專(zhuān)利名稱(chēng)：叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表面消毒方法，具體是一種叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法， 屬于微生物培養(yǎng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
叢枝菌根真菌(AMF)是一類(lèi)不能純培養(yǎng)的植物共生菌，在對(duì)AMF非共生階段及生理生化的研究中往往需要對(duì)其孢子進(jìn)行表面消毒以排除其他微生物的干擾。由于AMF的孢子具有貼壁的特性，在一般的器具中它們往往貼伏在器壁上，很難使其完全浸沒(méi)在消毒液中，從而不能很好的消毒。目前最為常用的AMF孢子表面消毒方法有“Kitasato beaker”法和“Eppendorf surface sterilized”法。"Kitasato beaker”法由英國(guó)禾斗學(xué)家 Mosse 在《Transactions of the British Mycological Society)) 1959 年 42 :273-286 “Theregular germination of resting spores and some observations on the growthrequirements of an Endogone sp.causing vesicular-arbuscular mycorrhiza"中提出，是一種基于抽濾系統(tǒng)進(jìn)行消毒的方法，通過(guò)不斷添加消毒液使孢子始終浸在消毒液中來(lái)達(dá)到孢子表面消毒的目的，該方法雖具有較好的消毒效果，但其操作復(fù)雜且需要專(zhuān)門(mén)儀器的輔助，如真空泵和專(zhuān)門(mén)的無(wú)菌罩，另外該方法操作區(qū)域較大會(huì)損失大量孢子；"Eppendorf surface sterilized”法由西 Ι 31 禾Cano 《Mycorrhiza》2008 $ V :627_654 “In vitro culturesopen new prospects for basic research in arbuscular mycorrhizas，，中提出，是一禾中通過(guò)離來(lái)實(shí)現(xiàn)孢子表面消毒的方法，該方法是將孢子轉(zhuǎn)移到裝有消毒液的Eppendorf管中，通過(guò)離心在離心力的作用下使孢子浸沒(méi)在消毒液中實(shí)現(xiàn)表面消毒的，這種消毒方法需要離心機(jī)的輔助，雖然在一定程度上能實(shí)現(xiàn)AMF孢子的表面消毒，但由于操作比較劇烈，表面消毒后孢子的活力會(huì)降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)AMF孢子的表面消毒，使消毒過(guò)程不致造成孢子的損失同時(shí)又不影響孢子的活力，公開(kāi)了一種AMF孢子的表面消毒方法。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方法實(shí)現(xiàn)的a.取兩張濾紙將其邊緣上折后鋪入其中一個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，裁剪一些吸水紙放入其它幾個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，另留二個(gè)空培養(yǎng)皿不放濾紙與吸水紙，將培養(yǎng)皿包嚴(yán)，備用蒸餾水，對(duì)培養(yǎng)皿和蒸餾水進(jìn)行高壓蒸汽滅菌；b.配制含有氯胺T、氯霉素、硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素和吐溫-20共5種試劑的孢子表面消毒液，將消毒液通過(guò)微孔濾膜過(guò)濾除菌；c.打開(kāi)裝有雙層濾紙的培養(yǎng)皿，將載有AMF孢子的濾紙片放入培養(yǎng)皿內(nèi)的雙層濾紙中間，用膠頭滴管吸取消毒液滴加在上層濾紙上，使整個(gè)雙層濾紙浸透并在上層可見(jiàn)消毒液，將培養(yǎng)皿封蓋；
d.消毒過(guò)程中如需更換消毒液，可通過(guò)轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)吸取消毒液，再轉(zhuǎn)至另一套空培養(yǎng)皿中重新添加消毒液；e.在消毒完成后，將雙層濾紙轉(zhuǎn)移到裝有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用吸水紙吸取雙層濾紙所吸附的消毒液；f.轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的另一培養(yǎng)皿中，用膠頭滴管在上層濾紙中添加無(wú)菌水，利用吸水紙吸取水分，重復(fù)操作3-5次；g.取出上層濾紙并倒置放入另一培養(yǎng)皿中，解剖鏡下分別檢查并轉(zhuǎn)移上層濾紙、 下層濾紙和濾紙片上的AMF孢子，AMF孢子的表面消毒完成。本發(fā)明通過(guò)雙層濾紙和培養(yǎng)皿的組合實(shí)現(xiàn)了對(duì)AMF孢子的表面消毒。該方法操作簡(jiǎn)單溫和、消毒液用量少，消毒前后不會(huì)丟失孢子，也不影響孢子的活力，同時(shí)消毒過(guò)程中也不需要其他儀器的輔助。


附圖1是本發(fā)明AMF孢子表面消毒示意圖。附圖2是本發(fā)明表面消毒后用無(wú)菌水清洗AMF孢子的示意圖。附圖標(biāo)記為膠頭滴管1，消毒液2，上層濾紙3，孢子4，濾紙片5，培養(yǎng)皿6，下層濾紙7，無(wú)菌水8，吸水紙9。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述a.備用10套60mm的玻璃培養(yǎng)皿、直徑為75mm的普通濾紙和吸水紙，取兩張濾紙將其邊緣上折后鋪入培養(yǎng)皿底，其上折的邊緣與培養(yǎng)皿壁留有空隙以便轉(zhuǎn)移，裁剪一些吸水紙，大小剛好放入培養(yǎng)皿底，4張一組放入培養(yǎng)皿內(nèi)，共放置7套培養(yǎng)皿，另留二套空培養(yǎng)皿以備轉(zhuǎn)移雙層濾紙，將培養(yǎng)皿包嚴(yán)，備用200ml蒸餾水和2支膠頭滴管，對(duì)培養(yǎng)皿、蒸餾水和膠頭滴管在121°C下高壓蒸汽滅菌20min ；b.配制含有50g/L氯胺T、50mg/L氯霉素、100mg/L硫酸慶大霉素、200mg/L硫酸鏈霉素和0. 05 %吐溫-20的孢子表面消毒液20mL，將消毒液通過(guò)0. 22 μ m ？L徑的微孔濾膜過(guò)濾除菌；c.整個(gè)孢子表面消毒過(guò)程在室溫條件下，放置于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，打開(kāi)裝有雙層濾紙的培養(yǎng)皿，將載有孢子的濾紙片放入培養(yǎng)皿內(nèi)的兩層濾紙正中，用膠頭滴管吸取消毒液從一側(cè)開(kāi)始滴加在雙層濾紙的上層濾紙上，使整個(gè)雙層濾紙浸透并在上層可見(jiàn)消毒液，封蓋培養(yǎng)皿，消毒液滴加過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡；d.消毒過(guò)程中如需更換消毒液，可通過(guò)轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)吸走消毒液，再轉(zhuǎn)至另一套空培養(yǎng)皿中重新添加消毒液來(lái)實(shí)現(xiàn)；e.消毒時(shí)間為15min，消毒完成后，將雙層濾紙轉(zhuǎn)移到裝有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用吸水紙吸取濾紙吸附的消毒液；f.轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的另一培養(yǎng)皿中，用另一個(gè)膠頭滴管在上層濾紙表面添加無(wú)菌水，利用吸水紙從下層濾紙吸收水分，重復(fù)操作5次；&取出上層濾紙并倒置放入另一套培養(yǎng)皿內(nèi)，解剖鏡下分別檢查并轉(zhuǎn)移上層濾紙、下層濾紙及濾紙片上的AMF孢子，AMF孢子的表面消毒完成。
權(quán)利要求
1.叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法，其特征在于是通過(guò)以下技術(shù)方法實(shí)現(xiàn)的 1. a.取兩張濾紙將其邊緣上折后鋪入其中一個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，裁剪一些吸水紙放入其它幾個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，另留二個(gè)空培養(yǎng)皿不放濾紙與吸水紙，將培養(yǎng)皿包嚴(yán)，備用蒸餾水，對(duì)培養(yǎng)皿和蒸餾水進(jìn)行高壓蒸汽滅菌；1. b.配制含有氯胺T、氯霉素、硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素和吐溫-20共5種試劑的孢子表面消毒液，將消毒液通過(guò)微孔濾膜過(guò)濾除菌；1. c.打開(kāi)裝有雙層濾紙的培養(yǎng)皿，將載有AMF孢子的濾紙片放入培養(yǎng)皿內(nèi)的雙層濾紙中間，用膠頭滴管吸取消毒液滴加在上層濾紙上，使整個(gè)雙層濾紙浸透并在上層可見(jiàn)消毒液，將培養(yǎng)皿封蓋；1. d.消毒過(guò)程中如需更換消毒液，可通過(guò)轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)吸取消毒液，再轉(zhuǎn)至另一套空培養(yǎng)皿中重新添加消毒液；1. e.在消毒完成后，將雙層濾紙轉(zhuǎn)移到裝有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用吸水紙吸取雙層濾紙所吸附的消毒液；1. f.轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的另一培養(yǎng)皿中，用膠頭滴管在上層濾紙中添加無(wú)菌水，利用吸水紙吸取水分，重復(fù)操作3-5次；1.g.取出上層濾紙并倒置放入另一培養(yǎng)皿中，解剖鏡下分別檢查并轉(zhuǎn)移上層濾紙、下層濾紙和濾紙片上的AMF孢子，AMF孢子的表面消毒完成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法，其特征在于是通過(guò)以下技術(shù)方法實(shí)現(xiàn)的2. a.備用10套60mm的玻璃培養(yǎng)皿、直徑為75mm的普通濾紙和吸水紙，取兩張濾紙將其邊緣上折后鋪入培養(yǎng)皿底，其上折的邊緣與培養(yǎng)皿壁留有空隙以便轉(zhuǎn)移，裁剪一些吸水紙，大小剛好放入培養(yǎng)皿底，4張一組放入培養(yǎng)皿內(nèi)，共放置7套培養(yǎng)皿，另留二套空培養(yǎng)皿以備轉(zhuǎn)移雙層濾紙，將培養(yǎng)皿包嚴(yán)，備用200ml蒸餾水和2支膠頭滴管，對(duì)培養(yǎng)皿、蒸餾水和膠頭滴管在121°C下高壓蒸汽滅菌20min ；2. b.配制含有50g/L氯胺T、50mg/L氯霉素、100mg/L硫酸慶大霉素、200mg/L硫酸鏈霉素和0. 05 %吐溫-20的孢子表面消毒液20mL，將消毒液通過(guò)0. 22 μ m孔徑的微孔濾膜過(guò)濾除菌；2. c.整個(gè)孢子表面消毒過(guò)程在室溫條件下，放置于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，打開(kāi)裝有雙層濾紙的培養(yǎng)皿，將載有孢子的濾紙片放入培養(yǎng)皿內(nèi)的兩層濾紙正中，用膠頭滴管吸取消毒液從一側(cè)開(kāi)始滴加在雙層濾紙的上層濾紙上，使整個(gè)雙層濾紙浸透并在上層可見(jiàn)消毒液， 封蓋培養(yǎng)皿，消毒液滴加過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡；2. d.消毒過(guò)程中如需更換消毒液，可通過(guò)轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)吸走消毒液，再轉(zhuǎn)至另一套空培養(yǎng)皿中重新添加消毒液來(lái)實(shí)現(xiàn)；2. e.消毒時(shí)間為15min，消毒完成后，將雙層濾紙轉(zhuǎn)移到裝有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用吸水紙吸取濾紙吸附的消毒液；2. f.轉(zhuǎn)移雙層濾紙至裝有吸水紙的另一培養(yǎng)皿中，用另一個(gè)膠頭滴管在上層濾紙表面添加無(wú)菌水，利用吸水紙從下層濾紙吸收水分，重復(fù)操作5次；2. g.取出上層濾紙并倒置放入另一套培養(yǎng)皿內(nèi)，解剖鏡下分別檢查并轉(zhuǎn)移上層濾紙、 下層濾紙及濾紙片上的AMF孢子，AMF孢子的表面消毒完成。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法，其技術(shù)方案是將濾紙與吸水紙分別放入幾個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，配制孢子表面消毒液，將載有AMF孢子的濾紙片放入培養(yǎng)皿內(nèi)的雙層濾紙中間，吸取消毒液滴加在上層濾紙上，將雙層濾紙轉(zhuǎn)移到裝有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用吸水紙吸取所吸附的消毒液，取出上層濾紙并倒置放入另一培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移濾紙上的AMF孢子，完成表面消毒。本發(fā)明通過(guò)雙層濾紙和培養(yǎng)皿的組合實(shí)現(xiàn)了對(duì)AMF孢子的表面消毒。該方法操作簡(jiǎn)單溫和，消毒液用量少，消毒前后不會(huì)丟失孢子，也不影響孢子的活力，同時(shí)也不需要其他儀器的輔助。
文檔編號(hào)A61L101/32GK102166367SQ20101061713
公開(kāi)日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者唐明, 孫學(xué)廣, 陳輝 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)