專利名稱：脆弱擬桿菌在制備治療炎癥性腸病組合物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脆弱擬桿菌的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及脆弱擬桿菌在制備治療炎癥性腸病組合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
炎癥性腸病是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎性疾病，包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。潰瘍性結(jié)腸炎的臨床表現(xiàn)為持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹瀉、黏液膿血便伴腹痛、里急后重和不同程度的全身癥狀，病程多在4 6周以上?？捎衅つw、黏膜、關(guān)節(jié)、眼和肝膽等的腸外表現(xiàn)?？肆_恩病的臨床表現(xiàn)呈多樣化，包括消化道表現(xiàn)、全身性表現(xiàn)、腸外表現(xiàn)及并發(fā)癥。消化道表現(xiàn)主要有腹瀉和腹痛，可有血便；全身性表現(xiàn)主要有體質(zhì)量減輕、發(fā)熱、食欲不振、疲勞、貧血等，青少年患者可見生長發(fā)育遲緩；腸外表現(xiàn)與UC相似。具體病情嚴(yán)重程度判斷均應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)、內(nèi)鏡表現(xiàn)及病理。目前均無特異性的能完全治愈炎癥性腸病的藥物，臨床上主要的治療藥物為氨基水楊酸制劑、激素、硫唑嘌呤和英夫力西。

在益生菌中，被廣泛關(guān)注的雙歧桿菌和乳酸菌在攝入后對(duì)人和動(dòng)物具有很好作用的菌株，它們的特定菌株能夠在腸粘膜上定居，在腸道內(nèi)建群并且防止有害微生物在其上粘附，是能通過保持腸內(nèi)自然微生物區(qū)系促進(jìn)生物個(gè)體健康的可生長的微生物制劑，幫助維持人和動(dòng)物的健康。在大量的實(shí)驗(yàn)室研究中表明，雙歧桿菌及乳酸桿菌對(duì)于腸道炎癥改變有很好的預(yù)防及治療作用。在很多臨床實(shí)驗(yàn)中，盡管益生菌對(duì)于炎癥性腸病的內(nèi)鏡下表現(xiàn)無明顯改變，但是對(duì)于臨床癥狀的緩解很有幫助。脆弱擬桿菌(ifecieroiofes fragilis')作為一種革蘭氏染色陰性、桿狀、兩端鈍圓而濃染，有莢膜、無芽胞、無動(dòng)力的專性厭氧細(xì)菌，分產(chǎn)腸毒素型和非產(chǎn)腸毒素型。脆弱擬桿菌作為人及動(dòng)物腸道正常菌群的一部分，主要存于結(jié)腸中，此外，呼吸道、胃腸道及泌尿生殖道粘膜也可定植生長。研究較多的是脆弱擬桿菌作為一種條件致病菌，當(dāng)宿主粘膜受損時(shí)，可侵犯粘膜下層，引起感染，也可經(jīng)血液流動(dòng)，引起身體其它器官如腸道、腹腔、肝、肺、腦組織化膿性感染并伴發(fā)膿腫和引起急慢性腹瀉等。此外，其對(duì)結(jié)腸、直腸癌的發(fā)生也有促進(jìn)作用。然而，脆弱擬桿菌并非只是一種條件致病菌。1991年張季階發(fā)表了《一種無毒脆弱擬桿菌的分離鑒定》，報(bào)導(dǎo)了關(guān)于1983年9月從一個(gè)發(fā)育良好的嬰兒糞便中分離出量大而又較純的細(xì)菌，經(jīng)以系列的鑒定、基礎(chǔ)試驗(yàn)和臨床應(yīng)用觀察，屬于脆弱擬桿菌群中的一株無毒菌，是人體的益生菌，定名為BF839菌株。由此，研究發(fā)現(xiàn)了，脆弱擬桿菌也是一種益生菌。但是，脆弱擬桿菌作為一種益生菌，并且在制備治療炎癥性腸病組合物的相關(guān)應(yīng)用，目前尚未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供脆弱擬桿菌在制備治療炎癥性腸病組合物中的應(yīng)用。為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:提供脆弱擬桿菌在制備治療炎癥性腸病組合物中的應(yīng)用，所述的脆弱擬桿菌保藏單位名稱為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2013年3月12日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7280，分類命名為
Bacteroides Tragilis0其中，所述組合物為至少含有能治療炎癥性腸病的脆弱擬桿菌的食品或藥物組合物。其中，所述組合物選自奶粉、干酪、凝乳、酸奶酪、冰激凌、奶基發(fā)酵食品、發(fā)酵谷類食品、嬰兒食品或?qū)櫸锸称分械娜我庖环N。其中，所述組合物為丸劑、片劑、顆粒制劑、膠囊、口服液或者管飼制劑。其中，所述組合物為含有所述脆弱擬桿菌的液體細(xì)菌懸浮液。
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其中，所述脆弱擬桿菌在所述組合物中的含量為KTlOiciCfu /ml。本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明發(fā)掘了脆弱擬桿菌新的用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，脆弱擬桿菌安全無毒，藥理作用強(qiáng)，對(duì)于炎癥性腸病有很好的治療作用，從而預(yù)示了脆弱擬桿菌具有很好的食用和藥用前景。脆弱擬桿菌作為一種益生菌，可用于制備治療炎癥性腸病的食品或藥物組合物，進(jìn)而為臨床提供適合人體服用的保健食品或治療藥物。
具體實(shí)施方式
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下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，這些實(shí)施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1脆弱擬桿菌菌液的制備 (O由嬰兒糞便中分離脆弱擬桿菌
按“正常菌群檢查法”稱取0.5克大便，置于先裝有4.5ml生理鹽水的試管中，以此連續(xù)稀釋成10_卜10_6，由高稀積度向低稀積度滴到Bd培養(yǎng)基平板上，置于厭氧產(chǎn)氣盒中加厭氧產(chǎn)氣袋進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。置37°C，2 7天后開罐檢查。選取單一菌落進(jìn)行純培養(yǎng)、染色鏡檢、培養(yǎng)特性、生理生化檢測(cè)。(2)脆弱擬桿菌的增菌培養(yǎng)及菌液制備
選取純化后的單個(gè)菌落接種于改良的胰蛋白胨肉湯中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，所得菌液離心沉淀，轉(zhuǎn)速3000r/min,離心15min,去上清,沉淀物用生理鹽水洗漆后,沉淀物用生理鹽水稀釋，用麥?zhǔn)媳葷峁茏鼍鷶?shù)測(cè)定，稀釋至IO8 cfu /ml, IO9 cfu /ml, IO10 cfu /ml，保存?zhèn)溆?。?shí)施例2脆弱擬桿菌毒力實(shí)驗(yàn)
采用實(shí)施例1制備的脆弱擬桿菌菌液進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
(O小鼠急性毒力實(shí)驗(yàn)
取體重22±2克C57BR/C小鼠(雌雄各半)60只，分成高劑量組、低劑量組和對(duì)照組，各組20只。高劑量組每只小鼠每天灌胃IO12 cfu /ml菌液0.5ml，低劑量組每天灌胃IO9 cfu/ml菌液0.5ml，對(duì)照組每天灌胃0.5ml生理鹽水。連續(xù)觀察14天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:小鼠正常生長，未見死亡，LD50測(cè)不出。(2)大鼠毒力實(shí)驗(yàn)
取150±20克SD大鼠30只(雌雄各半)，分為3組:高低劑量組和對(duì)照組。高劑量組每只大鼠每天灌胃1012cfu/ml菌液2ml,低劑量組每天灌胃109cfu/ml菌液2ml,對(duì)照組每天灌胃2ml生理鹽水。連續(xù)觀察14天，14天后抽靜脈血測(cè)血象、肝腎功。取胃腸肝脾組織做病理切片電鏡觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:均未見明顯異常。(3)恒河猴毒力實(shí)驗(yàn)
取恒河猴10只(雌雄各半)，分為2組:高低劑量組和對(duì)照組。高劑量組每只恒河猴每天口服1012cfu/ml菌液100ml,低劑量組每天口服109cfu/ml菌液100ml。連續(xù)觀察60天。14天、30天、45天、60天后分別抽靜脈血測(cè)血象、肝腎功，測(cè)心電圖。取胃腸肝脾組織做病理切片電鏡觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:均未見明顯異常。實(shí)施例3脆弱擬桿菌對(duì)于炎癥性腸病的短期治療作用 采用實(shí)施例1制備的脆弱擬桿菌菌液進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:BALB/c小鼠
動(dòng)物模型構(gòu)建:化學(xué)藥物誘導(dǎo)炎癥性腸病(三硝基苯磺酸TNBS和乙醇誘導(dǎo)出克隆恩病、葡聚糖硫酸鈉DSS誘導(dǎo)出潰瘍性結(jié)腸炎)
取50只小鼠隨機(jī)分為5組:TNBS組、DSS組、TNBS+Bd組、DSS+Bd組、對(duì)照組。TNBS組、TNBS+Bd組、對(duì)照組的小鼠禁食(不禁水)，先用50/L水合氯醛0.15ml腹腔注射使小鼠輕度麻醉，約25min以后用套接了小號(hào)導(dǎo)尿管的Iml注射器抽吸藥液，從肛門將導(dǎo)尿管緩慢插入約3.5cm，然后將藥液緩慢注入，停20s后抽出導(dǎo)尿管，再將小鼠倒懸約30s后放入盒中；TNBS組和TNBS+Bd組灌注20g/L TNBS 500ml/L的乙醇溶液0.1ml ;對(duì)照組灌注0.15ml乙醇；TNBS+Bd組造模成功后每天灌胃0.5ml 109cfu/ml的Bd懸液，連續(xù)7d。DSS組小鼠飲用液體為5g/L DSS蒸餾水溶液，連續(xù)7天；DSS+Bd組造模成功后每天灌胃 0.5ml 109cfu/ml 的 Bd 懸液，連續(xù) 7d。測(cè)量指標(biāo):第8天處死，觀察指標(biāo)為疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI )、病理組織學(xué)、抽血檢測(cè)細(xì)胞因子 IL-2、IL-6、IL-10、TNF- α。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:脆弱擬桿菌灌胃組的疾病活動(dòng)指數(shù)較造模組明顯降低，IL-10明顯升高，TNF- α明顯降低，但病理學(xué)無明顯改變。實(shí)施例4脆弱擬桿菌對(duì)于炎癥性腸病的長期治療作用 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:BALB/c小鼠
動(dòng)物模型構(gòu)建:取60只小鼠，隨機(jī)分為4組，Bdl組10只、Bd2組10只、Bd+DSS組20只、空白對(duì)照組20只。Bd+DSS組:(I)保證小鼠每天飲用5ml 2g/L的DSS ; (2)第三天起飲用水替換為含2%DSS的蒸餾水;(3)從(2)算起，5天后停用DSS滿2周；(4) 22-26天時(shí)重復(fù)(I)到(3);第29天起停用DSS滿2周；(5) 43-47重復(fù)(I)到(3) ; (6)第50天開始將DSS換為蒸餾水。Bdl組:從第一天起每天灌胃0.5ml 109cfu/ml的脆弱擬桿菌菌液；
Bd2組:從第50天開始保證每天飲用2ml 109cfu/ml的菌液。測(cè)量指標(biāo):Bdl組、Bd+DSS組10只、空白對(duì)照組10只小鼠第51天處死，觀察指標(biāo)為病理組織學(xué)、抽血檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-10, TNF-α ;余下小鼠第80天處死，觀察指標(biāo)為病理組織學(xué)、抽血檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-10, TNF-α。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Bdl組、Bd2組小鼠病理較Bd+DSS組明顯接近正常，腸道粘膜完整，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少；IL_10明顯升高，TNF-α明顯降低。實(shí)施例3和實(shí)施例4的 結(jié)果說明，脆弱擬桿菌對(duì)于炎癥性腸病有很好的治療作用。
權(quán)利要求
1.脆弱擬桿囷在制備治療炎癥性腸病組合物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脆弱擬桿菌在制備治療炎癥性腸病組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物為至少含有能治療炎癥性腸病的脆弱擬桿菌的食品或藥物組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脆弱擬桿菌在制備治療炎癥性腸病組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物選自奶粉、干酪、凝乳、酸奶酪、冰激凌、奶基發(fā)酵食品、發(fā)酵谷類食品、嬰兒食品或?qū)櫸锸称分械娜我庖环N。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脆弱擬桿菌在制備治療炎癥性腸病組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物為丸劑、片劑、顆粒制劑、膠囊、口服液或者管飼制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脆弱擬桿菌在制備治療炎癥性腸病組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述組合物為含有所述脆弱擬桿菌的液體細(xì)菌懸浮液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脆弱擬桿菌在制備治療炎癥性腸病組合物中的應(yīng)用，其特征在于:所述脆弱擬桿菌在所述組合物中的含量為IO8I`OiciCfu /ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及脆弱擬桿菌的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及脆弱擬桿菌在制備治療炎癥性腸病組合物中的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)證明脆弱擬桿菌安全無毒，藥理作用強(qiáng)，對(duì)于炎癥性腸病有很好的治療作用，從而預(yù)示了脆弱擬桿菌具有很好的食用和藥用前景。本發(fā)明發(fā)掘了脆弱擬桿菌新的用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域，脆弱擬桿菌作為一種益生菌，可用于制備治療炎癥性腸病的食品或藥物組合物，為臨床提供適合人體服用的保健食品或治療藥物。
文檔編號(hào)A61P1/00GK103156888SQ20131008571
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者智發(fā)朝, 白楊, 劉洋洋 申請(qǐng)人:廣州知光生物科技有限公司