專(zhuān)利名稱(chēng)：一種多糖－蛋白結(jié)合疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌莢膜多糖與蛋白結(jié)合的疫苗制劑，特別是一種A群、C群流行性腦脊髓膜炎莢膜多糖-蛋白結(jié)合疫苗和流感嗜血桿菌多糖-蛋白結(jié)合疫苗。
流腦是一種人類(lèi)常見(jiàn)的傳染性疾病，只感染人類(lèi)。人與人之間通過(guò)飛沫或分泌物直接傳染，通常情況下，這種接觸使對(duì)方成為一個(gè)健康帶菌者，根據(jù)年齡和環(huán)境的不同，10-50％的人可成為帶菌者。在人體抵抗力下降及特定環(huán)境影響下，奈瑟氏腦膜炎球菌可以侵入血流，繼而發(fā)病，通常發(fā)生在接觸該菌后的一周內(nèi)。該病來(lái)勢(shì)非常兇猛，伴有嚴(yán)重腦膜感染的綜合癥狀，嚴(yán)重的全身癥狀主要有敗血癥、休克、出血、紫癜、彌散性血管內(nèi)凝血或內(nèi)臟出血，病死率較高，盡管抗生素有較好的治療效果，病死率仍維持在5-10％之間。
腦膜炎奈瑟氏菌是引起流行性腦脊髓膜炎(以下簡(jiǎn)稱(chēng)流腦)的病原菌，根據(jù)其莢膜多糖的特異性可將腦膜炎奈瑟氏菌分成A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y和Z 13個(gè)血清群，所有血清群的細(xì)菌均可致病，但A、B、C、Y和W135毒力最強(qiáng)，上述5個(gè)血清群占病例數(shù)的95％以上，其中A群、C群傳染性最強(qiáng)，是引起流腦流行最常見(jiàn)的菌株。
A群流行性腦脊髓膜炎球菌莢膜多糖疫苗是第一個(gè)用于預(yù)防A群流行性腦脊髓膜炎球菌感染的疫苗，應(yīng)用以后，使A群流行性腦脊髓膜炎的發(fā)病率及病死率得以大幅度的降低。
受A群流腦多糖疫苗的啟示，相繼研制出了C群、Y群、以及W135群流腦多糖單價(jià)疫苗以及含A、C、Y、W135四種流腦多糖成分的聯(lián)合疫苗。由于各國(guó)均以A群流腦、C群流腦流行為主，因此，目前各國(guó)使用的疫苗主要為A群流腦多糖疫苗、C群流腦多糖疫苗等。
B型流感嗜血桿菌(Hib)是引起兒童細(xì)菌性腦炎、肺炎、蜂窩組織炎等疾病的主要病原體，在使用有效的疫苗前，美國(guó)每年有16000～25000多名兒童因Hib引起感染。其中60％的兒童患上最嚴(yán)重的Hib感染并發(fā)癥——細(xì)菌性腦炎。其中10％因腦炎致死，許多幸存者則造成嚴(yán)重的永久性功能喪失。其他感染包括菌血癥、肺炎、膿胸、心包炎、蜂窩組織炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎及會(huì)咽炎等。1988～1991年期間，最初獲準(zhǔn)對(duì)大嬰幼兒進(jìn)行Hib結(jié)合疫苗接種，以后又獲準(zhǔn)對(duì)小嬰幼兒進(jìn)行接種，使Hib侵襲性疾病及相關(guān)的發(fā)病率及死亡率明顯減少。過(guò)去幾年里，Hib疾病患病人數(shù)降低了95％，美國(guó)疾病控制及預(yù)防中心將5歲以下兒童的Hib疾病作為一種可采用疫苗加以控制的疾病，并計(jì)劃1996年消除；到1997年7月，該目標(biāo)已接近實(shí)現(xiàn)但尚未完全達(dá)到。值得說(shuō)明的是，在對(duì)18個(gè)月以下兒童廣泛使用疫苗前，Hib疾病發(fā)病率已開(kāi)始下降。其可能是由于Hib結(jié)合疫苗降低了較大兒童的無(wú)癥狀攜帶率，而導(dǎo)致了18個(gè)月以下兒童的感染風(fēng)險(xiǎn)降低。這種“群體免疫”作用所達(dá)到的效果是使用疫苗前未預(yù)料到的，Hib結(jié)合疫苗的成功免疫，為研究及預(yù)防由其他含多糖莢膜的細(xì)菌引起的感染提供了可借鑒的經(jīng)驗(yàn)。
Hib及其他莢膜細(xì)菌的莢膜多糖抗原是其毒力的重要決定因素，因此其一直是疫苗研制的標(biāo)靶。已知這些多糖的特異性抗體可使機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用抵抗疾病侵襲。盡管多糖抗原在嬰兒中通常沒(méi)有免疫原性，但當(dāng)其與載體蛋白共價(jià)結(jié)合時(shí)，則免疫原性明顯增強(qiáng)。多糖蛋白結(jié)合物可為機(jī)體對(duì)多糖的免疫應(yīng)答提供T細(xì)胞介導(dǎo)的途徑，從而影響了結(jié)合疫苗再免疫后產(chǎn)生的抗體的數(shù)量和類(lèi)型。近年來(lái)，這種結(jié)合疫苗已廣泛用于嬰兒免疫以預(yù)防Hib侵襲性疾病。
細(xì)菌多糖屬T細(xì)胞非依賴(lài)性抗原，具有以下特點(diǎn)(1)在幼小動(dòng)物或嬰幼兒體內(nèi)只能產(chǎn)生微弱的免疫反應(yīng)，甚至不產(chǎn)生免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)隨年齡的增長(zhǎng)而增強(qiáng)；(2)產(chǎn)生低親和力的抗體，主要為IgM和少量的IgG抗體；(3)只產(chǎn)生短暫的免疫反應(yīng)，不具備反復(fù)接種時(shí)的免疫記憶和免疫增強(qiáng)效應(yīng)；(4)容易產(chǎn)生免疫耐受；(5)普通的佐劑對(duì)這種抗原不易起到免疫增強(qiáng)作用。
2歲以下的嬰幼兒胸腺發(fā)育不成熟，對(duì)多糖抗原的反應(yīng)性較差，多糖進(jìn)入機(jī)體后不能被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識(shí)別，不能產(chǎn)生有效的抗體，因此對(duì)2歲以下的兒童注射多糖疫苗不能產(chǎn)生保護(hù)性抗體。
為了增強(qiáng)細(xì)菌多糖疫苗刺激機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的能力，Goebel和Avery早于1929年就首次成功地用化學(xué)方法將肺炎球菌的第3型莢膜多糖共價(jià)結(jié)合至蛋白質(zhì)載體上去制備多糖—蛋白質(zhì)結(jié)合疫苗。這種結(jié)合疫苗能大大增強(qiáng)家兔對(duì)多糖抗原的免疫反應(yīng)。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)載體將T細(xì)胞非依賴(lài)性的多糖抗原轉(zhuǎn)變成T細(xì)胞依賴(lài)性抗原，從而能啟動(dòng)T輔助淋巴細(xì)胞產(chǎn)生一系列的免疫增強(qiáng)效應(yīng)。
鑒于2歲以下兒童對(duì)多糖免疫接種無(wú)反應(yīng)的事實(shí)，為了保護(hù)此年齡段的兒童免受感染，可將流腦多糖抗原偶聯(lián)到載體蛋白上，改變抗原的提呈方式，刺激機(jī)體對(duì)多糖產(chǎn)生有效的保護(hù)性抗體，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明此舉大大地增強(qiáng)了多糖的免疫原性，人體臨床觀察表明，用此種多糖-蛋白結(jié)合疫苗免疫3月齡的嬰兒，可以產(chǎn)生有效的免疫。1987年，世界上第一個(gè)多糖蛋白結(jié)合疫苗——B型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗(Hib)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)。
作為結(jié)合疫苗的載體，必須選擇安全有效的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)必須對(duì)人體沒(méi)有毒性，也不會(huì)引起變態(tài)反應(yīng)，同時(shí)又能增強(qiáng)多糖的免疫原性，因此可供選擇的種類(lèi)并不多。目前使用的載體主要為微生物來(lái)源的蛋白質(zhì)，例如現(xiàn)成的白喉和破傷風(fēng)類(lèi)毒素疫苗，經(jīng)基因突變發(fā)生減毒的白喉毒素以及細(xì)菌的外膜蛋白質(zhì)等，而且已經(jīng)用于臨床。蛋白質(zhì)載體也可以源于與多糖同一菌種的致病菌，例如B型嗜血流感桿菌多糖偶聯(lián)疫苗可以用該菌的外膜蛋白質(zhì)作為載體；肺炎球菌多糖偶聯(lián)疫苗可以用肺炎的溶血素蛋白質(zhì)作為載體，其優(yōu)點(diǎn)是能具有對(duì)不同型別的肺炎球菌感染有交叉免疫保護(hù)效果。還有一些細(xì)菌的毒素蛋白質(zhì)也可作為載體，例如霍亂毒素、霍亂毒素的B亞單位和大腸桿菌的不耐熱腸毒素，因?yàn)樗鼈兙哂凶魟┑男?yīng)。另外還有綠膿桿菌的外毒素A、P6和一些高分子外膜蛋白質(zhì)，以及不相關(guān)的蛋白質(zhì)，如人血清蛋白等，但是這些蛋白質(zhì)載體仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，尚未用于臨床。
至今已經(jīng)研制成功多種不同的單價(jià)細(xì)菌多糖—蛋白結(jié)合疫苗。結(jié)合疫苗具有以下一些特點(diǎn)。(1)能增強(qiáng)嬰幼兒對(duì)細(xì)菌多糖的免疫反應(yīng)。由于結(jié)合疫苗能激活T輔助性淋巴細(xì)胞和形成T記憶細(xì)胞，重復(fù)接種能產(chǎn)生記憶性免疫增強(qiáng)作用，使主要為IgG的抗細(xì)菌多糖抗原的抗體水平劇增，對(duì)嬰幼兒接種后能產(chǎn)生較為持久的免疫保護(hù)力。(2)細(xì)菌的多糖—蛋白質(zhì)結(jié)合疫苗可成為二價(jià)疫苗。這是因?yàn)榻Y(jié)合疫苗可同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)多糖和蛋白質(zhì)載體的抗體反應(yīng)(3)能增強(qiáng)老年人和某些免疫功能低下或有缺陷的病人對(duì)細(xì)菌多糖抗原的免疫反應(yīng)。老年人的免疫功能隨年齡的增大而下降，因此對(duì)細(xì)菌多糖的免疫應(yīng)答能力很差。例如肺炎是老年人的常見(jiàn)病，肺炎多糖和蛋白質(zhì)的結(jié)合疫苗就可以增強(qiáng)疫苗對(duì)老年人的免疫保護(hù)力。也有報(bào)道免疫功能低下的艾滋病患者對(duì)結(jié)合疫苗產(chǎn)生的抗體反應(yīng)要遠(yuǎn)勝于多糖疫苗。結(jié)合疫苗也可使一些缺乏對(duì)細(xì)菌多糖抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的個(gè)體產(chǎn)生高效價(jià)的抗多糖抗原的抗體。(4)結(jié)合疫苗具有載體蛋白質(zhì)的效應(yīng)。事先或同時(shí)接種蛋白質(zhì)載體會(huì)刺激T淋巴細(xì)胞的增殖，因而能增強(qiáng)結(jié)合疫苗的免疫原性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到，給預(yù)先接種過(guò)破傷風(fēng)類(lèi)毒素的動(dòng)物注射B型嗜血流感桿菌多糖和破傷風(fēng)類(lèi)毒素結(jié)合疫苗，只需要接種一次就能使動(dòng)物產(chǎn)生達(dá)到免疫保護(hù)水平的抗B型嗜血流感桿菌多糖的抗體。此外，如果將兩種混合接種，也能增強(qiáng)對(duì)疫苗多糖抗原的免疫反應(yīng)。但是，如果先接種多糖結(jié)合疫苗，再接種破傷風(fēng)類(lèi)毒素，僅見(jiàn)破傷風(fēng)類(lèi)毒素抗體反應(yīng)的增強(qiáng)，對(duì)疫苗多糖抗原的免疫原性卻沒(méi)有什么增強(qiáng)作用。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，其中的蛋白載體為破傷風(fēng)類(lèi)毒素、白喉類(lèi)毒素、人血清免疫球蛋白、B群流行性腦脊髓膜炎球菌外膜蛋白等。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，其中多糖與蛋白載體的結(jié)合是以多糖用溴化氰或硼氰酸鈉活化，然后與己二酰肼或其他同功能的化合物反應(yīng)，在碳二亞胺的作用下與蛋白載體共價(jià)結(jié)合的。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，其特征在于，還可含有氫氧化鋁或磷酸鋁作為鋁佐劑，加入量為0.25～1.5mg鋁佐劑/劑量。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，其特征在于，還可含有其他已知的可提高機(jī)體免疫的人體、植物或微生物蛋白質(zhì)、多糖、磷脂或小分子化合物。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑是注射劑，可皮下或肌肉注射。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，可與其他含鋁佐劑的蛋白類(lèi)疫苗(如DTP，乙型肝炎疫苗)聯(lián)合使用。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，可與其他含鋁佐劑的疫苗(如DTP，乙型肝炎疫苗、滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、滅活日本腦炎病毒疫苗)聯(lián)合組成多價(jià)疫苗。
本發(fā)明的疫苗可用于免疫3月齡以上各年齡段的兒童，預(yù)防兒童罹患A、C群流行性腦脊髓膜炎球菌、b型流感嗜血桿菌引起的感染性疾病。它的特點(diǎn)是既能增強(qiáng)多糖抗原的免疫原性，又能減少嬰幼兒接種疫苗的次數(shù)，減輕嬰幼兒的痛苦和家長(zhǎng)的精神負(fù)擔(dān)。降低免疫接種成本，提高免疫覆蓋率。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，以破傷風(fēng)類(lèi)毒素、白喉類(lèi)毒素作為流腦多糖的載體蛋白免疫兒童，可喚起免疫系統(tǒng)對(duì)破傷風(fēng)類(lèi)毒素、白喉類(lèi)毒素的回憶反應(yīng)，從而得到較好的對(duì)流腦多糖的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，以人血清IgG作為載體蛋白制備的結(jié)合疫苗，其所含的蛋白載體——IgG的Fc片段可與人體內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，使其主動(dòng)吞噬并處理抗原，增強(qiáng)多糖抗原的免疫原性。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，可通過(guò)以下制備工藝制備。
選用A群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、C群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、B型流感嗜血桿菌菌種生產(chǎn)A群腦膜炎奈瑟氏球菌多糖、C群腦膜炎奈瑟氏球菌多糖、B型流感嗜血桿菌多糖。精制破傷風(fēng)類(lèi)毒素系用破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌菌種，在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生的毒素經(jīng)甲醛脫毒、精制而成；人血清IgG系市售的靜脈注射用生物制劑。在碳二亞胺的作用下將已活化的流腦多糖與載體蛋白通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，形成多糖—蛋白結(jié)合疫苗。A群流行性腦膜炎球菌多糖、C群流行性腦膜炎球菌多糖、B型流感嗜血桿菌多糖分別與蛋白結(jié)合，制備各自的多糖—蛋白結(jié)合疫苗原液，按一定比例將三者混合制備多糖—蛋白結(jié)合疫苗。加入氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑后即為含鋁佐劑的疫苗。
在適宜的培養(yǎng)基中接種菌種后，于對(duì)數(shù)生產(chǎn)期后或靜止期前期收獲。將培養(yǎng)物加入甲醛溶液殺菌或加熱殺菌，以確保殺菌安全并不損傷菌體多糖為宜。將已殺菌的單一收獲物(或合并收獲物)離心去菌體，收集上清液，于其中加入十六烷基三甲基溴化銨混勻，離心收集沉淀物。沉淀物中加入氯化鈣溶液，使最終濃度為1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至最終濃度為25％(V/V)。0～10℃靜置3小時(shí)以上，離心去沉淀，收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷卻乙醇至最終濃度為80％(v/v)，充分振搖。離心收集沉淀，然后用無(wú)水乙醇及丙酮各洗2次以上，將沉淀物(多糖粗制品)保存在-20℃以下待進(jìn)行一步提取。將粗制品溶解于中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)10～20mg/ml，然后按1∶2體積用冷酚提取2～3次，離心收集上清液，并用0.1mol/L氯化鈣溶液或適宜溶液透析。必要時(shí)可用其它方法去除內(nèi)毒素。再加乙醇至最終濃度為75％～80％(v/v)。離心收集沉淀物，用無(wú)水乙醇及丙酮各洗2次以上。離心后傾去上清液，用注射用水溶解沉淀的多糖，所得溶液即為提取的多糖原液。原液經(jīng)截留分子量為100KD的超濾器過(guò)濾，除去分子量小于100KD的多糖分子，超濾后的多糖溶液經(jīng)除菌過(guò)濾后，取樣進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)及各項(xiàng)生化測(cè)定。提取過(guò)程應(yīng)在15℃以下進(jìn)行。純化后的多糖應(yīng)保存在-20℃或以下，待下一步與蛋白偶聯(lián)。(二)精制破傷風(fēng)類(lèi)毒素(TT)系用破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌菌種，在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生的毒素經(jīng)甲醛脫毒、精制而成。按2000年版《中國(guó)生物制品規(guī)程》吸附破傷風(fēng)類(lèi)毒素疫苗制造及檢定規(guī)程的3.1項(xiàng)進(jìn)行檢定，檢定合格后方可用于下一步與多糖抗原的偶聯(lián)。(三)多糖與破傷風(fēng)類(lèi)毒素偶聯(lián)1.活化多糖取A群(或C群)流腦(或Hib)多糖100mg(4mg/ml，25m1)，用0.5M NaOH調(diào)pH至10.8，加入50mg溴化氰，用0.5M NaOH維持pH在10.8±0.5左右1小時(shí)(22℃)。然后用0.5M HCl調(diào)pH至8.8，加入350mg己二酰肼(ADH)，反應(yīng)6分鐘；用0.5M NaOH調(diào)pH至8.5，維持pH在8.5±0.5的范圍內(nèi)15分鐘；4～8℃輕輕攪拌12小時(shí)。用預(yù)冷0.05M NaCl溶液透析48小時(shí)(4～8℃)，在此期間換液5次(或用100KD的超濾膜超濾)。用0.45μm濾膜過(guò)濾活化多糖-ADH衍生物。2.活化多糖與破傷風(fēng)類(lèi)毒素(TT)偶聯(lián)(4～8℃冰水浴下操作)將破傷風(fēng)類(lèi)毒素溶液的蛋白濃度調(diào)整為4mg/ml，取25ml加入到已活化的多糖-ADH衍生物溶液中，充分混勻后，用0.5M HCl調(diào)pH至5.7。加碳二亞胺(EDAC)1000mg，滴加鹽酸維持溶液的pH在5.7±0.2范圍內(nèi)90分鐘；用0.5MNaOH調(diào)pH至6.8，用預(yù)冷0.2M NaCl溶液透析12小時(shí)(4～8℃，或用截流分子量為300KD的濾膜超濾)，除去碳二亞胺(EDAC)及低分子物質(zhì)。(四)多糖-蛋白結(jié)合物純化(4～8℃條件)將多糖—蛋白結(jié)合物溶液超濾濃縮為20ml，經(jīng)Sephacryl S-400HR(或Sephacryl S-1000、Sepharose CL-4B、Sepharose 4 FF、TSK Toyopearl-65等)層析柱(2.6×100cm)純化，以0.2M NaCl流洗，流速為1.5ml/分鐘，以206nm/280nm波長(zhǎng)的在線式紫外檢測(cè)器檢測(cè)流出液的吸光值變化，收集V0附近的洗脫峰，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后即為多糖-蛋白結(jié)合疫苗原液。(五)氫氧化鋁佐劑吸附A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗的制備將A群流腦多糖-TT結(jié)合疫苗原液、C群流腦多糖-TT結(jié)合疫苗原液、B型流感嗜血桿菌-TT結(jié)合疫苗原液分別稀釋至120μg/ml(按多糖計(jì)算)，將以上三種稀釋后的疫苗液各取10ml放于一100ml容量的三角燒瓶?jī)?nèi)，充分混合后，加入30ml氫氧化鋁佐劑(濃度為1.66mg/ml，按鋁離子計(jì)算)，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖各10μg的氫氧化鋁吸附多糖-TT結(jié)合疫苗。
動(dòng)物試驗(yàn)按上述方法制備氫氧化鋁吸附A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖-TT結(jié)合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖各20μg。加三倍體積的鋁稀釋劑稀釋后，即為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用疫苗，分別于0、14、21天皮下免疫SPF級(jí)BALB/C小鼠，免疫劑量為0.5ml(含每種多糖2.5μg)。分別于0、21、28天采集血液，分離血清，測(cè)定抗體滴度前將血清放置于-20℃。免疫動(dòng)物的同時(shí)設(shè)氫氧化鋁及生理鹽水對(duì)照組，以酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清抗體滴度。結(jié)果見(jiàn)表1。第2次免后1周小鼠血清抗體滴度顯著高于免前(p＜0.01)；第3次免后1周的抗體滴度顯著高于第2次免后1周的抗體滴度(p＜0.02)。(六)磷酸鋁佐劑吸附A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗的制備將A群流腦多糖-TT結(jié)合疫苗原液、C群流腦多糖-TT結(jié)合疫苗原液、B型流感嗜血桿菌-TT結(jié)合疫苗原液分別稀釋至120μg/ml(按多糖計(jì)算)，將以上三種稀釋后的疫苗液各取10ml放于一100ml容量的三角燒瓶?jī)?nèi)，，充分混合后，加入30ml磷酸鋁佐劑(濃度為1.66mg/ml，按鋁離子計(jì)算)，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖各10μg的磷酸鋁吸附多糖-TT結(jié)合疫苗。
動(dòng)物試驗(yàn)按上述方法制備氫氧化鋁吸附A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖-TT結(jié)合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖各20μg。加三倍體積的鋁稀釋劑稀釋后，即為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用疫苗，分別于0、14、21天皮下免疫SPF級(jí)BALB/C小鼠，免疫劑量為0.5ml(含每種多糖2.5μg)。分別于0、21、28天采集血液，分離血清，測(cè)定抗體滴度前將血清放置于-20℃。免疫動(dòng)物的同時(shí)設(shè)氫氧化鋁及生理鹽水對(duì)照組，以酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清抗體滴度。結(jié)果見(jiàn)表1。第2次免后1周小鼠血清抗體滴度顯著高于免前(p＜0.01)，第3次免后1周的抗體滴度顯著高于第2次免后1周的抗體滴度(p＜0.05)。(七)A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗的制備將A群流腦多糖-TT結(jié)合疫苗原液、C群流腦多糖-TT結(jié)合疫苗原液、B型流感嗜血桿菌-TT結(jié)合疫苗原液分別稀釋至60μg/ml(按多糖計(jì)算)，將以上三種稀釋后的疫苗液各取20ml放于一100ml容量的三角燒瓶?jī)?nèi)，充分混合后，按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖各10μg的多糖-TT結(jié)合疫苗。
動(dòng)物試驗(yàn)按上述方法制備A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖-TT結(jié)合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖各20μg。加三倍體積的稀釋劑稀釋后，即為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用疫苗，分別于0、14、21天皮下免疫SPF級(jí)BALB/C小鼠，免疫劑量為0.5ml(含每種多糖2.5μg)。分別于0、21、28天采集血液，分離血清，測(cè)定抗體滴度前將血清放置于-20℃。免疫動(dòng)物的同時(shí)設(shè)氫氧化鋁及生理鹽水對(duì)照組，以酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清抗體滴度。結(jié)果見(jiàn)表1。第2次免后1周小鼠血清抗體滴度顯著高于免前(p＜0.01)，第3次免后1周的抗體滴度除A群流腦多糖抗體滴度增加無(wú)顯著性外，C群流腦多糖抗體、Hib多糖抗體滴度均顯著高于第2次免后1周的抗體滴度(p＜0.01)。
表1、A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖-TT結(jié)合疫苗免疫BALB/C小鼠的血清抗體滴度*

*血清的起始稀釋度為1∶100，連續(xù)2倍稀釋?zhuān)罡呦♂尪葹?∶102400。免前血清、鋁佐劑、生理鹽水對(duì)照組血清的稀釋方法同其他試驗(yàn)組，1∶100陰性的，血清抗體滴度按1計(jì)算。免前血清、鋁佐劑、生理鹽水對(duì)照組血清的稀釋方法同其他試驗(yàn)組，1∶100陰性的，血清抗體滴度按1計(jì)算。實(shí)施例二A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖聯(lián)合疫苗將A群流腦多糖、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖分別稀釋為60μg/ml，各取25ml混合。按0.5ml/支的量分裝，即為含A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖各10μg/支的疫苗。
動(dòng)物試驗(yàn)按上述方法制備A+C群流腦多糖疫苗、B型流感嗜血桿菌多糖，每毫升疫苗含A群、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖各20μg。以3倍體積的生理鹽水稀釋后即為含A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖各5μg/ml的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用疫苗。分別于0、14、21天皮下免疫SPF級(jí)BALB/C小鼠，免疫劑量為0.5ml(含多糖2.5μg)。分別于0、21、28天采集血液，分離血清，測(cè)定抗體滴度前將血清放置于-20℃。免疫動(dòng)物的同時(shí)設(shè)只含A群流腦多糖、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖(5μg/ml)的單價(jià)疫苗對(duì)照組及生理鹽水對(duì)照組，以酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清抗體滴度。結(jié)果見(jiàn)表2。第2次免后1周小鼠血清抗體滴度顯著高于免前(p＜0.01)，加強(qiáng)免疫后不能使抗體滴度升高。
表2、多糖疫苗免疫BALB/c小鼠后的血清抗體滴度*

*抗A群流腦多糖、抗C群流腦多糖血清自1∶100開(kāi)始倍比稀釋?zhuān)豢笻ib多糖血清自1∶25開(kāi)始倍比稀釋。
動(dòng)物試驗(yàn)按上述方法制備氫氧化鋁吸附A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖-小鼠IgG結(jié)合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖各20μg。加三倍體積的鋁稀釋劑稀釋后，即為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用疫苗，分別于0、14、21天皮下免疫SPF級(jí)BALB/C小鼠，免疫劑量為0.5ml(含每種多糖2.5μg)。分別于0、21、28天采集血液，分離血清，測(cè)定抗體滴度前將血清放置于-20℃。免疫動(dòng)物的同時(shí)設(shè)氫氧化鋁及生理鹽水對(duì)照組，以酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清抗體滴度。結(jié)果見(jiàn)表3。第2次免后1周小鼠血清抗體滴度顯著高于免前(p＜0.01)，第3次免后1周的抗體滴度顯著高于第2次免后1周的抗體滴度(p＜0.02)。(四)磷酸鋁佐劑吸附A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖-小鼠IgG結(jié)合疫苗的制備將A群流腦多糖-小鼠IgG結(jié)合疫苗原液、C群流腦多糖-小鼠IgG結(jié)合疫苗原液、B型流感嗜血桿菌多糖-小鼠IgG結(jié)合疫苗原液分別稀釋至120μg/ml(按多糖計(jì)算)，將以上三種稀釋后的疫苗液各取10ml放于一100ml容量的三角燒瓶?jī)?nèi)，充分混合后，加入30ml磷酸鋁佐劑(濃度為1.66mg/ml，按鋁離子計(jì)算)，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖各10μg的磷酸鋁吸附多糖結(jié)合疫苗。
動(dòng)物試驗(yàn)按上述方法制備氫氧化鋁吸附A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖-小鼠IgG結(jié)合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖各20μg。加三倍體積的鋁稀釋劑稀釋后，即為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用疫苗，分別于0、14、21天皮下免疫SPF級(jí)BALB/C小鼠，免疫劑量為0.5ml(含每種多糖2.5μg)。分別于0、21、28天采集血液，分離血清，測(cè)定抗體滴度前將血清放置于-20℃。免疫動(dòng)物的同時(shí)設(shè)氫氧化鋁及生理鹽水對(duì)照組，以酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清抗體滴度。結(jié)果見(jiàn)表3。第2次免后1周小鼠血清抗體滴度顯著高于免前(p＜0.01)；第3次免后1周，抗體的滴度顯著高于第2次免后1周的抗體滴度(p＜0.01)。(五)A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖-小鼠IgG結(jié)合疫苗的制備將A群流腦多糖-小鼠IgG結(jié)合疫苗原液、C群流腦多糖-小鼠IgG結(jié)合疫苗原液、B型流感嗜血桿菌多糖-小鼠IgG結(jié)合疫苗原液分別稀釋至60μg/ml(按多糖計(jì)算)，將以上三種稀釋后的疫苗液各取20ml放于一100ml容量的三角燒瓶?jī)?nèi)，充分混合后，按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖各10μg的多糖-TT結(jié)合疫苗。
動(dòng)物試驗(yàn)按上述方法制備A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖-小鼠IgG結(jié)合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖各20μg。加三倍體積的稀釋劑稀釋后，即為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用疫苗，分別于0、14、21天皮下免疫SPF級(jí)BALB/C小鼠，免疫劑量為0.5ml(含每種多糖2.5μg)。分別于0、21、28天采集血液，分離血清，測(cè)定抗體滴度前將血清放置于-20℃。免疫動(dòng)物的同時(shí)設(shè)氫氧化鋁及生理鹽水對(duì)照組，以酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清抗體滴度。結(jié)果見(jiàn)表3。第2次免后1周小鼠血清抗體滴度顯著高于免前(p＜0.01)，第3次免后1周，除C群流腦抗體滴度增加無(wú)著性外，A群流腦多糖抗體、Hib多糖的抗體滴度顯著高于第2次免后1周的抗體滴度(p＜0.01)。
表3、A、C群流腦多糖、B型流感嗜血桿菌多糖-鼠IgG結(jié)合疫苗免疫BALB/C小鼠的血清抗體滴度*

*血清的起始稀釋度為1∶100，連續(xù)2倍稀釋?zhuān)罡呦♂尪葹?∶102400。免前血清、鋁佐劑、生理鹽水對(duì)照組血清的稀釋方法同其他試驗(yàn)組，1∶100陰性的，血清抗體滴度按1計(jì)算。
氫氧化鋁、生理鹽水對(duì)照組的結(jié)果見(jiàn)表1。
以人免疫球蛋白為載體制備的結(jié)合疫苗可用于3月齡以上各年齡段人群的免疫。使用劑量范圍為5-100μg/劑(按多糖計(jì)算)，免疫次數(shù)2-3次，免疫間隔4-8周。
權(quán)利要求
1.一種多糖-蛋白結(jié)合疫苗制劑，其特征在于，含有A群流行性腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖-蛋白結(jié)合物，C群流行性腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖-蛋白結(jié)合物，B型流感嗜血桿菌多糖-蛋白結(jié)合物。
2.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑，其中三種結(jié)合產(chǎn)物混合的比例為1∶1-4，每劑含有A群、C群流行性腦脊髓膜炎球菌夾膜多糖、B型流感嗜血桿菌多糖各5-100μg(按多糖計(jì))。
3.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑，其中的蛋白載體為破傷風(fēng)類(lèi)毒素、白喉類(lèi)毒素、人血清免疫球蛋白、B群流行性腦脊髓膜炎球菌外膜蛋白。
4.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑，其特征在于，還可含有氫氧化鋁或磷酸鋁作為鋁佐劑，加入量為0.25～1.5mg鋁佐劑/劑。
5.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑是注射劑。
6.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑，可與其他含鋁佐劑的蛋白類(lèi)疫苗(如DTP，乙型肝炎疫苗等)聯(lián)合使用。
7.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑，可與其他含鋁佐劑的疫苗(如DTP，乙型肝炎疫苗、滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、滅活日本腦炎病毒疫苗)聯(lián)合組成多價(jià)疫苗。
8.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑，其中三種多糖-蛋白結(jié)合物的多糖和蛋白載體結(jié)合是通過(guò)化學(xué)鍵共價(jià)結(jié)合的。
9.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑制備方法，其特征在于，三種多糖-蛋白結(jié)合物的多糖和蛋白載體是通過(guò)多糖與蛋白偶聯(lián)結(jié)合的，其中，多糖與蛋白的加入量可以等量，也可有1～5倍量的差別，偶聯(lián)過(guò)程可加入己二酰肼、碳二亞胺。
10.用權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑制備用于預(yù)防A群、C群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌、B型流感嗜血桿菌引起的感染的疫苗藥物。
全文摘要
本發(fā)明將A群、C群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖、B型流感嗜血桿菌多糖通過(guò)化學(xué)的方法以共價(jià)鍵結(jié)合到有效的蛋白載體上，制備出可供人體免疫接種用的多糖－蛋白結(jié)合疫苗，用于預(yù)防A群、C群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌、B型流感嗜血桿菌引起的感染。
文檔編號(hào)A61K39/125GK1425465SQ0215903
公開(kāi)日2003年6月25日 申請(qǐng)日期2002年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月27日
發(fā)明者孔健, 蔣先敏, 吳冠江 申請(qǐng)人:北京綠竹生物技術(shù)有限責(zé)任公司