專利名稱：利用熱滯后蛋白改良低溫外科中的組織破壞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以前與低溫外科不相關(guān)的領(lǐng)域，以及熱滯后蛋白(Thermalhysteresis proteins)的性質(zhì)和利用。
背景技術(shù)：
冷凍外科作為一種臨床醫(yī)學(xué)方法已獲得廣泛的接受，并且其應(yīng)用范圍還在迅速擴(kuò)大。其中包括眼內(nèi)障性晶狀體的切除、視網(wǎng)膜脫離的修復(fù)、用以矯正心律失常的部分心臟組織的切除、以及前列腺、肝、腦和其它內(nèi)臟腫瘤的破壞。低溫外科中利用一個(gè)冷凍探針的插入以通過高度定位冷凍作用破壞不需要的組織。一旦該組織凍結(jié)，可讓其解凍。然后機(jī)體的免疫系統(tǒng)逐漸分解被破壞的組織并將之排出體外。低溫外科具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括其最小限度的侵入性然而高度可控，而且沒有劑量限制。
冷凍探針為細(xì)圓筒狀的器具，它用冷凍劑從內(nèi)部降溫，除尖端外其余部分絕熱。由于冷凍劑通過探針循環(huán)，組織的冷凍自尖端向外發(fā)生，在冷凍組織及非冷凍組織間形成一個(gè)運(yùn)動(dòng)的冷凍前沿或分界面，該前沿或分界面是嚴(yán)格限定的，并在組織中緩慢傳播(傳播速度為每分鐘幾毫米)?？捎眯〉奶结樚幚硐鄬?duì)大的區(qū)域；例如一3毫米直徑的探針可產(chǎn)生直徑為3.5厘米的冰球。當(dāng)病理組織的區(qū)域較大且形狀復(fù)雜時(shí)，相應(yīng)的接近目的組織的冷凍區(qū)域可用幾個(gè)探針同時(shí)來產(chǎn)生。復(fù)合位點(diǎn)可分開處理或同時(shí)處理。由于冷凍探針的插入是組織僅有的物理性侵入，該方法帶來的并發(fā)癥及病人的發(fā)病率得以降低，而且這種方法使患者承擔(dān)較少的痛苦和損傷，所有這些使得在低于傳統(tǒng)的侵入性外科的費(fèi)用的情況下獲得治療效果。
冷凍外科的一個(gè)局限性是不能使所有不需要的組織受冷凍或使得許多緊鄰不需要的組織的健康組織有受冷凍的危險(xiǎn)。然而，最近非侵入性醫(yī)學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展已大大降低了冷凍不足(under-freezing)和過冷凍(over-freezing)的危險(xiǎn)。例如手術(shù)過程中的超聲成像技術(shù)可通過在冷凍組織和非冷凍組織間聲阻抗的變化來監(jiān)測冷凍前沿位置以及冷凍組織的大小、形狀和位置。磁共振成像技術(shù)也得以有效應(yīng)用，它的便利之處在于以三維方式在200微米的分辨率下對(duì)冷凍前沿位置成像。
然而，成像技術(shù)已暴露出進(jìn)一步的局限性某種條件下活細(xì)胞的冷凍只是保藏了細(xì)胞而沒有破壞它們。對(duì)何時(shí)保藏細(xì)胞而不是破壞它們，或者何時(shí)破壞細(xì)胞而不是保藏它們的解釋，可見于Mazur,P在1970年第168卷第939-949頁的《科學(xué)》雜志上“低溫生物學(xué)生物系統(tǒng)的冷凍”一文中提出的“兩因子”(即化學(xué)因子和機(jī)械因子)理論假說中。此理論認(rèn)為任一給定溫度下冰晶形成的可能性為體積的函數(shù)，在較大體積中，冰晶形成的可能性更大。在細(xì)胞懸浮液中，此效果導(dǎo)致胞外空間首先形成冰；這是因?yàn)榘饪臻g的體積遠(yuǎn)大于單個(gè)細(xì)胞的胞內(nèi)體積。由于胞外冰的形成，剩下未結(jié)冰溶液中溶質(zhì)的濃度升高，在細(xì)胞周圍形成高滲溶液。在這些(現(xiàn)象)發(fā)生時(shí)胞內(nèi)流質(zhì)仍以液態(tài)形式存在，從而在細(xì)胞膜兩側(cè)形成化學(xué)勢。這使得水通過質(zhì)膜從胞內(nèi)向胞外流動(dòng)，留下離子及有機(jī)溶質(zhì)(為膜不透性的)在細(xì)胞內(nèi)。從而細(xì)胞脫水并自身變成離滲的，通過化學(xué)損害導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。然而化學(xué)損害為時(shí)間和溫度的函數(shù)，水通過細(xì)胞膜的輸送則是一速度依賴過程。因而較低的冷凍速度將因?yàn)榧?xì)胞更長時(shí)間暴露在高滲條件下而增加了化學(xué)損害的可能性。相反，胞內(nèi)自身冰晶的形成則被認(rèn)為是通過機(jī)械損害來導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，冷凍速度增加至某一水平以上可使得水在遷移出細(xì)胞前即形成冰核。因而在高冷凍速度的情況下，隨冷凍速度的增加，胞內(nèi)冰晶形成及隨之發(fā)生的細(xì)胞死亡的可能性增加而非減少。這兩個(gè)相反的細(xì)胞破壞模式在用細(xì)胞存活率相對(duì)于冷凍速度作圖時(shí)形成一倒“U”形曲線。除冷凍速度外，其它被認(rèn)為是影響細(xì)胞存活率的因子是溫度梯度、冷凍界面推進(jìn)的速度、最終冷凍溫度、此溫度下保持的時(shí)間、冷凍后升溫的速度和所包括的冷凍-解凍循環(huán)數(shù)。
在低溫外科中，這些參數(shù)特別難以控制，這是因?yàn)闇囟瓤刂浦荒軓奶结樇舛双@得，而組織周圍的組成成份又不是一致的。在單個(gè)處理過程中，整個(gè)被處理區(qū)域中會(huì)發(fā)生一個(gè)或多個(gè)冷凍參數(shù)的變化，這是因?yàn)椴粩嘣龃蟮睦鋬鰠^(qū)域?qū)е虏煌慕M織部分經(jīng)受取決于這些部分至探針尖端的距離的不同的冷凍速度、最終冷凍溫度和維持時(shí)間。除此之外，實(shí)施此方法的方式在不同的醫(yī)生間和不同的診所間也是不同的。因而，典型的低溫外科手術(shù)的結(jié)果經(jīng)常是不可預(yù)料的，并且難以控制。
發(fā)明總結(jié)現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)利用低溫外科進(jìn)行的細(xì)胞破壞可用不依賴于冷凍速率、最終冷凍溫度和相關(guān)的熱史參數(shù)(thermal history parameters)的方式獲得，按照該方式，首先向細(xì)胞內(nèi)灌注一種或多種熱滯后蛋白，然后在繼續(xù)向細(xì)胞內(nèi)灌注熱滯后蛋白的過程中用一冷凍探針冷凍細(xì)胞。該方法利用該蛋白質(zhì)的活性控制冰晶生長的方式和方向，本發(fā)明部分在于發(fā)現(xiàn)以此蛋白質(zhì)的作用取代其他因子來影響冰晶形成的速度、機(jī)制和定位。該蛋白質(zhì)通過提高和限制胞內(nèi)冰晶的生長以形成針狀冰晶。這些冰晶通過細(xì)胞的機(jī)械破壞而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，并確保這些效果發(fā)生在整個(gè)冷凍條件的范圍內(nèi)，以及排除此范圍各部分對(duì)化學(xué)損害的依賴的必要。
本發(fā)明中的這些和其他一些特征及優(yōu)點(diǎn)在下面的描述中會(huì)變得更明顯。
本發(fā)明詳細(xì)描述及優(yōu)選實(shí)施例天然大分子種類的被稱為“抗凍蛋白”(antifreeze proteins)、“熱滯后蛋白”(thermal hystersis proteins)、“抗凍糖蛋白”(antifreeze glycoproteins)和“抗凍多肽”(antifreeze polypeptides)的存在已眾所周知并在文獻(xiàn)中大量報(bào)道。例如抗凍糖蛋白的發(fā)現(xiàn)，最初由DeVries A.L.等在1969年3月7日的《科學(xué)》(Science)第163卷第1073-1075頁中“一些南極魚類的抗凍性”一文所報(bào)道。DeVries等觀察到一些魚類能一年四季生活于平均水溫為-1.87℃水中，這是由于雖然在它們的血液中缺少足夠量的氯化鈉以及其他一些低分子量物質(zhì)，但仍能通過一般的冰點(diǎn)降低法降低冰點(diǎn)。DeVries等將這些種類的魚的生存歸因于某種糖基化蛋白質(zhì)的存在，這些蛋白質(zhì)分子量范圍從約2,500道爾頓至約34,000道爾頓，它們現(xiàn)在是指抗凍糖蛋白或“AFGPs”。進(jìn)一步研究表明許多北溫帶和北冰洋魚種在它們的血液中攜有抗凍化合物。其中有些化合物為糖蛋白，而其它一些化合物則沒有糖基半分子，稱之為抗凍多肽或抗凍蛋白(“AFPs”)，它們的分子量范圍從約3,300道爾頓至12,000道爾頓。而且，這些化合物在降低冰點(diǎn)的同時(shí)并不影響到熔點(diǎn)，因而稱之為“熱滯后蛋白”。
抗凍蛋白和抗凍糖蛋白可從廣范的來源分離到，這些來源以及從它們中獲得的各類蛋白的結(jié)構(gòu)已在文獻(xiàn)中大量報(bào)道。這些蛋白的來源包括魚類和非魚類，列于下面的表Ⅰ和表Ⅱ中。
表Ⅰ魚類的熱滯后蛋白
表Ⅱ非魚源熱滯后蛋白
研究最深入和在本發(fā)明的實(shí)施中所用的優(yōu)選蛋白質(zhì)是從魚類中分離到的。如表Ⅰ中所示，這些蛋白質(zhì)包括糖基化蛋白(AFGPs)和非糖基化蛋白(AFPs)，后者被分為三個(gè)普通種類，文獻(xiàn)中命名和本領(lǐng)域中的專業(yè)人員稱之為Ⅰ-型，Ⅱ-型和Ⅲ-型。
雖然有各種變化存在，AFGPs一般由一系列重復(fù)的三肽單位(丙氨酰-蘇氨酰-丙氨酰組成，并有二糖β-D-半乳糖基-(1→3)-α-N-乙酰基-D-半乳糖胺接在蘇氨酸殘基的羥基基團(tuán)上。例如，相對(duì)低分子量的AFGPs含有脯氨酸和精氨酸殘基，分別取代了一些丙氨酸和蘇氨酸殘基。對(duì)來自于代表魚類的AFGPs的色譜研究揭示了八個(gè)主要的分子量成分的存在，如表Ⅲ中所示。
表Ⅲ來自于Pagothenia borchgrevinki中的AFGPs的分子量組分
AFPs間的差別程度大于AFGPs間的差別。如表Ⅰ中所示，三個(gè)類型的AFPs間差別在于它們的殘基含量。Ⅰ-型AFPs富含丙氨酸殘基(約為65％)，其余的主要由極性殘基如天冬氨酸，谷氨酸，賴氨酸，絲氨酸和蘇氨酸組成。其分子量范圍從約3,300至6,000。Ⅱ-型AFPs被認(rèn)為富含胱氨酸(實(shí)際上是半胱氨酸)殘基，與C-型凝集素同源。來自于絨杜父魚(sea raven)的Ⅱ-型AFPs含有7.6％的胱氨酸，14.4％的丙氨酸，19％的天冬氨酸和谷氨酸，8％的蘇氨酸。其分子量大小從約14,000至約16,000。Ⅲ-型AFPs缺乏胱氨酸殘基，丙氨酸殘基也不豐富。沒有任何明顯優(yōu)勢的氨基酸成份存在，極性氨基酸和非極性氨基酸的含量相當(dāng)。其分子量大小從約5,000道爾頓至6,700道爾頓。本段中所有百分比均以摩爾數(shù)為基礎(chǔ)。
昆蟲來源的抗凍蛋白主要是Ⅱ-型AFPs，具有氨基酸殘基典型組分的是來自于樅色卷蛾(Choristoneura fumiferana)(云杉芽卷蛾)和偽步行蟲(Tenebrio molitor)(甲蟲)的抗凍蛋白。這些抗凍蛋白列于表Ⅳ，為了比較，表中也包括絨杜父魚(sea raven)的的氨基酸組成。
抗凍蛋白和抗凍糖蛋白可通過傳統(tǒng)的方法從魚或昆蟲的血清或其他體液中提取。這些蛋白質(zhì)的分離和純化可可通過層析方法輕易地完成，也可通過吸收，沉淀，以及蒸發(fā)的方法完成。其他的方法，其中許多已在文獻(xiàn)中描述，它們對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是非常容易明白的。
表ⅣⅡ-型AFPs氨基酸組成比較
熱滯后蛋白也可通過合成的方法產(chǎn)生，用傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法或是用包括DNA重組的方法。形成這些蛋白質(zhì)的基因的DNA編碼序列已闡明并被大量報(bào)道。例如，見DeVries,A.L.等《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.chem.)246305(1971)；Lin Y.等《生物化學(xué)生物物理研究通訊》(Biochem.Biochem.Biophys.Res.Commun.)46:87(1972)；Yang D.S.C等《自然》(Nature)333:232(1988)；Lin,Y.《美國科學(xué)院進(jìn)展》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78:2825(1981)；Davies P.L.,等，《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)79:335(1982)；Gourlie B.等《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.chem.)259:14960(1984)；cott,GK.,等《加拿大魚類水生生物科學(xué)雜志》(Can.J.Fish.Aquat.Sci.)；Scott,G.K.,等《分子進(jìn)化雜志》(J.Mol.Evol.)27:29(1988)。成功地把AFP基因微注射到其它物種而非其來源種中亦已見于報(bào)道。例如見Zhu,Z.等(AngewIchthyol)l:31(1985);Chourrout D等《水產(chǎn)養(yǎng)殖》(Aquaculture)51:143(1986)；Dumman R.A.等Trans Am.Fish.Soc.116:87(1987)；Fletcher G.L.等《加拿大魚類水生生物雜志》45:352(1988)；Maclean N.D.等《(生物技術(shù)》(BioTechnology)5:257(1987)；Stuart G.W.等《發(fā)育》(Development)103:403(1988)；McEvoy,T等《水產(chǎn)養(yǎng)殖》(Aquaculture)68:27(1988)；OzatoK等《細(xì)胞分化》(Cell Differ)19:237(1986)。
本發(fā)明具體研究的熱滯后蛋白質(zhì)是那些分子量相對(duì)較低的蛋白質(zhì)，如那些分子量介于約2,000至約10,000之間的，優(yōu)選約2,600至約6,000,最優(yōu)選約3,000至約4,000之間的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的實(shí)施中，熱滯后蛋白最便于以液體形式給藥，如一種溶液或一組織相容流質(zhì)中的懸浮液。優(yōu)選水溶液或生理鹽水[水中含約0.9％(重量/體積)氯化鈉]溶液。為取得最佳效果，溶液或懸浮液中此蛋白的濃度范圍一般從約1mg/mL至約30mg/mL，優(yōu)選從約1mg/mL至約20mg/mL，最優(yōu)選從約5mg/mL至15mg/mL。使用時(shí)可通過血管系統(tǒng)由目的器官注射、攝食、灌注以注入目的組織中，或使該組織與溶解的蛋白達(dá)到飽和和平衡的方法給藥。
一旦組織中灌入熱滯后蛋白，可根據(jù)已知技術(shù)進(jìn)行該組織的冷凍切除。將冷凍探針推進(jìn)到組織的中央，或者將兩個(gè)或多個(gè)冷凍探針置于組織內(nèi)所選擇的部位以形成符合被切除組織外形的冷凍區(qū)域。探針用復(fù)合腔完全包圍以允許在其尾端和背端以一超冷流質(zhì)環(huán)繞。液氮是常用的超冷流質(zhì)，在-196℃時(shí)于冷凍探針的尖端內(nèi)沸騰。沸騰使得在液氮和冷凍探針的金屬片間產(chǎn)生一絕熱氣體薄膜，此金屬片限制微探針周圍的最低溫度約為-160℃。當(dāng)尖端為-160℃時(shí)，從探針表面向外至2cm處的組織溫度達(dá)-20℃或更低。這種一般描述的探針在本領(lǐng)域已熟知，并于文獻(xiàn)中廣泛公開，包括美國專利號(hào)第5,147,355號(hào)，授予Friedman等(布萊漢和婦女醫(yī)院(Brigham and WomensHospital)，波士頓，馬薩諸塞州，美國，1992年9月15日)，和美國專利號(hào)第5,437,673號(hào)，授予Baust等(低溫醫(yī)學(xué)科學(xué)(Cryomedical Sciences)公司，洛克菲勒，馬里蘭州，美國，1995年8月1日)，以上二者以參考文獻(xiàn)形式在此處被引用。
本發(fā)明實(shí)施中優(yōu)選把冷凍探針和同時(shí)成像技術(shù)(Simultaneous imagingtechnques)、顯著超聲和磁共振成像(notably ultrasound and magnetic resonanceimaging)合并使用。這些技術(shù)以傳統(tǒng)的方式使用，它們的使用并不干擾冷凍探針的操作。例如，超聲成像可以二維或三維方式進(jìn)行，后者是通過計(jì)算機(jī)重構(gòu)二維超聲數(shù)據(jù)以形成三維圖像。超聲成像是通過將一超聲轉(zhuǎn)導(dǎo)器置于靠近目的組織部位而獲得。例如在前列腺成像中，超聲轉(zhuǎn)導(dǎo)器可經(jīng)直腸放置。對(duì)上面討論的液氮冷凍探針，溫度低于-20℃的組織區(qū)域被一約3毫米厚、其內(nèi)部溫度升至0℃的環(huán)包圍。此環(huán)的超聲圖像是一亮回聲(bright echo)。在磁共振成像中則不需將轉(zhuǎn)導(dǎo)器鄰于冷凍探針放置。冷凍的組織由于根本不產(chǎn)生信號(hào)，因而在MRI掃描上呈黑色，由于圖像的剩余部分不受冷凍區(qū)域的影響，可檢測到冷凍區(qū)域的全部范圍。
更進(jìn)一步的有關(guān)這些成像方法的使用的敘述可于下列出版物中找到，所有這些出版物均以參考文獻(xiàn)形式在此處被引用Onik,G,等，“轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌處理中超聲引導(dǎo)的肝低溫手術(shù)”《癌》(Cancer)67(4):901-907(1991)。
Onik,G.,等，“經(jīng)直腸的超聲引導(dǎo)的經(jīng)皮膚的根治性低溫手術(shù)切除前列腺”《癌》72(4):1291-1299(1993)Rubinsky,B.,“用超聲進(jìn)行低溫手術(shù)成像”《機(jī)械工程》MachamicalEngineering)108(3):48-51(1986)。
Rubinsky,B等，“用質(zhì)子核磁共振NMR監(jiān)測腦和前列腺的低溫手術(shù)”《低溫生物學(xué)》(Cryobiology)30:191-199(1993)下用的實(shí)施例用來描述而不是為了限制或限定或加以限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例材料與方法在下面的實(shí)施例中，研究了兩個(gè)重要的熱學(xué)變量，即致冷速度和細(xì)胞冷凍后的最終溫度對(duì)細(xì)胞破壞程度的影響。該細(xì)胞是Narayan,P.等1992年發(fā)表于《泌尿科學(xué)雜志》(J.Urol.)第148卷第5期第1600-1604頁“人原發(fā)前列腺腺癌細(xì)胞系(ND-1)的建立和特征”所建立的腺癌細(xì)胞系(ND-1)的人前列腺癌細(xì)胞培養(yǎng)物，生長于Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)上，補(bǔ)充10％的胎牛血清，100單位/mL的青霉素和100mg/mL的磷酸鏈霉素，置于75cm3的三角瓶中，在含5％CO2濕空氣中37℃溫育。一旦細(xì)胞發(fā)生貼壁，吸出生長培養(yǎng)基，加入3mL 0.05％的蛋白胨使細(xì)胞從三角瓶的壁上脫離。產(chǎn)生的細(xì)胞懸浮液離心以吸除胰蛋白酶，細(xì)胞再用生理鹽水緩沖液重懸浮。將大約50μL的含鹽細(xì)胞懸浮液放于顯微鏡載玻片上，該載玻片經(jīng)特別設(shè)計(jì)具有用于存懸浮液的硅室。
然后在一稱之為“直接固化鏡臺(tái)”(directional solidification stage)的裝置上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷凍和觀察，用此裝置可進(jìn)行所有熱學(xué)變量的精確控制。該裝置在Rubinsky 1985年7月30日的美國專利第4,531,373號(hào)中已有描述，并在此處以參考文獻(xiàn)形式被引用。此裝置由在一普通平面上用平的熱傳導(dǎo)平面相連接的間隙寬度為3mm的一對(duì)銅板組成。每塊平板含有一冷凍劑流動(dòng)通道，一個(gè)隔熱器，一個(gè)熱電偶，和穿過兩板間隙的顯微鏡光學(xué)路徑。將一顯微鏡載玻片橫穿兩熱傳導(dǎo)平面放置，并通過一步進(jìn)電機(jī)將其沿此表面以一恒定的速度移動(dòng)，穿過此間隙并貫穿顯微鏡光學(xué)路徑。該板以冷凍劑和加熱器維持在一預(yù)定的溫度，其中一板維持在給定樣品的冷凍溫度以上，另一板則維持在冷凍溫度以下，此安排使得橫穿間隙中產(chǎn)生一線性溫度梯度。將一樣品放在載玻片上，載有樣品的載玻片開始時(shí)放于兩板中較暖的那塊板上方。然后通過步進(jìn)電機(jī)使得此載玻片沿著較冷的板的方向移動(dòng)，從而導(dǎo)致樣品溫度根據(jù)樣品相對(duì)于兩板的位置而降低。結(jié)果是橫穿樣品的溫度梯度、樣品經(jīng)歷的溫度范圍、冷凍前沿速度和冷凍速率被高精確度地控制。一旦樣品到達(dá)低溫板，將樣品在此低溫下保持一規(guī)定的時(shí)間。然后將載有樣品的載玻片以一控制的速度從冷板移到熱板上以重新加熱。如果用很薄的樣品，此裝置可通過顯微鏡觀察細(xì)胞，從而可觀測到這些細(xì)胞在冷凍和解凍時(shí)發(fā)生的變化。
實(shí)施例1此實(shí)施例描述了在缺乏熱滯后蛋白時(shí)癌細(xì)胞的冷凍。
本研究中，直接固化鏡臺(tái)的高溫板維持在37℃，而低溫板的溫度保持在-5℃至-40℃間。設(shè)置(樣品在)兩板間的運(yùn)動(dòng)速度以使致冷速度為1℃/min,5℃/min,25℃/min,這些致冷速度是冷凍切除過程中冷凍組織的冷凍前沿位置的典型冷凍速度。一旦樣品達(dá)到最低溫度，將它們?cè)诖藴囟认卤３?分鐘，然后迅速返回?zé)岚濉＿M(jìn)行兩組實(shí)驗(yàn)其中一組的細(xì)胞只經(jīng)過一個(gè)冷凍-解凍循環(huán)，而另一組細(xì)胞則經(jīng)過兩個(gè)相同的冷凍-解凍循環(huán)。這樣，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下至少進(jìn)行三個(gè)實(shí)驗(yàn)。
解凍細(xì)胞和不經(jīng)過冷凍的對(duì)照細(xì)胞的生活力用錐蟲藍(lán)測試和兩色熒光細(xì)胞活力測試的方法評(píng)定。在錐蟲藍(lán)測試中，通過將細(xì)胞懸浮液和等體積的0.3％錐蟲藍(lán)混合來估測膜的完整性?；罴?xì)胞數(shù)(不被染色)相對(duì)于死細(xì)胞數(shù)(被染色)的比例可由血細(xì)胞計(jì)數(shù)器獲得。以兩色熒光細(xì)胞活力測試得到的內(nèi)源脂活性和質(zhì)膜完整性為基礎(chǔ)確定活細(xì)胞相對(duì)于死細(xì)胞比例。使用了由分子探針公司(Molecular Probes,Inc.,Eugene,俄勒岡州，美國)提供的試劑盒，該試劑盒含有細(xì)胞滲透鈣黃綠素AM及不透膜的Ethidium homodime(EthD-1)。在活細(xì)胞中，鈣黃綠素AM經(jīng)酶促轉(zhuǎn)化成熒光鈣黃綠素，產(chǎn)生強(qiáng)烈的單色綠色熒光(約530nm)。膜已破壞的細(xì)胞被EthD-1標(biāo)記，在熒光素與核酸結(jié)合后，在死細(xì)胞中產(chǎn)生一亮紅色熒光(約600nm)，而被活細(xì)胞完整的質(zhì)膜排除。
兩色熒光細(xì)胞活性測試是通過重新懸浮冷凍和解凍后的細(xì)胞進(jìn)行的，在Dulbecco磷酸鹽緩沖液中，將100μL的重懸浮細(xì)胞與200μL的含有5μL鈣黃綠素AM、10μM EthD-1和低于0.1％DMSO的混合染料混合?；旌弦河?7℃下溫育30分鐘，然后在熒光顯微鏡下研究。利用熒光顯微鏡通過計(jì)數(shù)隨機(jī)選擇的染色細(xì)胞的樣品區(qū)域中死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)來確定活細(xì)胞相對(duì)于死細(xì)胞的比率。在錐蟲藍(lán)測試和兩色熒光細(xì)胞活性測試中，每種隨機(jī)選擇的樣品區(qū)域的細(xì)胞數(shù)應(yīng)超過300個(gè)細(xì)胞的總數(shù)。兩種測試的結(jié)果都一致地處于有3％-8％的范圍內(nèi)。
利用這些方法，ND-1細(xì)胞系在各種致冷速度下冷凍到各種最終溫度，然后解凍。然后將關(guān)于非冷凍對(duì)照的死細(xì)胞和正常細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)以細(xì)胞在冷凍速度為1℃/min,5℃/min,25℃/min冷凍時(shí)最終溫度的函數(shù)繪制曲線。
根據(jù)冷凍速度為1℃/min和5℃/min的曲線，表明實(shí)驗(yàn)在最終溫度介于0℃和約-20℃時(shí)，隨著最終冷凍溫度的降低細(xì)胞死亡數(shù)逐漸增加(實(shí)驗(yàn)在1℃/min的速率進(jìn)行時(shí)，細(xì)胞死亡數(shù)從13％到87％，當(dāng)實(shí)驗(yàn)在5℃/min的速率下進(jìn)行時(shí)，細(xì)胞死亡數(shù)從5％到87％)。實(shí)驗(yàn)過程中，當(dāng)最終溫度低于約-20℃時(shí)，細(xì)胞破壞的百分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，但速度較慢。在1℃/min速率的測試中，終溫達(dá)-40℃時(shí)，死細(xì)胞的平均百分率為95％，而在5℃/min速率的測試中，終溫相同時(shí)的死細(xì)胞平均百分率為98％。因而兩種致冷速度下，細(xì)胞在達(dá)-40℃時(shí)的冷凍過程中仍沒有完全被破壞。
冷凍速度為25℃/min下進(jìn)行的測試曲線表明在最終溫度為-5℃和-15℃間，細(xì)胞破壞的百分率成級(jí)增加，在此溫度范圍，不同實(shí)驗(yàn)中的破壞率的值擴(kuò)展到一個(gè)寬范圍內(nèi)。這顯示了胞內(nèi)冷凍是發(fā)生于一個(gè)窄的溫度范圍內(nèi)的統(tǒng)計(jì)學(xué)現(xiàn)象。在冷凍速度為25℃/min的冷凍過程中，細(xì)胞的破壞是由于胞內(nèi)冰晶的形成。因而，在人前列腺腺癌中，從化學(xué)破壞向胞內(nèi)冰晶形成的破壞的過渡可能發(fā)生在5℃/min和25℃/min的冷凍速度之間。
實(shí)施例2此實(shí)施例揭示了熱滯后蛋白存在時(shí)癌細(xì)胞的冷凍。
準(zhǔn)備實(shí)施例1中所用的同類型細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液。其中一些懸浮液包括濃度為10mg/mL的分子量為3,600道爾頓的來自于美洲黃蓋鰈(Pleuronectusamericanus)的熱滯后蛋白，其余懸浮液中則不含任何熱滯后蛋白。將懸浮液液滴加到玻璃載玻片上，使厚度約為100μm，用蓋玻片蓋上，在直接固化鏡臺(tái)上冷凍。在本實(shí)驗(yàn)中，冷凍過程通過一個(gè)放大倍數(shù)為40倍的光學(xué)顯微鏡記錄于錄像帶上。進(jìn)行幾組實(shí)驗(yàn)，其中細(xì)胞在不同致冷速度(范圍從1℃/min至25℃/min)下冷凍。
在不含熱滯后蛋白的細(xì)胞懸浮液中，冷凍過程中形成大的指狀冰晶。這顯示冰形成時(shí)的溶質(zhì)被冰排斥(rejection ofsolutes)。當(dāng)冷凍過程繼續(xù)時(shí)，未冷凍細(xì)胞被推入指狀冰晶間形成的通道。由于通道中的胞外流質(zhì)含有高濃度的溶質(zhì)(來自于被冰晶排斥的溶質(zhì))，未冷凍細(xì)胞開始失水，以使得胞內(nèi)和胞外溶液的化學(xué)勢達(dá)到平衡，最終由于胞內(nèi)化學(xué)破壞作用而導(dǎo)致了該細(xì)胞的破壞。
在含有熱滯后蛋白的細(xì)胞懸浮液中，冷凍的結(jié)果導(dǎo)致了胞外流質(zhì)中非常細(xì)小的微米大小針狀冰晶的形成。這些冰晶逐漸使未冷凍細(xì)胞變形，導(dǎo)致這些細(xì)胞的細(xì)胞膜崩潰。然后冰晶進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，使細(xì)胞內(nèi)變成超冷狀。細(xì)胞內(nèi)部驟然冷凍使得在每個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生許多小的冰晶，導(dǎo)致胞內(nèi)冰晶呈現(xiàn)為黑的圖像。
推進(jìn)的冷凍前沿和發(fā)生胞內(nèi)冷凍的部位間的距離小于200μm，發(fā)生胞內(nèi)冷凍的部位的溫度高于-2℃，這是根據(jù)沿著直接固化鏡臺(tái)的冷凍的線性部位確定的。這些微小的距離和微小的溫度差別說明細(xì)胞破壞的程度非常近地符合冷凍程度，并且其發(fā)生是獨(dú)立于冷凍速率或最終溫度的。
實(shí)施例3本實(shí)施例描述熱滯后蛋白存在下的前列腺癌組織薄片的冷凍。
人前列腺組織由人前列腺正常和發(fā)病部分的針狀活組織獲得。將所研究的組織浸入一種保存溶液(Hank′s平衡鹽水溶液，由西格瑪化學(xué)公司(SigmaChemical Company,圣路易斯，密蘇里州，美國)提供，其中加入青霉素G，鏈霉素和慶大霉素。)中，在部分溶液中加入濃度為10mg/mL分子量為3,600道爾頓的來自于美洲黃蓋鰈(Pleuronectus americanus)的熱滯后蛋白，而在其它溶液中則沒有熱滯后蛋白的存在。該組織用切片機(jī)切成厚約300μm的薄片，置于一玻璃載玻片上并蓋上一蓋玻片。然后將組織放在直接固化鏡臺(tái)上讓它們?cè)谂c實(shí)施例2相同的冷凍速度下冷凍，并通過一光學(xué)顯微鏡用錄像帶記錄冷凍過程。
在冷凍和解凍后，利用實(shí)施例1中所描述的兩色熒光細(xì)胞活力測試確定細(xì)胞的活力。在這一系列測試中，冷凍前后的組織薄片均于250μL含有10μm的EthD-1的Dulbecco酸緩沖液中于37℃輕輕振蕩溫育30分鐘。如上面解釋的，此染料在結(jié)合到損壞細(xì)胞的核酸上后發(fā)出紅色熒光。在溫育之后，向混合液中加入SYTOTM-16[一種來自于分子探針公司(MolecularProbes,Inc.,of Eugene,俄勒岡州，美國)的核酸染色液，250μL,10μM],再于37℃輕輕振蕩溫育60分鐘。此后面加入的染液為一種有高滲透能力和核酸高親和力的細(xì)胞滲透性染料，在與核酸結(jié)合后發(fā)出一種非常亮的綠色熒光(約525nm)。EthD-1和SYTO-16間并不干涉對(duì)方的結(jié)合位點(diǎn)。通過鑒別那些與僅發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞相比較既產(chǎn)生綠色熒光又產(chǎn)生紅色熒光的細(xì)胞，人們可以在完整的組織中把活細(xì)胞與死細(xì)胞區(qū)分開。
利用這些步驟，錄像帶顯示浸于熱滯后蛋白溶液中的組織切片中細(xì)胞崩潰的方式和在冷凍過程中的發(fā)生階段與實(shí)施例2中細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞相同。這種崩潰在任何沒有用熱滯后蛋白處理的組織薄片中都觀測不到。這證明當(dāng)用熱滯后蛋白處理時(shí)懸浮液中的細(xì)胞和組織中的細(xì)胞具行為上的相似性。
冷凍和解凍后進(jìn)行的熒光染色測試顯示在熱滯后蛋白存在下的冷凍組織中的細(xì)胞已完全被破壞，而那些沒有熱滯后蛋白存在下的冷凍組織中的細(xì)胞在所有測試的冷凍條件下只有部分遭到破壞。
上述內(nèi)容主要是為了描述而提供。顯而易見，對(duì)那些本領(lǐng)域中的專業(yè)人士來說，本文中描述的操作條件、材料、步驟順序和此過程中其它參數(shù)可用各種方式進(jìn)一步修改或替代，但不會(huì)偏離本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1．一種通過破壞含有含水胞內(nèi)流質(zhì)的活細(xì)胞的不需要的組織進(jìn)行活機(jī)體的治療的方法，包括(a)用一在組織相容溶劑中含有約1mg/mL至約50mg/mL熱滯后蛋白的溶液灌注所說組織；以及(b)利用冷凍探針插入灌注后的組織，并維持足夠長時(shí)間，通過使所說細(xì)胞中產(chǎn)生針狀冰晶從而致命性破壞所說細(xì)胞，如此選擇性冷凍所說組織。
2．一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的熱滯后蛋白是具有從南極或北極魚種中分離和純化的熱滯后蛋白的分子結(jié)構(gòu)的一種蛋白質(zhì)。
3．一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的熱滯后蛋白是具有從包括Antarctic notothenioids、北半球海洋鱈類(Nortnen ocean gadoids)、右眼比目魚類、杜父魚類和綿鳚類的組中選出的一個(gè)成員中分離和提純的熱滯后蛋白的分子結(jié)構(gòu)的一種蛋白質(zhì)。
4．一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說熱滯后蛋白是從包括下列蛋白質(zhì)的組中選出的一種熱滯后蛋白(a)從由Pagothenia borchgrevink；Trematomus borchgrevinki；Trematomus bernachii和Dissostichus mawsoni組成的組中選擇的一種中分離和純化出的抗凍糖蛋白；(b)從由美洲黃蓋鰈(Pseudopleuronectus americanus)和銹泥鰈(Limandaferruginea)組成的組中選擇的一種中分離和純化出的Ⅰ-型抗凍多肽；(c)從美絨杜父魚(Hemitripterus americanus)中分離和純化出的Ⅱ-型抗凍多肽；以及(d)從由Macrozoarces americanus,Rhigophila dearborni和南(北)極狼綿鳚(Lycodes polaris)的組中選擇的一種中分離和純化出的Ⅲ-型抗凍多肽組。
5．一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的熱滯后蛋白是從包括下列蛋白質(zhì)的組中選出的一種熱滯后蛋白(a)Dissostichus mawsoni和Trematomus bemachii組中選擇的一種中分離和純化出的抗凍糖蛋白；(b)從美洲黃蓋鰈(Pstudopleuronectus americanus)中分離和純化的Ⅰ-型抗凍多肽；(c)從美絨杜父魚(Hemitripterus americanus)中分離和純化的Ⅱ-型抗凍多肽；(d)從Macrozoarces americanus中分離和純化的Ⅲ-型抗凍多肽。
6．一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的熱滯后蛋白是一種從美洲黃蓋鰈(Pseudopleuronectus americanus)中分離和純化的抗凍多肽。
7．一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的熱滯后蛋白具有從約2,000道爾頓至約10,000道爾頓的分子量。
8．一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的熱滯后蛋白具有從約2,600道爾頓至約6,000道爾頓的分子量。
9．一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的熱滯后蛋白具有從約3,000道爾頓至約4,000道爾頓的分子量。
10．一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的溶液含有從約1mg/mL至30mg/mL的熱滯后蛋白。
11．一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的溶液含有從約5mg/mL至15mg/mL的熱滯后蛋白。
12．一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的步驟(b)產(chǎn)生一個(gè)由在冷凍組織和非冷凍組織間的運(yùn)動(dòng)界面確定的其大小在增長的冷凍區(qū)域，所說的方法還包括用成像方法監(jiān)測所說的界面的位置。
13．一種根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所說的成像為超聲成像。
14．一種根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所說的成像是磁共振成像。
全文摘要
在致冷冷凍前向細(xì)胞內(nèi)灌注熱滯后蛋白,細(xì)胞和組織的低溫切除破壞得以加強(qiáng)。此蛋白的作用是提高了胞內(nèi)流質(zhì)中針狀冰晶的生長,該冰晶通過刺穿細(xì)胞膜而破壞細(xì)胞。此方法降低了冷凍過程中細(xì)胞保藏的發(fā)生率,從而在低溫切除技術(shù)中進(jìn)行更一致和更可控的不需要組織的破壞。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1214624SQ97193417
公開日1999年4月21日 申請(qǐng)日期1997年3月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月29日
發(fā)明者鮑里斯·魯賓斯基, 埃米爾－霍馬尤恩·考沙法 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)