專利名稱：二甲雙胍在對放化療損傷起保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二甲雙胍的新用途，特別涉及一種二甲雙胍對放療和/或化療藥物引起的造血免疫細(xì)胞損傷起保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
許多腫瘤患者在接受放療、化療過程中出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作用，致使不能堅(jiān)持治療，導(dǎo)致預(yù)后不良。其中急性和慢性骨髓抑制是常出現(xiàn)的治療毒副反應(yīng)。急性骨髓抑制主要是放化療引起的造血祖細(xì)胞(hematopoietic progenitor cells, HPCs)凋亡反應(yīng),對靜止期的造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSCs)的影響程度較輕,臨床表現(xiàn)明顯,在早 期就可以采取治療措施。但也有部分患者出現(xiàn)遠(yuǎn)期損傷即出現(xiàn)了長期骨髓抑制，表現(xiàn)為急 性骨髓抑制恢復(fù)之后的HSCs儲備降低和HSCs自我更新能力下降。造血干細(xì)胞具有自我更新、增殖、分化生成全血細(xì)胞的功能，受損后引起骨髓持久抑制甚至個(gè)體死亡。接受全身照射(total body irradiation, TBI)或某些化療藥物如卡鉬、馬利蘭(busulfan, BU)、卡氮芥(BCNU)的個(gè)體更容易出現(xiàn)持久性骨髓損傷。由于持久性骨髓損傷是遲發(fā)性的，一般情況下細(xì)胞庫數(shù)量減少但外周血細(xì)胞數(shù)正常，在臨床容易被忽視。臨床上各種生長因子的治療可能會加速HSC的耗竭，在后續(xù)的抗癌治療或骨髓移植時(shí)出現(xiàn)再障性貧血等嚴(yán)重后果。照射引起HSCs衰老的分子機(jī)制尚未闡明，目前缺乏有效的治療手段。尋找新的手段防止放化療的骨髓損傷始終是臨床迫切需要解決的問題。并且隨著核能利用的增加，核恐怖威脅持續(xù)存在，放射性物質(zhì)的廣泛使用，導(dǎo)致輻射暴露的可能性增加，出于國家安全需要，各國也都在加緊輻射損傷防治藥物的研發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，放化療導(dǎo)致的HSCs衰老是發(fā)生長期骨髓抑制的主要原因之一。HSCs衰老與端?？s短、DNA損傷和ROS升高有關(guān)，其中受到輻射和藥物作用后HSCs中ROS持續(xù)升高可能是HSC衰老重要分子機(jī)制。二甲雙胍廣泛應(yīng)用的II型糖尿病治療藥物，可以激活 LKBI-AMPK (AMP-activated protein kinase)等信號通路，包括后續(xù)的 ACC (acetyl-CoAcarboxylase),繼而抑制肝臟的糖異生(hepatic gluconeogenesis),促進(jìn)脂肪酸氧化，改善胰島素敏感性，降低血糖水平。近年來研究發(fā)現(xiàn)有抗衰老的作用以及腫瘤防治作用，其中抗氧化作用可能是重要的分子機(jī)制，直接或者間接通過調(diào)節(jié)主要由NADPH氧化酶產(chǎn)生的超氧陰離子的量來清除細(xì)胞內(nèi)的R0S。另外二甲雙胍可以通過LKB1-AMPK通路抑制哺乳動物的雷帕霉素祀(mammalian target of rapamycin,mT0R),進(jìn)而發(fā)揮抑制細(xì)胞衰老和防治腫瘤作用。根據(jù)二甲雙胍作用的分子機(jī)制，發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)了二甲雙胍對放和/或化療藥物引起的造血免疫細(xì)胞損傷起保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用，同時(shí)本發(fā)明利用Y射線全身照射、環(huán)磷酰胺、順鉬腹腔注射制備放療和/或化療損傷小鼠模型，二甲雙胍對照射引起和/或化療藥物引起的造血免疫細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，降低造血干細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，本發(fā)明將放化療損傷的研究引入了更深的層次，從而更快地促進(jìn)了放化療損傷方面的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種二甲雙胍在制備對放療和/或化療藥物引起的造血免疫細(xì)胞損傷起保護(hù)作用的藥物中的新用途。本發(fā)明的另一目的是提供一種利用二甲雙胍降低放療和/或化療損傷的小鼠模型及其構(gòu)建方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種二甲雙胍在制備對放療和/或化療藥物引起的造血免疫細(xì)胞損傷起保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用；作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是，二甲雙胍在制備對放療引起的長期骨髓抑制起保護(hù) 作用的藥物中的應(yīng)用；所涉及的放療如137Cs源Y射線照射。作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是，二甲雙胍在制備對化療藥物引起的長期骨髓抑制起保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用；所涉及的化療藥物如卡鉬、馬利蘭(busulfan，BU)、卡氮芥(BCNU)。上述所涉及的應(yīng)用中，其特征在于將治療有效量的二甲雙胍與藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑混合制成組合物；所述的藥用載體或賦形劑是一種或多種固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥用制品輔劑等。本發(fā)明還提供了一種利用二甲雙胍降低放療和/或化療損傷的小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟針對放療和/或化療損傷的小鼠進(jìn)行二甲雙胍灌胃給藥，給藥量二甲雙胍 125mg/kg-500mg/kg(最優(yōu)為 250mg/kg)，每天一次。具體地，本發(fā)明還提供了一種降低放療損傷的小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟照射前24h對C57BL/6小鼠開始灌胃給藥，給藥量二甲雙胍125mg/kg-500mg/kg (最優(yōu)為250mg/kg)，給予小鼠I次137Cs源Y射線全身照射，劑量4Gy，劑量率O. 76Gy/min,照射后繼續(xù)灌胃給藥，給藥量二甲雙胍125mg/kg-500mg/kg(最優(yōu)為250mg/kg),每天一次,照射后繼續(xù)灌胃給藥持續(xù)7天，即得降低放療損傷的小鼠模型。本發(fā)明還提供了應(yīng)用上述方法構(gòu)建的降低放療損傷的小鼠模型，該模型應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。具體地，本發(fā)明還提供了一種利用二甲雙胍降低化療損傷的小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟對ICR小鼠進(jìn)行二甲雙胍250mg/kg灌胃給藥，每日一次，共10次，對ICR小鼠腹腔注射順鉬或環(huán)磷酰胺，順鉬lmg/kg，每日一次，從第二天開始給藥，共給藥7次；環(huán)磷酰胺50mg/kg，第2天、5天、8天腹腔注射給藥，即得降低化療損傷的小鼠模型。本發(fā)明還提供了應(yīng)用上述方法構(gòu)建的降低化療損傷的小鼠模型，該模型應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明所具有的有益效果本發(fā)明驗(yàn)證了二甲雙胍對照射引起和/或化療藥物引起的造血免疫細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，降低造血干細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，本發(fā)明將放療和/或化療損傷的研究引入了更深的層次，從而更快地促進(jìn)了放療和/或化療損傷方面的研究。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I
一種降低放療損傷的小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟照射前24h對C57BL/6小鼠開始灌胃給藥，給藥量二甲雙胍250mg/kg，給予小鼠I次137Cs源Y射線全身照射，劑量4Gy，劑量率O. 76Gy/min,照射后繼續(xù)灌胃給藥，給藥量二甲雙胍250mg/kg，每天一次，照射后繼續(xù)灌胃給藥持續(xù)7天，不同時(shí)間檢測小鼠外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞分型、免疫臟器指數(shù)、脾結(jié)節(jié)形成計(jì)數(shù)、骨髓造血祖細(xì)胞和干細(xì)胞功能等指標(biāo)。實(shí)施例2一種降低化療損傷的小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟對ICR小鼠進(jìn)行二甲雙胍250mg/kg灌胃給藥，每日一次，共10次，對ICR小鼠腹腔注射順鉬，順鉬lmg/kg，每日一次，從第二天開始給藥，共給藥7次；不同時(shí)間檢測小鼠外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞分型、免疫臟器指數(shù)、脾結(jié)節(jié)形成計(jì)數(shù)、骨髓造血祖細(xì)胞和干細(xì)胞 功能等指標(biāo)。實(shí)施例3一種降低化療損傷的小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟對ICR小鼠進(jìn)行二甲雙胍250mg/kg灌胃給藥，每日一次，共10次，對ICR小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，環(huán)磷酰胺50mg/kg，第2天、5天、8天腹腔注射給藥，不同時(shí)間檢測小鼠外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞分型、免疫臟器指數(shù)、脾結(jié)節(jié)形成計(jì)數(shù)、骨髓造血祖細(xì)胞和干細(xì)胞功能等指標(biāo)。下面通過具體的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證二甲雙胍對放化療引起的造血免疫損傷的保護(hù)作用。I)、實(shí)驗(yàn)動物C57BL/6雄性小鼠(SPF級)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，合格證號[SCXK (京)2005-0013]，體重 20. 0-22. Og,周齡 8-12。包括 C57BL/6-Ly5. I 為實(shí)驗(yàn)小鼠，C57BL/6-Ly5. 2為競爭移植實(shí)驗(yàn)受體小鼠，C57BL/6_Ly5. 1/2為競爭移植實(shí)驗(yàn)競爭小鼠。2)、全身照射實(shí)驗(yàn)小鼠(C57BL/6)分組后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給藥。照射組和給藥組I次137Cs源Y射線全身照射(TBI),照射源為Cammacel 1-40 (Atomic Energy,加拿大)，劑量率O. 76Gy/min,Control組(對照組)小鼠接受假照射。3)、藥物配制及給藥二甲雙胍(Metformin),粉劑，分析純。生產(chǎn)廠家碧云天進(jìn)口分裝，產(chǎn)品號S1741。用無菌雙蒸水配制到相應(yīng)藥物濃度，灌胃給藥，O. 4ml/只。注射用環(huán)磷酰胺，O. 2g/瓶；江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H32020857 ;產(chǎn)品批號11081421。使用時(shí)用注射用生理鹽水配制。注射用順鉬，IOmg/支；齊魯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20023460 ;產(chǎn)品批號106019108。使用時(shí)用注射用生理鹽水配制。4)、骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離無菌取小鼠股骨，含2% FCS的Hunks液沖洗骨髓，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液離心分離，制備單個(gè)核細(xì)胞懸液，洗滌，計(jì)數(shù)調(diào)整所需的細(xì)胞濃度后待用。5)、集落(克隆)形成(CFU-GM)試驗(yàn)分裝甲基纖維素培養(yǎng)基M3534 (Stemcell Technology), -20°C保存。用前置于2-8°C冰箱內(nèi)或室溫下融化；分離小鼠骨髓細(xì)胞，胎盤藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度加入M3534，振蕩器充分混勻，靜置待氣泡消失，用3ml注射器連接16#平頭注射器針頭，加入24孔板放入濕盒，置入37°C ,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天。從培養(yǎng)第5天開始在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。低倍觀察集落形成情況，細(xì)胞數(shù)^ 30為陽性集落，集落形成率以每IO5個(gè)細(xì)胞形成的集落數(shù)表示。6)、外周血免疫細(xì)胞分型測定每只小鼠眼內(nèi)眥取血，K3EDTA抗凝。外周血取50 μ 1，加入Iml O. 83%的NH4Cl裂解液，室溫lOmin，離心5min(400g)，棄上清，PBS洗滌；加入造血細(xì)胞分型抗體，室溫孵育15分鐘，加入400 μ I PBS終止，過濾后轉(zhuǎn)入流式測定管進(jìn)行流式分析(LSRII，BDBioscience)。
7)、造血干細(xì)胞(LirTc-kit+Scal+，HSC)、造血祖細(xì)胞(LirTc-kit+Scar，HPCs)分型檢測LirTBMCs分離把骨髓單個(gè)核細(xì)胞濃度調(diào)整為I X 107/mL,按體積比I : 100加入系標(biāo)記陽性抗體(eBioscience)B220(B淋巴細(xì)胞)，Ter-119 (T淋巴細(xì)胞)，CD3e(T淋巴細(xì)胞)，Gr-I和Mac-I (髓系細(xì)胞)的混合液，置于4°C，反應(yīng)30min ;含2% FBS的HBSS溶液洗滌后用原體積懸起細(xì)胞。按I X IO8細(xì)胞加入ImL羊抗鼠免疫球蛋白磁珠(DynabeadsSheep anti-Rat IgG, Invitrogen)使磁珠與細(xì)胞比在4 :1,充分混勻，4°C, 30min。分離獲得LirT細(xì)胞。調(diào)Lin-細(xì)胞濃度為5X 106，然后按I :100加入抗體Sca-I和c-Kit冰上避光孵育30min，洗滌后，重懸。流式細(xì)胞儀收取細(xì)胞檢測分析(BD公司Aria FACS II，SanJose, CA)。8)、小鼠脾結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)處死小鼠后,剝離脾臟,置入過飽和苦味酸固定染色。6h后雙盲法在放大鏡下進(jìn)行小鼠自發(fā)性脾結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)。9)、骨髓競爭性抑制試驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)組小鼠(供體小鼠，C57BL/6-Ly-5. 2)收集BMCs，與正常C57BL/6_Ly-5. I小鼠的BM-MNCs混合，比例是5 I，經(jīng)外眥靜脈竇注入接收致死劑量照射(9. OGy，TBI)的受體小鼠(C57BL/6-Ly-5. 1/5. 2)體內(nèi)。接種后2個(gè)月，從小鼠內(nèi)眥靜脈竇取50 μ L外周血，裂解紅細(xì)胞，加入抗體 FITC-CD45. 1(1 200)、ΡΕ_45· 2 (I 200)、PerCP_B220 (I 100)、PE/Cy7-CDllb(l 100)、APC-CD3 (I 200)、PE/CY7_Ly6G/Gr_l (I 200)，冰上避光孵育30min。使用流式細(xì)胞儀檢測，分析供體小鼠造血細(xì)胞比例。10)、鶴卵石造血區(qū)形成細(xì)胞(cobblestone area-forming cell, CAFC)CAFC第4、第5周結(jié)果是體外反映造血干細(xì)胞增殖功能的檢測分析方法。在96孔板內(nèi)預(yù)先使用小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁形成滋養(yǎng)層，然后待測小鼠骨髓細(xì)胞按不同的稀釋度接種骨髓細(xì)胞。濃度為每孔81000/27000/9000/3000/1000/333。每個(gè)濃度組接種20孔、放置于33°C，5% CO2培養(yǎng)5周。每周半量換液(含10% FBS，5%馬血清，氫化可的松，2-巰基乙醇的MDM培養(yǎng)基)。在培養(yǎng)的第2周和第5周讀每個(gè)濃度20孔Cobblestone area陽性孔的個(gè)數(shù)。Cobblestone area定義為在倒置顯微鏡視野內(nèi)，位于基質(zhì)細(xì)胞下,至少由5個(gè)無折光性的細(xì)胞組成的區(qū)域。讀取的結(jié)果使用L-Cal軟件通過Poisson statistics計(jì)算第4周每IO5個(gè) BM-MNCs 內(nèi) CAFC 數(shù)。實(shí)施例4 :不同劑量二甲雙胍對造血免疫系統(tǒng)輻射損傷的保護(hù)作用C57BL/6小鼠按體重隨機(jī)分為對照組、照射組(4Gy)、照射組+給藥組(下述簡稱給藥組)；給藥組分為低劑量組(二甲雙胍125mg/kg)、中劑量組(二甲雙胍250mg/kg)、高劑量組(二甲雙胍500mg/kg)。照射前24h開始灌胃給藥，全身照射，照射后第15d取材進(jìn)行造血免疫細(xì)胞學(xué)指標(biāo)檢測。包括外周血和骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓粒-巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)和免疫臟器指數(shù)。外周血計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠比較，照射組小鼠外周血白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)明顯降低(p〈0.01)。給藥組與照射組比較有升高趨勢，尤其是中劑量組趨勢比較明顯。結(jié)果見表I. I。表I. I 二甲雙胍對受照小鼠外周血損傷保護(hù)作用觀察·
IISJ II WBC (KlO9ZL)RBC (xlO,2/L)Plat (xlO^/L)
對照組 47.22 士〗.0210.0±0.431290±173
照射組 41.75士0.34 爾9.72±0.76969±214**
低麵量81 51.7牡0.469,58±0.31789±100
中麵！Λ 42.30土 0.5410.0 土0.581058±167
高麵量組 41.86 士0.349.62±0.61887±87林表示照射組與對照組比較ρ〈0· 01，林*表示照射組與對照組比較ρ〈0· 001。#表示給藥組與照射組比較ρ〈0· 05。與對照組比較，照射組小鼠單側(cè)股骨骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)沒有顯著差異；檢測反映造血祖細(xì)胞增殖功能的指標(biāo)CFU-GM，顯示照射組CFU-GM明顯下降(ρ〈0. 01) ;二甲雙胍給藥組與照射組比較CFU-GM升高，中劑量組和高劑量組與照射組CFU-GM比較，差異有顯著性(ρ〈0· 01，ρ<0. 05)，結(jié)果見表 I. 2。表I. 2 二甲雙胍對受照小鼠骨髓細(xì)胞損傷保護(hù)作用觀察
組別nBMMNC (/股骨)CFU-GM (/IO5)
對 Ilfi428.6±2.39223.5±62.5
424.6±2.84117.0+37.0***
524.7士4.05152.0±il.0
中割 Ilffl426.6±3.50176.0H8.55##
15劑:Itli524.5 土1.06164.0±21.05#照射組與對照組比較，***p<0. 001 ;給藥組與照射組比較#ρ<0· 05，##ρ<0. 01。
觀察藥物受照小鼠免疫臟器的損傷的作用，剝離實(shí)驗(yàn)小鼠胸腺和脾臟，稱重后計(jì)算免疫臟器指數(shù)(臟器重(mg)/體重(g))。結(jié)果可見，給藥組對胸腺組織損傷有一定的保護(hù)作用。結(jié)果見表I. 3。表I. 3 二甲雙胍對受照小鼠免疫器官損傷保護(hù)作用觀察
權(quán)利要求
1.一種二甲雙胍在制備對放療和/或化療藥物引起的造血免疫細(xì)胞損傷起保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于二甲雙胍在制備對放療引起的長期骨髓抑制起保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于二甲雙胍在制備對化療藥物引起的長期骨髓抑制起保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于將治療有效量的二甲雙胍與藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑混合制成組合物。
5.一種利用二甲雙胍降低放療和/或化療損傷的小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟針對放療和/或化療損傷的小鼠進(jìn)行二甲雙胍灌胃給藥，給藥量二甲雙胍125mg/kg-500mg/kg(最優(yōu)為 250mg/kg),每天一次。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法,其特征在于一種降低放療損傷的小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟照射前24h對C57BL/6小鼠開始灌胃給藥，給藥量二甲雙胍125mg/kg-500mg/kg(最優(yōu)為250mg/kg),給予小鼠I次137Cs源、射線全身照射，劑量4Gy,劑量率O. 76Gy/min,照射后繼續(xù)灌胃給藥，給藥量二甲雙胍125mg/kg-500mg/kg (最優(yōu)為250mg/kg)，每天一次，照射后繼續(xù)灌胃給藥持續(xù)7天，即得降低放療損傷的小鼠模型。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于一種利用二甲雙胍降低化療損傷的小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟對ICR小鼠進(jìn)行二甲雙胍250mg/kg灌胃給藥，每日一次，共10次，對ICR小鼠腹腔注射順鉬或環(huán)磷酰胺，順鉬lmg/kg，每日一次，從第二天開始給藥，共給藥7次；環(huán)磷酰胺50mg/kg,第2天、5天、8天腹腔注射給藥，即得降低化療損傷的小鼠模型。
全文摘要
本發(fā)明涉及二甲雙胍在對放化療損傷起保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用，作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是，二甲雙胍在制備對放療引起的長期骨髓抑制起保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用；作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是，二甲雙胍在制備對化療藥物引起的長期骨髓抑制起保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明驗(yàn)證了二甲雙胍對照射引起和/或化療藥物引起的造血免疫細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。
文檔編號A61K31/155GK102871991SQ20121041203
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者孟愛民, 許國順, 吳紅英, 王月英, 李德冠, 王小春, 張恒, 路璐, 李程程, 王營營 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所