe 以及它們的組合組成的組中。如果需要，每個(gè)FVIII分子可以通過一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基與一種或多種生物相容性聚合物綴合。游離的半胱氨酸殘基是還原胱氨酸二硫鍵的產(chǎn)物。本發(fā)明的生物相容性聚合物可以通過一個(gè)或多個(gè)還原的半胱氨酸二硫鍵與FVIII綴合。所述綴合可以是通過將FVIII中形成二硫鍵的兩個(gè)半胱氨酸殘基的硫殘基橋接的連接基團(tuán)的方式。因而，二硫鍵可以是天然二硫鍵或者是重組引入的二硫鍵。PEG分子可以具有任何適當(dāng)?shù)姆肿恿浚?-100kDa，10_500kDa。適當(dāng)?shù)貫?-30kDa或者10-30kDa。某些適當(dāng)?shù)姆肿恿堪?0、20或者30kDa。適當(dāng)?shù)?，F(xiàn)VIII綴合物的生物相容性聚合物部分可以與兩個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合，從而在FVIII中形成二硫鍵。這樣，含有PEG的連接物橋接了所述二硫鍵。WO 2005/007197、WO 2009/047500 和 WO 2010/010324 描述了這種綴合過程。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，可以根據(jù)圖2中所示的方案將生物相容性聚合物與FVIII綴合。在圖2中，顯示了生物相容性聚合物和連接基團(tuán)之間的基團(tuán)R1，所述連接基團(tuán)跨越(spanning) 了 FVIII分子上二硫鍵的硫原子。Rl代表取代基團(tuán)，所述取代基團(tuán)可以是直接的鍵(direct bond)、亞烷基(優(yōu)選C1,亞燒基)或可任選取代的芳基或雜芳基(heteroaryl groups);其中所述芳基包括苯基、苯甲酰基和萘基；其中適當(dāng)?shù)碾s芳基包括吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑(oxazole)、咕嗪、喃唳和嘌呤；其中與聚合物的連接可為通過水解不穩(wěn)定的鍵的方式的連接或通過穩(wěn)定的鍵的連接。在可任選取代的芳基或者雜芳基上存在的具體取代基包括例如選自-CN、-NO2,-C02R、-C0H、-CH20H、-COR、-OR、-0C0R、-OCO2R, -SR、-S0R、-SO2R, -NHC0R、-NRC0R、_NHC02R、-NR’ C02R、-NO、-ΝΗ0Η、-NR’ OH、-C=N-NHCOR, -C=N-NRj COR、-N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R,鹵素例如氟或氯、-C = CR、-C=CR2和13C=CHR中的一種或多種相同或不同的取代基，其中每個(gè)R或R’獨(dú)立地代表氫原子或者烷基(優(yōu)選C1J或者芳基(優(yōu)選苯基)。特別優(yōu)選地存在吸電子取代基。在一種實(shí)施方式中，Rl中可任選取代的芳基或雜芳基包括被酰胺基(NHCO)取代的芳基或雜芳基，所述酰胺基將Rl單元與生物相容性聚合物連接。因此，在FVIII半胱氨酸殘基之間的原始二硫鍵的兩個(gè)硫原子之間的連接基團(tuán)可以含有3-碳橋。在一種實(shí)施方式中,在FVIII半胱氨酸殘基之間的原始二硫鍵的兩個(gè)硫原子之間的連接基團(tuán)是(CH2) 2CHC(0)-。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，生物相容性聚合物如上所述的進(jìn)行綴合，其中包括與生物相容性聚合物相綴合的FVIII的組合物具有以下結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種生物相容性聚合物，該生物相容性聚合物通過一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基與FVIII綴合。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物相容性聚合物，其中，所述生物相容性聚合物通過一個(gè)或多個(gè)還原的半胱氨酸二硫鍵與FVIII綴合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物相容性聚合物，其中，所述生物相容性聚合物通過連接基團(tuán)與FVIII綴合，所述連接基團(tuán)橋接在FVIII中形成二硫鍵的兩個(gè)半胱氨酸殘基的硫殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物相容性聚合物，其中，所述連接基團(tuán)通過基團(tuán)R1和所述生物相容性聚合物綴合，R1是直接的鍵、C1,亞烷基、或者可任選取代的芳基或雜芳基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物相容性聚合物，其中，R1選自苯基、苯甲酰基、萘基、批啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、噠嗪、嘧啶或嘌呤。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任意一項(xiàng)所述的生物相容性聚合物，其中，在FVIII的半胱氨酸殘基之間的原始二硫鍵的兩個(gè)硫原子之間的連接基團(tuán)含有3-碳橋。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任意一項(xiàng)所述的生物相容性聚合物，其中，在FVIII的半胱氨酸殘基之間的原始二硫鍵的兩個(gè)硫原子之間的連接基團(tuán)是(CH2) 2CHC (O) _。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的生物相容性聚合物，所述生物相容性聚合物與FVIII綴合，其中，綴合物具有如下結(jié)構(gòu)
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的生物相容性聚合物，其中，所述生物相容性聚合物具有大約5-100kDa的分子量。
10.一種藥物組合物，該藥物組合物含有前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)所述的生物相容性聚合物，所述生物相容性聚合物通過一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基與FVIII綴合。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物含有藥學(xué)上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的藥物組合物，所述藥物組合物還含有其他藥物活性劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述藥物組合物適于腸外給藥。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-13中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述藥物組合物適于皮內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射以及靜脈輸注或骨內(nèi)輸注。
15.根據(jù)權(quán)利要求10-14中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述藥物組合物以藥水、懸浮液或乳液的形式存在。
16.根據(jù)權(quán)利要求10-15中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中，與未經(jīng)修飾的FVIII相t匕，F(xiàn)VIII綴合物具有更長的半衰期。
17.根據(jù)權(quán)利要求10-16中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中，與未經(jīng)修飾的FVIII相t匕，F(xiàn)VIII綴合物具有更高的AUC。
18.根據(jù)權(quán)利要求10-17中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中，與未經(jīng)修飾的FVIII相t匕，F(xiàn)VIII綴合物具有更高的生物利用率。
19.根據(jù)權(quán)利要求10-17中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中，與未經(jīng)修飾的FVIII相t匕，F(xiàn)VIII綴合物具有更低的免疫原性。
20.一種治療凝血病或創(chuàng)傷的方法，該方法包括用權(quán)利要求10-19中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物對(duì)有需要的患者進(jìn)行給藥。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的治療方法，其中，所述凝血病是血友病A。
22.降低患有血友病A或創(chuàng)傷的哺乳動(dòng)物的關(guān)節(jié)積血、出血、胃腸道出血和經(jīng)血過多的風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法包括用權(quán)利要求12-21中任意一項(xiàng)所述的含有FVIII綴合物的藥物組合物對(duì)有需要的患者進(jìn)行給藥。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述組合物通過皮下途徑給藥。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述組合物通過靜脈途徑給藥。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，每一至十四天用所述組合物進(jìn)行給藥一次。
26.生物相容性聚合物在治療以FVIII功能喪失為特征的凝血病或治療創(chuàng)傷中的用途，所述生物相容性聚合物通過一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基與FVIII綴合。
27.—種制備以下生物相容性聚合物和FVIII的綴合物的方法，
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述綴合反應(yīng)物具有以下分子式，
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生物相容性聚合物，該生物相容性聚合物通過一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基與FVIII綴合，適當(dāng)?shù)赝ㄟ^FVIII中還原的二硫鍵間的連接基與FVIII綴合，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有這種綴合形式的FVIII。
文檔編號(hào)A61K38/37GK102939108SQ201180021888
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者W·亨利 申請(qǐng)人:劍橋生物制藥專利有限公司