專(zhuān)利名稱(chēng)：可生物降解的多聚納米微囊及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明與可改善體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的納米微囊組分及其應(yīng)用和制備方法有關(guān)。本發(fā)明中的納米微囊組分適于包裹有治療意義的試劑，包括大分子物質(zhì)。
背景技術(shù)：
紅細(xì)胞(RBC)中的血紅蛋白(Hb)是負(fù)責(zé)運(yùn)輸氧氣的。當(dāng)將血紅蛋白從紅細(xì)胞中抽提出來(lái)后，它可被消毒以除去HIV和其它感染源。不幸的是，當(dāng)將抽提出來(lái)的血紅蛋白灌輸?shù)饺梭w時(shí)，它會(huì)在灌輸進(jìn)入受體的血液循環(huán)系統(tǒng)后降解成二聚體。游離血紅蛋白尤其對(duì)腎有毒性。血紅蛋白分子可被化學(xué)修飾以避免灌輸后的降解。這些簡(jiǎn)單修飾后的血紅蛋白已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的最后一期。然而這種修飾的血紅蛋白沒(méi)有被膜覆蓋，因此它必須被超純化以避免引起不良反應(yīng)。超純化也會(huì)除去紅細(xì)胞中那些所有對(duì)于防止氧化劑的有害效應(yīng)而必需的酶。另外，修飾的血紅蛋白在人體內(nèi)的循環(huán)半衰期相當(dāng)短，大約24小時(shí)。
血紅蛋白只是機(jī)體需要的眾多重要的生物大分子中的一個(gè)例子。在疾病事件中，經(jīng)常需要向機(jī)體提供大分子物質(zhì)，這些大分子或者是因?yàn)榧膊≡斐善淙笔В蛘弑蛔C明對(duì)疾病有治療功效。但在過(guò)去，以一種可接受的方式有效地傳輸這樣的大分子進(jìn)入到機(jī)體中從而獲得所需要的治療效果是有困難的。
過(guò)去，人們已經(jīng)嘗試微囊化血紅蛋白以應(yīng)用于體內(nèi)(Chang，T.M.S，1964，Science 146，524；Chang，T.M.S，1997，“Blood SubstitutesPrinciples，methods，products and clinicaltrial”，vol.I，Karser publisher，Basel。)火棉膠、纖維素、1，6-環(huán)己烷二胺(HMDA)，交聯(lián)蛋白、以雙層磷脂-膽固醇膜復(fù)合到交聯(lián)蛋白膜上形成的雙層膜以及其它一些物質(zhì)已經(jīng)被用于包裹血紅蛋白液滴(Chang，T.M.S，1997，“Blood SubstitutesPrinciples，methods，products and clinical trial”，vol.I，Karser publisher，Basel)。然而，這些直徑大約1微米的人造細(xì)胞經(jīng)靜脈注射后，在宿主的循環(huán)系統(tǒng)中只能存活很短的一段時(shí)間。另外，這些人造細(xì)胞的多聚物膜會(huì)在體內(nèi)積累。
然后人們的研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到使用磷脂制備包含血紅蛋白的脂質(zhì)體(Chang，T.M.S，1997，“Blood SubstitutesPrinciples，methods，products and clinical trial”，vol.I，Karserpublisher，Basel)。使用亞微米磷脂-膽固醇微囊(脂質(zhì)體)可以延長(zhǎng)血紅蛋白在體內(nèi)循環(huán)時(shí)的存活時(shí)間(Djordjevich，L.et al.，1980，Exp.Hematol.8，584)。這些脂質(zhì)體的缺點(diǎn)是缺乏穩(wěn)定性和強(qiáng)度，而且磷脂膜對(duì)環(huán)境的降解具有敏感性。脂質(zhì)體在儲(chǔ)藏或在宿主循環(huán)系統(tǒng)中會(huì)降解。另外，磷脂膜在原本清除循環(huán)系統(tǒng)中的細(xì)菌和毒素的細(xì)胞中會(huì)積累，結(jié)果造成機(jī)體抵抗感染和毒素的能力顯著降低。
隨后，包含血紅蛋白的可生物降解的多聚物膜發(fā)展起來(lái)了，這種技術(shù)在本專(zhuān)利所引文獻(xiàn)中由本發(fā)明者的一個(gè)專(zhuān)利號(hào)為5,670,173的美國(guó)專(zhuān)利中已予以表述。在這里，制備了一個(gè)直徑大約150納米的可生物降解的聚乳酸膜(T.M.S.Chang and W.P.Yu，美國(guó)專(zhuān)利5,670,173，公布于1997年9月23日)。聚乳酸在使用后可轉(zhuǎn)變成水和二氧化碳，因此，不會(huì)在體內(nèi)積累。
如美國(guó)專(zhuān)利5,670,173號(hào)中所述，多聚物膜輸入受體后循環(huán)半衰期平均短于2小時(shí)。因此，出于實(shí)用的目的，如血液代用品，人們后來(lái)決定選擇使用具有較長(zhǎng)循環(huán)半衰期的可生物降解多聚物膜。
相應(yīng)的，人們高度希望獲得具有改善體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的多用途的可生物降解納米微囊。
同樣高度希望獲得具有至少6小時(shí)有效循環(huán)時(shí)間的可生物降解納米微囊。
進(jìn)一步希望獲得具有至少14小時(shí)有效循環(huán)時(shí)間的可生物降解納米微囊。
進(jìn)一步希望獲得具有至少24小時(shí)有效循環(huán)時(shí)間的可生物降解納米微囊。
還進(jìn)一步希望獲得能對(duì)有治療意義的試劑選擇性通透的多用途的可生物降解納米微囊。
還希望獲得適合包囊有治療意義的試劑并在體內(nèi)傳輸?shù)亩嘤猛镜目缮锝到饧{米微囊。
更進(jìn)一步希望獲得適合在體內(nèi)傳輸被包裹的有治療意義的試劑并以可控制速度釋放的納米微囊組分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種具有改善體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的多功能可生物降解納米微囊。本發(fā)明中的可生物降解納米微囊適合包裹有治療意義的試劑，并且適合在體內(nèi)傳輸此試劑。本發(fā)明中的可生物降解納米微囊可以被應(yīng)用于包裹多種有治療意義的試劑，包括，但不限于大分子物質(zhì)，如血紅蛋白、酶、多肽、基因、聚合蛋白和聚合酶如聚血紅蛋白等。
更適宜的是，本發(fā)明中的可生物降解納米微囊適合多種被包裹的有治療意義的試劑，包括大分子物質(zhì)，在進(jìn)入受體體內(nèi)后的可控制釋放。本發(fā)明中的納米微囊組分還適合包裹達(dá)到治療效果濃度的有治療意義的試劑，并傳輸此試劑進(jìn)入受體體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)。
另外，本發(fā)明中的納米微囊適于提供被包裹的有治療意義的試劑在體內(nèi)進(jìn)行可控制釋放。
依據(jù)本發(fā)明中一個(gè)實(shí)施例，提供了一種制備在體內(nèi)循環(huán)半衰期至少35小時(shí)的納米微囊的方法。這種納米微囊已經(jīng)顯示可傳輸一種范例大分子以可控制速率進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)，該大分子循環(huán)半衰期達(dá)到至少14小時(shí)。
依據(jù)本專(zhuān)利的許多新方法被用來(lái)以使納米微囊組分適于以可控制速率在體內(nèi)釋放包裹的大分子。例如，本發(fā)明中的一個(gè)納米微囊組分被改裝以適于將包裹的蛋白以半衰期2小時(shí)的逐步釋放方式改變成以半衰期至少24小時(shí)的速率釋放。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種可以改善體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的納米微囊組分，從而使包裹的有治療意義的試劑在體內(nèi)循環(huán)中保留較長(zhǎng)一段時(shí)間。這樣，本發(fā)明的納米微囊為體內(nèi)傳輸和控制釋放多種以此法包裹的有治療意義的試劑提供了一種通用的載體。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種具有改善體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的多用途的可生物降解納米微囊。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有至少35小時(shí)有效循環(huán)半衰期的可生物降解納米微囊膜。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有至少6小時(shí)有效循環(huán)半衰期的可生物降解納米微囊組分。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有至少14小時(shí)有效循環(huán)半衰期的可生物降解納米微囊組分。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有至少24小時(shí)有效循環(huán)半衰期的可生物降解納米微囊組分。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種可以選擇性地通透有治療意義的生物試劑的多用途的可生物降解納米微囊。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種適于多種有治療意義的試劑體內(nèi)可控制釋放或傳輸?shù)亩嘤猛镜目缮锝到饧{米微囊組分。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種制備具有改善體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的納米微囊組分的方法。
本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供一種體內(nèi)傳輸有治療意義的試劑的方法。
本發(fā)明提供了一種適合包裹有治療意義的試劑并增強(qiáng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的可生物降解的多聚納米微囊膜組分，所述的納米微囊膜組分由聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)的共聚物組成，此共聚物溶于丙酮，不溶于水。
本發(fā)明另一方面提供了一種血紅蛋白納米微囊組分，所述的組分是由包裹具有有效治療濃度的血紅蛋白制劑的一種可生物降解的多聚納米微囊膜組成；所述的納米微囊膜包含聚乳酸和聚乙二醇的共聚物；所述的共聚物溶于丙酮，不溶于水；其中所述的納米微囊組分適于增強(qiáng)所述的血紅蛋白制劑的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。
本發(fā)明中的血紅蛋白納米微囊組分可以包括其它一些已知的抑制高鐵血紅蛋白生成的生物試劑。而且，本發(fā)明中血紅蛋白納米微囊組分可以被調(diào)整成選擇性地通透體內(nèi)循環(huán)中存在的一些分子，從而阻止納米微囊內(nèi)的血紅蛋白轉(zhuǎn)變成高鐵血紅蛋白。
本發(fā)明的另一方面進(jìn)一步提供了一種制備具有延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的納米微囊組分的方法。所述的方法包括(a)制備聚乳酸和聚乙二醇的共聚物混合物(PLA-PEG)；(b)加熱所述的共聚物混合物；(c)加入包含有治療意義的試劑的水溶液到所述的共聚物混合物中；(d)從所述的水溶液中沉淀出所述的共聚物混合物；和(e)從那里提取納米微囊組分；這里所述的組分包括包裹了所述的有治療意義的試劑的可生物降解的多聚納米微囊膜。
本發(fā)明中制備具有延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的納米微囊組分的方法可以進(jìn)一步包括，將有治療意義的試劑在和聚乳酸-聚乙二醇共聚物混合物混合之前先與一交聯(lián)成分孵育。作為選擇和另外，本分明中制備納米微囊組分的方法可以進(jìn)一步包括至少交聯(lián)一部份包裹的有治療意義的試劑到納米微囊的內(nèi)表面上，其中交聯(lián)成分是在聚乳酸-聚乙二醇共聚物混合物和有治療意義的試劑混合后加入的。
本發(fā)明中的交聯(lián)成分可以是戊二醛。但是，業(yè)內(nèi)人士都知道別的交聯(lián)成份也是可以被應(yīng)用的。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面提供了一種可以延長(zhǎng)有治療意義試劑體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的傳輸系統(tǒng)。所述的系統(tǒng)包括一種可生物降解的多聚納米微囊組分，該組分由包裹有所述的有治療意義的試劑的共聚物膜組成；此處所述的共聚物膜包括一種聚乳酸和聚乙二醇的共聚物；這種共聚物溶于丙酮不溶于水；所述的共聚物膜適應(yīng)于傳輸已包囊的有治療意義的試劑以可控速率釋放進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)。
本發(fā)明還更進(jìn)一步提供了一套以逐級(jí)方式釋放有治療意義試劑的傳輸系統(tǒng)，所述的系統(tǒng)包括多種可生物降解多聚納米微囊組分，其中每一種微囊組分適應(yīng)于以預(yù)先確定的不同速率在體內(nèi)釋放包裹的所述的有治療意義的試劑；此處所述的每一種微囊組分包括一種由聚乳酸與聚乙二醇共聚物組成的共聚物膜，共聚物溶于丙酮不溶于水。
此外，本發(fā)明中的載藥系統(tǒng)也可適應(yīng)于選擇性地通透存在于受藥者體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的生物成分。本發(fā)明的具體實(shí)施例說(shuō)明，所包囊的有治療意義的試劑的質(zhì)量和完整性也能夠得以保持。
除此之外，本發(fā)明的載藥系統(tǒng)也可能適應(yīng)于把有治療意義的試劑與別的生物成分包裹在一起。按照本發(fā)明的另外一個(gè)具體實(shí)施例，載藥系統(tǒng)改進(jìn)的體內(nèi)穩(wěn)定性是通過(guò)部份包囊的藥或有治療意義的試劑交鏈到納米微囊內(nèi)表面所提供。
本發(fā)明也提供了一種包含可生物降解多聚納米微囊膜的納米微囊組分，該膜包囊了一種具有有效治療濃度的大分子；所述的納米微囊膜包含一種由聚乳酸與聚乙二醇組成的共聚物；所述的共聚物溶于丙酮不溶于水；此處所述的納米微囊組分適應(yīng)于提高所述的大分子的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。
下文定義了本發(fā)明所用的一些術(shù)語(yǔ)。
術(shù)語(yǔ)“治療性試劑”是指當(dāng)體內(nèi)給藥時(shí)有治療潛力的任何試劑，包括，但不僅限于大分子物質(zhì)，例如血紅蛋白、蛋白質(zhì)、酶、核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)和基因。


圖1以圖形的方式示出按照本發(fā)明所得的多種納米微囊組分的循環(huán)時(shí)間。
圖2以圖形的方式示出包囊于按照本發(fā)明所得的多種納米微囊組分中的Hb的保留時(shí)間。
圖3A和圖3B示出按照本發(fā)明所得的多種納米微囊組分的循環(huán)時(shí)間。
圖4示出按照本發(fā)明所得的多種納米微囊組分的循環(huán)時(shí)間。
圖5以圖形的方式示出非紅細(xì)胞的血紅蛋白(g/dl)歷時(shí)濃度。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了增加體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的改進(jìn)型的可生物降解的納米微囊。更為可取的是，本發(fā)明的可生物降解的納米微囊是多聚納米微囊。本發(fā)明的可生物降解的納米微囊適合于包囊有治療意義的試劑并將其輸入于受者體內(nèi)循環(huán)。此外，本發(fā)明的納米微囊組分適合于延長(zhǎng)所包囊的試劑的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。對(duì)于實(shí)際的治療應(yīng)用，例如血液代用品，納米微囊組分的體內(nèi)循環(huán)半衰期多于14小時(shí)為佳。因而，人們開(kāi)展了與本發(fā)明相關(guān)的廣泛研究和開(kāi)發(fā)以設(shè)計(jì)一種具有增加體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的納米微囊組分。此處說(shuō)明了一個(gè)新型的策略，以血紅蛋白為例但不僅限于血紅蛋白，以提供一種具有延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間并且/或者具有體內(nèi)可控釋放速率的血紅蛋白納米微囊組分。
本發(fā)明提供了一種新型的納米微囊組分，可適于包囊和有效地運(yùn)載有治療意義的試劑。例如，與血紅蛋白一起，納米微囊組分可被用作血液代用品。通過(guò)增加所包囊試劑的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，本發(fā)明的納米微囊組分可以顯著地增加包囊試劑在體內(nèi)發(fā)揮功能的持續(xù)時(shí)間，因而增加了該成分的治療效果。此外，本發(fā)明的納米微囊組分可以有效地以可控方式輸送給定劑量的有治療意義的試劑，從而提高了劑量的效果同時(shí)總起來(lái)也減少了給藥次數(shù)。
按照本專(zhuān)利所側(cè)重的方面，具有治療效果數(shù)量的血紅蛋白被包囊于一個(gè)納米微囊組分并適宜于輸送至受者體內(nèi)循環(huán)，在體內(nèi)循環(huán)中給藥。被包囊的血紅蛋白發(fā)揮血液代用品的功能在體內(nèi)運(yùn)載氧氣。而且，當(dāng)包囊的血紅蛋白從納米微囊膜釋放出來(lái)后，它繼續(xù)起到運(yùn)輸氧氣的功能，這樣就增加了包囊的血紅蛋白在體內(nèi)的作用總長(zhǎng)度。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種新型的載藥系統(tǒng)用來(lái)可控制地釋放有治療意義的試劑到體內(nèi)循環(huán)。這種通過(guò)修改或調(diào)整本發(fā)明的納米微囊組分從而達(dá)到以可控速率釋放被包裹試劑的可行性，提供了一種新型治療性的載藥系統(tǒng)。而且，本發(fā)明的多種納米微囊組分可一起聯(lián)用以提供一種有效的逐級(jí)治療性的載藥系統(tǒng)。按照本發(fā)明的這一方面，每一納米微囊組分適合于以預(yù)定的釋放速率傳輸所包囊的有治療意義的試劑。當(dāng)多種納米微囊組分同時(shí)輸入體內(nèi)時(shí)，因每一種具有其預(yù)定的釋放速率，這樣被包囊的有治療意義的試劑在體內(nèi)則會(huì)以逐步方式釋放。
按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，可生物降解的多聚納米微囊提供的體內(nèi)循環(huán)半衰期至少為35小時(shí)，這一點(diǎn)下文要進(jìn)行討論。本發(fā)明的納米微囊組分適合于包囊各種不同的治療試劑，包括大分子物質(zhì)，例如血紅蛋白、酶、RNA、DNA和包括非常大的聚血紅蛋白和酶在內(nèi)的其它蛋白質(zhì)，并且在體內(nèi)以可控的速率釋放這些治療試劑，因而提高了被包囊試劑的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。本發(fā)明的納米微囊組分更進(jìn)一步地作為具有有效治療濃度的治療試劑的載體，提供體內(nèi)控制釋放。按照本發(fā)明，有治療意義的試劑可以是但不限于大分子物質(zhì)。
按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，納米微囊可維持其體內(nèi)半衰期在35小時(shí)，我們能夠改變包裹的蛋白的釋放速率在大鼠中，從釋放速率半衰期2小時(shí)逐級(jí)改變到釋放速率半衰期至少24小時(shí)。正如下文繼續(xù)討論的，據(jù)信本發(fā)明獲得的納米微囊組分在人體內(nèi)的半衰期將會(huì)更長(zhǎng)。這樣，本發(fā)明就提供了一種可在體內(nèi)控制釋放各種有治療意義的試劑的多用途載藥系統(tǒng)。
舉例來(lái)說(shuō)，一個(gè)有治療意義的試劑可以被本發(fā)明的一種納米微囊組分包囊并通過(guò)任何一種納米微囊傳輸方法引入受者體內(nèi)循環(huán)。例如，本發(fā)明的納米微囊組分可以通過(guò)，但不僅限于，靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、或皮下傳輸，也可通過(guò)口腔或者皮膚吸收途徑給藥。納米微囊組分可以經(jīng)修飾以使被包囊的試劑以可控速率從納米微囊載體釋放。結(jié)果，有用的試劑被引入體內(nèi)循環(huán)，以可控速率釋藥來(lái)達(dá)到所希望的治療效果。如下文的示例，本發(fā)明納米微囊組分的釋放速率通過(guò)多種方式，使被包囊的治療性試劑達(dá)到期望的釋放速率。
按照本發(fā)明的例子說(shuō)明，把血紅蛋白包裹在納米微囊載體中，這樣在體內(nèi)獲得足夠長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間而達(dá)到治療效果是可能的。因而，可以充分預(yù)期，本發(fā)明的納米微囊組分事實(shí)上可以用來(lái)包囊包括具有有效治療濃度的任何有治療意義的試劑，其中包括大分子，來(lái)提供一個(gè)藥物控釋傳輸系統(tǒng)。
按照本發(fā)明，制備納米微囊組分的方法應(yīng)包括，但不僅限于此，改變納米微囊膜的通透性；降低納米微囊膜的降解速率；或增加被包囊的有治療意義的試劑的分子大小來(lái)適應(yīng)納米微囊組分從而維持一個(gè)期望的循環(huán)半衰期和/或控釋速率。
材料與方法材料聚乳酸聚乳酸(PLA)從Polysciences Inc.(加拿大)獲得。異丁基-2-氰基丙烯酸鹽(IBCA)，表面活性劑(Tween 20TM，Span 85TM，Triton X100TM，和Pluronic F68TM)，乙烷基纖維素和L-α-卵磷脂(氫化的)及其它磷脂，例如二甾酰卵磷脂(DSPC)或DSPG和醋酸生育酚從Sigma化學(xué)公司(USA)獲得。透析膜(Spectrapor 5TM)從Fisher科學(xué)公司購(gòu)買(mǎi)。二乙醚、乙酰乙酸、環(huán)己烷和氯仿從BDH化學(xué)公司(加拿大)購(gòu)買(mǎi)。所有其它化學(xué)藥品，例如，甲氧基聚乙二醇(分子量2000，分子量3350)和2-乙基己酸亞錫，均是試劑級(jí)。
方法制備血紅蛋白溶液無(wú)基質(zhì)血紅蛋白(Hb)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備(Chang，T.M.S，1997，“Blood SubstitutesPrinciples，methods，products and clinical trial”，vol.I，Karser publisher，Basel)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，無(wú)基質(zhì)血紅蛋白是通過(guò)低滲溶牛血細(xì)胞，并通過(guò)甲苯抽提、高速離心凈化來(lái)制得。最終溶液含有10-15g Hb/dl。為了減少高鐵血紅蛋白的形成，操作過(guò)程在4℃下進(jìn)行，血紅蛋白溶液的pH值控制在7.4。
制備可生物降解的多聚納米微囊組分(標(biāo)準(zhǔn)方法)有機(jī)相溶解100mg(d.l)-聚乳酸(分子量為25000)(購(gòu)自Polysciences，Warrington，PA)在8毫升(ml)的丙酮中。在超聲波水浴器(非常低的能量)中溶解50毫克(mg)氫化的大豆卵磷脂(購(gòu)自Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)于4毫升乙醇中。上述兩溶液混合后(加入任何一種至另一種)，用做有機(jī)相。
水相取0.04毫升Tween 20與25毫升的15％(g/dl)的血紅蛋白溶液相混合。
制備在磁力攪拌下[用Thermo-Swirl攪拌器(制造商為Precision Scientific Co.，Chicago)，設(shè)置于6檔]，于4℃下將有機(jī)相緩慢(8毫升/分鐘)注入水相。注射頭用0.2毫升的移液管頭制得。納米微囊立刻形成，但是，繼續(xù)維持?jǐn)嚢钁腋∫?5分鐘。所得的懸浮液為37毫升。在20℃和真空下通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀從上述懸浮液中除去部份有機(jī)溶劑，用時(shí)大約10分鐘。這樣就獲得了33毫升的懸浮液(即除去4毫升有機(jī)溶劑)。剩余的懸浮液與15毫升的0.9％NaCl相混合。然后，有機(jī)溶劑和游離的血紅蛋白通過(guò)超濾除去(用AmiconZM 500,000膜，分子量截留值為500,000)。懸浮液用0.9％NaCl通過(guò)超濾重復(fù)洗凈。整個(gè)操作在4℃和氮?dú)獗Ｗo(hù)下完成。
按照上述標(biāo)準(zhǔn)程序制備的納米微囊膜組分，經(jīng)過(guò)按下文所述修改，用來(lái)提供具有改進(jìn)循環(huán)時(shí)間和控制釋放速率的本發(fā)明所述的納米微囊組分。
以下文例子為證，例II列出了制備具有循環(huán)半衰期35小時(shí)的納米微囊的方法。在該例中，盡管納米微囊本身的循環(huán)時(shí)間半衰期為35小時(shí)，但所包裹物被發(fā)現(xiàn)會(huì)從納米微囊漏出，其半衰期為2小時(shí)或更短。例III以對(duì)例II中膜特性修飾為示例，這種修飾后的納米微囊可以保持被包囊的試劑存活更長(zhǎng)時(shí)間。例IV示例了更進(jìn)一步的修飾導(dǎo)致改進(jìn)了被包囊試劑的保留時(shí)間。例IV結(jié)合了下述兩種修飾方法(1)例II和例III中納米微囊膜的修飾方法；(2)對(duì)被包裹的試劑本身的修飾，例如以不同的聚合度交聯(lián)大分子以在包裹之前提供較大的分子質(zhì)量。每一個(gè)范例中都描述了修飾的細(xì)節(jié)。例II到IV中每一個(gè)范例都有許多不同的修飾方法和策略。
參考下列給定的范例來(lái)說(shuō)明但不是限制它的范圍將會(huì)更容易理解本發(fā)明。
例I標(biāo)準(zhǔn)多聚納米微囊的制備我們首先改變五種多聚納米微囊的膜組成，研究它們對(duì)循環(huán)時(shí)間的作用。
(1)聚乳酸(PLA)納米微囊由上文提到的制備標(biāo)準(zhǔn)納米微囊的方法制得。這些聚乳酸納米微囊顯示了大約2個(gè)小時(shí)的循環(huán)半衰期(見(jiàn)圖1)。
(2)把磷脂加入由標(biāo)準(zhǔn)方法制備的納米微囊聚合膜中僅會(huì)引起循環(huán)時(shí)間的輕微增加(此項(xiàng)在圖1沒(méi)有顯示)。在這里，氫化大豆卵磷脂(HSPC)和二硬脂酰卵磷脂(DSPC)被引入到了聚乳酸納米微囊中。
(3)把磷脂-聚乙二醇(PEG)引入到納米微囊的多聚膜中并沒(méi)有使體內(nèi)循環(huán)時(shí)間明顯增加(見(jiàn)圖1-PLA+PEG-脂質(zhì)曲線)。這里，1，2二硬脂酰甘油-3-磷酸二乙胺-N-聚乙二醇2000被引入到聚乳酸納米微囊膜中。
(4)本發(fā)明也研究了納米微囊對(duì)聚乙二醇的吸收。7％的聚乙二醇(分子量15000)被加入到聚乳酸納米微囊中，置于混懸液中6小時(shí)。不幸的是，這樣在循環(huán)時(shí)間上并沒(méi)有引起明顯增加(見(jiàn)圖1-聚乙二醇吸附到聚乳酸上的曲線)。
(5)混合10克甲氧基聚乙二醇(分子量2000)和10克DL-乳酸，并在160℃和氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌，制得標(biāo)準(zhǔn)聚乳酸-聚乙二醇共聚物。然后加入50微升的2-乙基己酸亞錫，在160℃下恒溫下保持3小時(shí)。然而，該聚合物溶于水，因此不能用于血紅蛋白聚乳酸納米微囊中。這種組成被認(rèn)為不適用封裝水溶性大分子到納米微囊中。
例II包裹血紅蛋白的納米微囊組分的制備(1)有機(jī)相溶解100毫克如下文制備而得(見(jiàn)方法2)的聚乳酸-聚乙二醇共聚物到8毫升丙酮中。在超聲水浴(非常低的能量)中溶解50毫克氫化大豆卵磷脂(購(gòu)自Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)到4毫升乙醇中。上述兩種溶液混合，作為有機(jī)相使用。
(2)水相取0.04毫升TWEEN 20，與25ml 15％(g/dl)血紅蛋白溶液混合。
(3)制備4℃時(shí)，在磁力攪拌下〔Thermo-Swirl攪拌器(制造商為Precisoin ScientificCo.，Chicago)，設(shè)定在6檔〕，緩慢注射(8毫升/分鐘)有機(jī)相到水相中(注射頭由0.2ml移液管頭制成)。納米微囊立即形成，但是，繼續(xù)攪拌懸浮液15分鐘。制備的懸浮液為37毫升。
用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在20℃下經(jīng)大約10分鐘脫除上述懸浮液中的部份有機(jī)溶劑。獲得的懸浮液為33毫升(也就是說(shuō)，脫除了4毫升有機(jī)溶劑)。剩下的懸浮液與15毫升0.9％NaCl混合。然后有機(jī)溶劑和游離的血紅蛋白用超濾裝置除去(用Amicon ZM 500,000膜，分子量截留在500,000)。懸浮液通過(guò)超濾反復(fù)用0.9％NaCl溶液沖洗。
操作在4℃和氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。
隨后確定了一個(gè)適宜的納米微囊聚合物應(yīng)溶于丙酮而不溶于水。我們對(duì)下面的新共聚物經(jīng)過(guò)了研究，希望能用于本發(fā)明中的納米微囊的制備方法1-1克D，L-聚乳酸(分子量10,000)和0.5克聚乙二醇(分子量3350)在真空中干燥過(guò)夜，加入5毫升丙酮，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將混合物加熱到100℃等待1小時(shí)。加入20微升的2-乙基己酸亞錫后，混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下升溫到180℃等待6小時(shí)。最終的聚合物溶于丙酮。這種共聚物隨后與血紅蛋白一起以上文所述方法用來(lái)制備可降解納米微囊組分。然而，這種聚乳酸-聚乙二醇共聚物的制備(PEG-PLA方法1)并沒(méi)有足夠地增加循環(huán)半衰期(見(jiàn)圖1)。
方法2-1.5克DL-聚乳酸(分子量10,000)和0.75克甲氧基聚乙二醇(分子量2000)在真空中干燥過(guò)夜。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加溫到180℃保持2小時(shí)。在加入10微升的2-乙基己酸亞錫之后，混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加溫到180℃保持3小時(shí)。最終的聚合物溶于丙酮。如上文所述，這種共聚物隨后與血紅蛋白一起以上文所述方法用來(lái)制備可降解納米微囊組分。我們將該制品(PLA-PEG方法2)用于大鼠，測(cè)得循環(huán)半衰期大約35小時(shí)(見(jiàn)圖1)。因此，這種聚乳酸-聚乙二醇共聚物可以作為新的改進(jìn)型可生物降解多聚納米微囊的候選物。
方法3-我們進(jìn)行了另一項(xiàng)研究以測(cè)定使用更高分子量的聚乙二醇是否能進(jìn)一步增加循環(huán)時(shí)間。將2克DL-聚乳酸(分子量10,000)和1克聚乙二醇(分子量3350)在真空中干燥過(guò)夜，加入5毫升丙酮，混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加溫到100℃保持1小時(shí)。然后，混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加溫到180℃保持10小時(shí)。此共聚物溶于丙酮。此共聚物隨后與血紅蛋白一起按上文所述方法用來(lái)制備可生物降解納米微囊組分，這種制備并沒(méi)有足夠地增加循環(huán)半衰期(圖1)。
例III采用PLA-PEG共聚物作為納米微囊載體當(dāng)我們獲得具有充分循環(huán)半衰期的納米微囊后，我們隨后以血紅蛋白這個(gè)大分子為例來(lái)研究這種納米微囊制品。根據(jù)上述我們獲得的具有35小時(shí)循環(huán)半衰期的聚乳酸-聚乙二醇共聚物制品(方法2)，我們進(jìn)一步研究了這一制品用作在體內(nèi)傳輸血紅蛋白的納米微囊膜載體。根據(jù)本發(fā)明，血紅蛋白作為大分子的一個(gè)例子用來(lái)表明本發(fā)明中納米微囊可作為有治療意義試劑的載體的特性。然而，本發(fā)明并不僅限于血紅蛋白。
我們成功得制備了血紅蛋白納米微囊(如上文所述)。
這些納米微囊顯示了大約35小時(shí)的循環(huán)半衰期，類(lèi)似于那些不含血紅蛋白的納米微囊。然而，微囊化的血紅蛋白在注入體內(nèi)循環(huán)后有滲漏的跡象，并且滲漏后很快消失。在納米微囊載體中的血紅蛋白組分的循環(huán)半衰期小于2小時(shí)，然而，納米微囊本身繼續(xù)循環(huán)，半衰期為35小時(shí)，納米微囊的膜慢慢地降解和變得泄漏。
如表1所示，我們采用了各種方法解決本發(fā)明中大分子組分從納米微囊中滲漏的問(wèn)題。血紅蛋白納米微囊是用已詳細(xì)敘述的制備聚乳酸-聚乙二醇納米微囊的方法制備而得。隨后，得到的血紅蛋白納米微囊用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)。這樣做的目的是在納米微囊內(nèi)部交聯(lián)血紅蛋白以產(chǎn)生更大分子，比如聚血紅蛋白，從而降低它們從納米微囊中釋放的速率。另外，血紅蛋白分子在納米微囊內(nèi)表面附近交聯(lián)，這樣就降低了納米微囊膜的滲透性。表1以血紅蛋白為例，顯示了為變化本發(fā)明中納米微囊組分釋放速率所采用的多種途徑，包括改變(1)以交聯(lián)基團(tuán)與血紅蛋白之比所表示的戊二醛的量；(2)以交聯(lián)時(shí)間表示的交聯(lián)過(guò)程的持續(xù)程度和(3)所使用的戊二醛的濃度。所得到的血紅蛋白聚乳酸-聚乙二醇納米微囊的循環(huán)半衰期如T1/2列所示。
表1用于增加血紅蛋白在聚乳酸-聚乙二醇納米微囊內(nèi)保留時(shí)間的實(shí)驗(yàn)步驟


當(dāng)提高交聯(lián)時(shí)間到5小時(shí)，交聯(lián)試劑的濃度到0.5M時(shí)，血紅蛋白聚乳酸-聚乙二醇納米微囊的循環(huán)半衰期就增加到16小時(shí)(見(jiàn)圖2)。與未交聯(lián)的血紅蛋白納米微囊的循環(huán)時(shí)間為2小時(shí)相比，這是一個(gè)重大的改進(jìn)。這比交聯(lián)血紅蛋白溶液在大鼠體內(nèi)循環(huán)時(shí)間8到12小時(shí)要長(zhǎng)。更進(jìn)一步，因?yàn)樵诖笫篌w內(nèi)的循環(huán)半衰期一般要比在人體內(nèi)短很多，這個(gè)結(jié)果提示以本發(fā)明所使用的納米微囊組分可在人體內(nèi)顯著提高循環(huán)半衰期。然而，我們將繼續(xù)設(shè)計(jì)新的途經(jīng)來(lái)降低血紅蛋白注入體內(nèi)后從納米微囊中釋放的速率。
血紅蛋白納米微囊的交聯(lián)步驟為了強(qiáng)化納米微囊膜，我們采用包括交聯(lián)在內(nèi)的不同方法。下面所列表2顯示了不同方法的研究概述，并在圖3A和3B中得到了表明。
表2總結(jié)了更進(jìn)一步研究納米微囊強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)，這些研究運(yùn)用了表1中所提及的交聯(lián)聚乳酸-聚乙二醇血紅蛋白微囊的方法。如表2所示，“Xlink”指表1中戊二醛和血紅蛋白的比例；“PLA-PEG”是指制備聚乳酸-聚乙二醇血紅蛋白納米微囊中聚乳酸/聚乙二醇的分子量；“交聯(lián)時(shí)間”指與交聯(lián)劑的交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間；“分離”指如前所述的制備聚乳酸-聚乙二醇血紅蛋白納米微囊的詳細(xì)方法中濃縮納米微囊的步驟；“乙醇”指制備過(guò)程中使用乙醇的情況。表2的第一列提供了列2到6的結(jié)果總結(jié)。比如15KX(12∶1)0.25F是指聚乳酸的分子量為15Kd(戊二醛與血紅蛋白比率為12∶1)，反應(yīng)時(shí)間為0.25小時(shí)，通過(guò)過(guò)濾分離。
表2


血紅蛋白納米微囊的循環(huán)時(shí)間200克大鼠的全血量大約為12毫升。30％的最高負(fù)荷量是注入大鼠占總血量30％的納米微囊混懸液，也就是3.5毫升。30％的最高負(fù)荷量的結(jié)果顯示在圖3A和3B中。圖3A和圖3B顯示了用表2的方法所得到的循環(huán)時(shí)間，這些循環(huán)時(shí)間的最好結(jié)果是當(dāng)所用納米微囊組分中的聚乳酸的分子量范圍在5K-15K區(qū)間時(shí)取得的。
如圖3A和3B所示，在最初的6個(gè)小時(shí)，血紅蛋白納米微囊循環(huán)得很好。然而，當(dāng)注入后24小時(shí)后取樣分析，血紅蛋白納米微囊只剩下15％-25％。納米微囊組分的半衰期從原來(lái)的小于2小時(shí)(見(jiàn)5K曲線)提高到大約14-16小時(shí)。
生物降解能力使用透析膠吸收方法可將游離的血紅蛋白和游離的交聯(lián)血紅蛋白與聚乳酸-聚乙二醇血紅蛋白納米微囊分離開(kāi)來(lái)。當(dāng)把注入體內(nèi)2小時(shí)后的血紅蛋白納米微囊樣品置于這個(gè)裝置中，沒(méi)有游離的血紅蛋白被分離出來(lái)，表明血紅蛋白納米微囊保持完整狀態(tài)。當(dāng)在透析管中把血紅蛋白納米微囊混于血漿，在6小時(shí)后沒(méi)有游離的血紅蛋白被提取出來(lái)。在這之后，游離的血紅蛋白慢慢地出現(xiàn)于懸置液中，被凝膠所萃取，顯示在血漿中六小時(shí)后由于生物降解，聚乳酸膜的完整性開(kāi)始緩慢得到破壞。
聚合物組成鑒于聚乳酸的分子量越大，生物降解越緩慢，分子量為15-25K的聚乳酸被用來(lái)制備聚乙二醇-聚乳酸共聚物。使用更高分子量的聚乳酸要求加熱到200℃來(lái)完成聚乙二醇-聚乳酸共聚反應(yīng)，這樣有可能導(dǎo)致聚乳酸分子的分解。以聚苯乙烯為標(biāo)準(zhǔn)的體積排阻色譜，Mn＝6900，Mw＝8600，Mz＝7000，Mw/Mn＝1.24顯示聚乳酸-聚乙二醇共聚物的分子量減少到只有6900。于是，我們觀察到了聚乳酸分子的大幅度分解。
從分子量15000到25000的聚乳酸得到的結(jié)果在圖4A及4B中列舉了出來(lái)。除了下面要討論的15K聚血紅蛋白的個(gè)例(見(jiàn)15K聚血紅蛋白曲線)，我們沒(méi)有觀察到循環(huán)周期的延長(zhǎng)。
例IV帶有聚血紅蛋白的聚乳酸-聚乙二醇共聚納米微囊的應(yīng)用聚血紅蛋白是以血紅蛋白分子聚合形成的尺寸較大的大分子。最好每個(gè)聚血紅蛋白是由4至5個(gè)血紅蛋白分子通過(guò)化學(xué)鍵連接在一起。
我們已經(jīng)表明聚乙二醇-聚乳酸納米微囊(空的或裝有血紅蛋白的)的循環(huán)半衰期為35個(gè)小時(shí)。然而，由于隨著時(shí)間流逝微囊內(nèi)部血紅蛋白的泄漏，在血紅蛋白納米微囊中的血紅蛋白的循環(huán)半衰期會(huì)相對(duì)較短些。因此，我們研究了包裹分子量大約在240000到360000之間的聚血紅蛋白的應(yīng)用前途。與較小的分子量大約64000的內(nèi)源血紅蛋白相比，這樣會(huì)面臨較少的泄漏問(wèn)題。正如圖4A和4B中15K聚血紅蛋白曲線所示，這樣明顯地把循環(huán)半衰期從原來(lái)的1-2小時(shí)延長(zhǎng)到了14個(gè)小時(shí)。因此，本發(fā)明提供了延長(zhǎng)包裹有治療意義試劑的納米微囊組分體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的方法。比如，一個(gè)大分子能夠交聯(lián)以形成更大的分子并隨后被本發(fā)明所述的一種納米微囊組分所包裹。此外，其它有意義的大分子也可與血紅蛋白混合以形成聚血紅蛋白復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明，交聯(lián)有治療意義的試劑可以在封入微囊前或后進(jìn)行。另外，被包裹的試劑也可以被交聯(lián)到納米微囊膜的內(nèi)表面上。
(1)含有較少單體血紅蛋白分子的聚血紅蛋白的應(yīng)用我們研究了膜組分的變化以改進(jìn)納米微囊的循環(huán)時(shí)間以及改善在循環(huán)中納米微囊內(nèi)血紅蛋白的保留情況。結(jié)果，我們把注意力集中到制備注入體內(nèi)后能夠保持一定血紅蛋白水平以攜氧的納米微囊上。這是通過(guò)前面方法所述降低納米微囊的生物降解性，改變微囊的滲透性，比如用交聯(lián)試劑交聯(lián)某些被包裹試劑到納米微囊膜上和/或使用較大分子用以被納米微囊所包裹來(lái)改進(jìn)血紅蛋白納米微囊的。結(jié)果，本發(fā)明的納米微囊組分適于提供(1)被包裹試劑在體內(nèi)的更高起始濃度，以及(2)延長(zhǎng)被包裹試劑的循環(huán)時(shí)間。
在前面的研究中，我們分析了血紅蛋白濃度的消逝曲線的斜率并外推至零點(diǎn)以計(jì)算循環(huán)半衰期。這種方法可用于比較和篩選用不同配方制成的大量不同種血紅蛋白納米微囊。但是，這種分析方法更適于觀察載藥系統(tǒng)的釋放速度。按照本發(fā)明的其中一個(gè)方面，我們研究了在循環(huán)中供氧的血紅蛋白的實(shí)際量。相應(yīng)地測(cè)定了在循環(huán)中存留的血紅蛋白的實(shí)際量而不是曲線的斜率。
運(yùn)用60毫升/千克作為大鼠的血液容量，并已知輸入的血紅蛋白納米微囊的量，就可以算出每次輸入后血紅蛋白的可能最高量。然后，就可跟蹤血紅蛋白在循環(huán)中的濃度。我們知道血紅蛋白血漿代用品在大鼠體內(nèi)的循環(huán)半衰期要比在人體內(nèi)短很多。因此，我們做出了把在大鼠身上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要性推廣到人時(shí)所需的基線標(biāo)準(zhǔn)。我們同時(shí)還進(jìn)行了由戊二醛交聯(lián)的聚血紅蛋白的研究。已知這些聚血紅蛋白在人體內(nèi)的循環(huán)半衰期是大約24小時(shí)，我們獲得了外推到人的直接理論基礎(chǔ)。但是，我們知道大鼠具有較為活躍的網(wǎng)狀皮內(nèi)細(xì)胞系統(tǒng)(RES)，用于除去像納米微囊這樣的微粒。因此，當(dāng)將血紅蛋白納米微囊外推到人時(shí)，循環(huán)半衰期會(huì)比實(shí)際在老鼠體內(nèi)的時(shí)間還要長(zhǎng)得多。
(2)應(yīng)用聚血紅蛋白的基線研究為了得到有效的對(duì)比，所有用大鼠的研究實(shí)驗(yàn)方案相同。聚血紅蛋白和血紅蛋白納米微囊懸浮液都調(diào)整到具有相同的10g/dl的血紅蛋白濃度。聚血紅蛋白和血紅蛋白納米微囊的輸入體積相同，并且都是總血量的30％(即30％的最高負(fù)荷量)。
表3表明在大鼠體內(nèi)使用30％最高負(fù)荷量的聚血紅蛋白制品(血紅蛋白含量為10g/dl)的結(jié)果是最大非紅細(xì)胞血紅蛋白濃度為3.35g/dl，在14小時(shí)內(nèi)降低到1.67g/dl，為其最高濃度的一半〔見(jiàn)聚血紅蛋白(17∶1)〕。從這里開(kāi)始，聚血紅蛋白(17∶1)作為基線與其它血紅蛋白的制品進(jìn)行比較，包括比較不同方法制備的非紅細(xì)胞血紅蛋白循環(huán)達(dá)到濃度1.67g/dl所用的時(shí)間。因此，在聚血紅蛋白(10∶1)的例子里，最高非紅細(xì)胞血紅蛋白濃度是3.10g/dl，在10.4小時(shí)內(nèi)降低到了1.67g/dl。
使用30％最高負(fù)荷量的包裹血紅蛋白(10∶1)的結(jié)果是最高非紅細(xì)胞血紅蛋白水平只有3.05g/dl(標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.03)(見(jiàn)表3)。這里的血紅蛋白先通過(guò)戊二醛交聯(lián)，所用戊二醛與血紅蛋白的比例為10∶1，然后再由聚乳酸-聚乙二醇納米微囊包裹。非紅細(xì)胞血紅蛋白濃度在大鼠內(nèi)經(jīng)過(guò)12.3小時(shí)降低到1.67g/dl(等同于人體內(nèi)21小時(shí))。
基于體重、血液體積、血漿體積以及稀釋系數(shù)的計(jì)算表明血紅蛋白納米微囊的最高非紅細(xì)胞血紅蛋白濃度至少是3.6g/dl，而不是在表3中包裹血紅蛋白(10∶1)的3.05g/dl。這似乎表明輸入的血紅蛋白納米微囊的相當(dāng)一部分(大約16％)在幾乎剛輸入后就被除去了。因此，下一步工作是要嘗試避免這種情況。
在以上的制備中，血紅蛋白在被包入納米微囊前首先交聯(lián)成聚血紅蛋白。
聚血紅蛋白較大的分子尺寸會(huì)延遲血紅蛋白在循環(huán)過(guò)程中因?yàn)榧{米微囊膜的降解而泄漏，從而延長(zhǎng)其循環(huán)半衰期(見(jiàn)表3)。以聚血紅蛋白(10∶1)為基礎(chǔ)，我們更詳細(xì)地分析了上述聚血紅蛋白制品中的聚血紅蛋白的分子質(zhì)量分布。隨后，如下文例子所述，我們提高了聚合程度來(lái)明顯降低單四聚體血紅蛋白的量(見(jiàn)聚血紅蛋白17∶1)，然后再進(jìn)行包裹。
(i)“包裹血紅蛋白(17∶1)”配方在下面關(guān)于血紅蛋白納米微囊的配方中，我們用到了聚血紅蛋白“包裹血紅蛋白(17∶1)”。在此配方中，交聯(lián)試劑(戊二醛)與血紅蛋白的比例在交聯(lián)反應(yīng)以形成聚血紅蛋白過(guò)程中為17∶1。100毫克聚乳酸-聚乙二醇共聚物和50毫克磷脂溶解于3毫升乙醇和6毫升丙酮的混合溶液中。然后，該溶液在連續(xù)磁力攪拌下被緩慢注入到25毫升上述含有0.24％的Tween20的聚血紅蛋白溶液中。乙醇和丙酮擴(kuò)散入水相就形成微粒。在4℃下通過(guò)在鹽溶液中的透析，就能容易地除去水相中的乙醇和丙酮。
表3


正如表3中所示，灌輸2分鐘后，最高非紅細(xì)胞血紅蛋白濃度是3.58g/dl(標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.04)。這明顯高于前面所講的血紅蛋白納米微囊[包裹血紅蛋白(10∶1)]的3.05g/dl(標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.04)。這也接近非紅細(xì)胞血紅蛋白濃度的最高可能起始值。此外，消逝曲線的斜率也更慢，但更重要的是與早前血紅蛋白納米微囊(包裹血紅蛋白(10∶1)在大鼠和人體內(nèi)分別是12.3和21.1小時(shí)相比，非紅細(xì)胞血紅蛋白水平在老鼠和人體內(nèi)分別用了17.1和29.3小時(shí)才降低到1.67g/dl。這個(gè)非常明顯的增長(zhǎng)通過(guò)逐步改變配方的方式更進(jìn)一步得到提高，直到達(dá)到最大濃度3.66g/dl(標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.03)，以及通過(guò)24.2小時(shí)(大鼠)或41.5小時(shí)(人)后才降到1.67g/dl(例如，從包裹血紅蛋白1.5 Conc.(5k)到包裹血紅蛋白1.5 Conc.(15k)XL)。
(ii)“1.5 Conc(5k)”配方“1.5 Conc(5k)”配方是由與上面“包裹血紅蛋白(17∶1)”配方相似的方法制備的，只是聚乳酸-聚乙二醇共聚物的濃度提高到1.5，以得到一個(gè)更厚的納米微囊膜，使其生物降解較慢，從而能夠具有較長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間。其結(jié)果是循環(huán)時(shí)間得到了進(jìn)一步延長(zhǎng)。輸入樣品2分鐘后，非紅細(xì)胞血紅蛋白的最大值達(dá)到3.60g/dl(標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.01)，而較早的血紅蛋白納米微囊只有3.05g/dl(標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.04)(見(jiàn)表3)。消逝曲線的斜率情況也變得更慢，但更重要的是非紅細(xì)胞血紅蛋白水平在老鼠與人的體內(nèi)分別經(jīng)過(guò)20.0和34.3小時(shí)降低到1.67g/dl的水平(見(jiàn)圖5)。
(iii)“2.0 Conc(5k)”配方“2.0 Conc(5k)”配方是在上述“1.5 Conc(5k)”配方的基礎(chǔ)上，提高了聚合物的濃度用以更進(jìn)一步改進(jìn)納米微囊膜穩(wěn)定性。然而，這種方式形成的血紅蛋白納米微囊存在聚集成團(tuán)的傾向，因此沒(méi)有被選中用于動(dòng)物試驗(yàn)。
(iv)“1.0 Conc(5k)(XL-Ecap，XL4)”配方在血紅蛋白納米微囊懸浮液形成后向其中加入戊二醛來(lái)修飾“包裹血紅蛋白(17∶1)”配方，這樣就形成了“1.0 Conc(5k)(XL-Ecap，XL14)”配方。這種配方中通過(guò)交聯(lián)任何血紅蛋白納米微囊表面血紅蛋白以進(jìn)一步改進(jìn)膜的穩(wěn)定性。如表3中所示的血紅蛋白納米微囊“包裹血紅蛋白(17∶1)”經(jīng)過(guò)如下的進(jìn)一步處理。把交聯(lián)劑戊二醛加入到血紅蛋白納米微囊懸浮液，這就交聯(lián)了任何靠近納米微囊表面的血紅蛋白以進(jìn)一步增強(qiáng)納米微囊膜的穩(wěn)定性。24小時(shí)后向其中加入2M的賴(lài)氨酸(賴(lài)氨酸/血紅蛋白摩爾比為100∶1)來(lái)中止血紅蛋白的聚合。這種方法與“1.5 Conc(5k)”配方中使用1.5倍濃度聚合物延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間的程度相同。這樣，在輸入2分鐘后，最高非紅細(xì)胞血紅蛋白濃度同樣有很明顯地提高為3.60g/dl(標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.01)，而前面所述的血紅蛋白納米微囊時(shí)的濃度3.05g/dl(標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.04)(見(jiàn)表3)。消逝曲線的斜率也非常緩慢，但是更重要的是非紅細(xì)胞血紅蛋白水平在老鼠和人體內(nèi)分別經(jīng)歷20.3和34.8小時(shí)才降到1.67g/dl(見(jiàn)表3和圖5)。
(v)“1.0 Conc(15k)”配方我們同樣研究了通過(guò)提高聚乳酸分子量來(lái)改善血紅蛋白納米微囊膜穩(wěn)定性的可能。為此，我們用15k聚乳酸替代了“包裹血紅蛋白(17∶1)”配方中的5k聚乳酸。結(jié)果與“包裹血紅蛋白(17∶1)”配方相比，我們觀察到循環(huán)半衰期明顯的延長(zhǎng)。因此，輸入2分鐘后，與早前血紅蛋白納米微囊的3.05g/dl(標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.04)相比，這里非紅細(xì)胞血紅蛋白的最高濃度是3.57g/dl(標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.05)。消逝曲線的斜率也變得很慢，但更重要的是非紅細(xì)胞血紅蛋白水平在老鼠和人體內(nèi)分別經(jīng)過(guò)21.2和36.6小時(shí)才降低到1.67g/dl的水平(見(jiàn)表3，圖5)。
(vi)“1.5 Conc(15k)”配方我們緊接著既使用較高分子量的聚乳酸(15K)也提高了聚合物的濃度(提高到1.5倍)。這是通過(guò)使用上面所述“1.0 Conc.(15k)”配方，所不同的是使用1.5倍的聚合物濃度。這種配方結(jié)合了下述三個(gè)方面(1)使用含單個(gè)四聚體血紅蛋白量低的特制的聚血紅蛋白(2)使用1.5倍濃度的聚乳酸-聚乙二醇共聚合物以及(3)使用了大分子量的聚乳酸(15k)。
這樣就更進(jìn)一步地明顯延長(zhǎng)了循環(huán)周期。在輸入2分鐘后，與前面血紅蛋白納米微囊的3.05g/dl(標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.04)相比，非紅細(xì)胞血紅蛋白的最高濃度是3.6458g/dl(標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.02)。消逝曲線的斜率也變得很慢，但更重要的是非紅細(xì)胞血紅蛋白水平在老鼠和人體內(nèi)分別經(jīng)過(guò)23.3和39.9小時(shí)才降低到1.67g/dl的水平(見(jiàn)表3，圖5)。
(vii)“1.5 Conc(15k)(XL-Ecap，XL4)”配方最終，我們結(jié)合了所有上述可以增加循環(huán)時(shí)間的方法(1)利用含單四聚體血紅蛋白量低的特制聚血紅蛋白；(2)利用1.5倍濃度聚乳酸-聚乙二醇共聚物；(3)利用更大分子量(15k)的聚乳酸以及(4)用戊二醛進(jìn)一步交聯(lián)血紅蛋白納米微囊。
當(dāng)以上因素中只有3種共同作用時(shí)，循環(huán)周期與前面相比略有延長(zhǎng)。因此，在輸入2分鐘后，與早前血紅蛋白納米微囊的3.05克/100毫升(標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.04)相比，非紅細(xì)胞血紅蛋白的最大濃度是3.6583g/dl(標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.03)，消逝曲線的斜率也相對(duì)慢得很多，但更重要的是，非紅細(xì)胞血紅蛋白水平在大鼠和人體內(nèi)分別經(jīng)過(guò)24.2和41.5小時(shí)才降低到1.67g/dl(見(jiàn)表3，圖5)。
如果把上述結(jié)果類(lèi)推到人體，可以預(yù)期，最近描述的血紅蛋白納米微囊(“1.5 Conc(15k)(XL-Ecap，XL4)”配方)的有功能活性的循環(huán)半衰期將達(dá)到41小時(shí)。這是一個(gè)非常明顯且重要的對(duì)循環(huán)半衰期的延長(zhǎng)，可以使被包裹的血紅蛋白具有更長(zhǎng)時(shí)間的功能，從而提供了一種非常有前景的血液替代品。與聚血紅蛋白相比，血紅蛋白納米微囊在人體內(nèi)可能有更長(zhǎng)的循環(huán)周期。這是因?yàn)槔鲜蟮木W(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)(RES)在除去像納米微囊這樣的微粒方面比清除聚血紅蛋白溶液效率更高。聚血紅蛋白納米微囊的另外一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于即使聚血紅蛋白在輸入后泄露，它仍將繼續(xù)發(fā)揮作用，不會(huì)導(dǎo)致任何副作用。完全可以預(yù)計(jì)，本發(fā)明的納米微囊可用作其它修飾血紅蛋白，包括重組血紅蛋白和其它有治療意義的試劑的有用載體。
例V高鐵血紅蛋白的阻止和轉(zhuǎn)化隨著在體內(nèi)37℃下循環(huán)的血紅蛋白量的增加，高鐵血紅蛋白的量會(huì)穩(wěn)定增長(zhǎng)。在紅細(xì)胞內(nèi)，酶系統(tǒng)阻止了血紅蛋白向高鐵血紅蛋白的氧化。在缺少這些酶的情況下，高鐵血紅蛋白隨著體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的增加而形成。相應(yīng)地，當(dāng)血紅蛋白應(yīng)用于本發(fā)明中涉及的納米微囊時(shí)，本發(fā)明提供的另外的實(shí)施例可用來(lái)抑制高鐵血紅蛋白的累積。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是把所有正常存在于紅細(xì)胞中的酶與血紅蛋白一起放入納米微囊。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是提供了一種納米微囊的組分，該組分對(duì)于一些外部因子，如自然存在于血液中可以在體內(nèi)抑制高鐵血紅蛋白累積的維生素C或谷胱甘肽，具有滲透性。例如，本發(fā)明的納米微囊的成分可以這樣制備，使它保留了象血紅蛋白這樣的大分子。同時(shí)，它也可以選擇性地透過(guò)一些小分子，比如維生素C或谷胱甘肽。
目前，本發(fā)明中被納米微囊包裹的血紅蛋白在輸入到37℃人體中后會(huì)緩慢地轉(zhuǎn)換為高鐵血紅蛋白。與血紅蛋白不同，高鐵血紅蛋白不再能攜帶和輸送氧氣。如果納米微囊膜如上文所述能制備成具有選擇透過(guò)性，這樣在保留血紅蛋白的同時(shí)，微囊膜可以允許維生素C、谷胱甘肽或其它類(lèi)似的物質(zhì)從循環(huán)的血漿中擴(kuò)散到納米微囊內(nèi)。因?yàn)檫@些分子有助于防止血紅蛋白向高鐵血紅蛋白的轉(zhuǎn)化，這樣就增強(qiáng)了血紅蛋白攜帶和輸送氧氣的能力。
我們制備了包含有血紅細(xì)胞中所有酶的血紅蛋白納米微囊。該微囊的制備使用了除了血紅細(xì)胞膜外的所有內(nèi)容物?；谶@個(gè)目的，我們可以用上文提到的任何步驟，尤其是那些使體內(nèi)循環(huán)的半衰期延長(zhǎng)的方法來(lái)制備血紅蛋白納米微囊。我們制備的血紅蛋白納米微囊具有較高的高鐵血紅蛋白水平(7％)。然后我們?cè)?7℃下加熱這些納米微囊，并且跟蹤高鐵血紅蛋白所占百分比的變化。
當(dāng)懸浮于含有100mg/dl毫升葡萄糖的林格乳酸溶液中時(shí)，高鐵血紅蛋白在6小時(shí)增加了2.5％。另一方面，當(dāng)懸置在含有100mg/dl葡萄糖和0.02mM還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的林格乳酸溶液中時(shí)，高鐵血紅蛋白在第一個(gè)小時(shí)內(nèi)增加，恰如上文所述。然而，當(dāng)葡萄糖和還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸進(jìn)入納米微囊開(kāi)始多種酶反應(yīng)，高鐵血紅蛋白在5小時(shí)內(nèi)以1.5％的速率遞減。這個(gè)結(jié)果非常令人興奮，因?yàn)樗@示出我們僅僅需要把新鮮的紅細(xì)胞內(nèi)容物中正常量的高鐵血紅蛋白還原酶裝入微囊。這樣，100毫克葡萄糖(以血糖提供)和0.02mM還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在懸置介質(zhì)中不僅可以阻止高鐵血紅蛋白的形成，而且可以把高鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)換回血紅蛋白。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的濃度，這種效果會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)。
當(dāng)懸置在含有100mg/dl葡萄糖和0.02mM還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的林格乳酸溶液中時(shí)，高鐵血紅蛋白增加的速率同其懸置于在含有100mg/dl葡萄糖的林格乳酸溶液中時(shí)一樣。這是因?yàn)?，與還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)不同，較大的輔因子還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)不能滲入納米微囊。因?yàn)檫€原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)無(wú)法滲透，它可以被裝入納米微囊內(nèi)部。這樣避免再提供外部輔因子的需要，而且使反應(yīng)可以像在紅細(xì)胞內(nèi)部一樣進(jìn)行。循環(huán)的血液包含了差不多100mg/dl葡萄糖。葡萄糖可進(jìn)入納米微囊與還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和多酶體系一起發(fā)揮作用。對(duì)于紅細(xì)胞，血糖可以通過(guò)紅細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入紅細(xì)胞。
血漿中含有防止高鐵血紅蛋白形成的物質(zhì)，如維生素C和谷胱甘肽。我們把本發(fā)明中的血紅蛋白納米微囊懸置于維生素C、谷胱甘肽或亞甲基藍(lán)溶液中。血紅蛋白納米微囊膜對(duì)所有這些物質(zhì)具有透過(guò)性。結(jié)果，在輸入后，納米微囊中的血紅蛋白就會(huì)曝露于血液循環(huán)中抑制高鐵血紅蛋白形成的這些因子中。依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，其它通常存在于紅細(xì)胞中的物質(zhì)，包括但不限于酶，如過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化歧化酶和高鐵血紅蛋白還原酶及其它的輔因子等可以同血紅蛋白一起被包入微囊中。
我們完全可以預(yù)期本發(fā)明適用于制備納米微囊用來(lái)包裹具有有效治療濃度的，有治療意義的其它試劑，包括大分子物質(zhì)。
相應(yīng)地，本發(fā)明所述的納米微囊的組成可以包含多種有治療意義的試劑和/或分子，對(duì)藥物接受者產(chǎn)生一個(gè)期望的結(jié)果。而且，本發(fā)明所述的納米微囊組分可以選擇性地透過(guò)有治療意義的試劑和/或分子，以使它們透過(guò)納米微囊膜與包入微囊的試劑相互作用。
本發(fā)明提供了一個(gè)有效傳輸系統(tǒng)來(lái)將微囊中包裹的試劑傳輸?shù)襟w循環(huán)中。本發(fā)明也提供了一個(gè)適于將具有治療意義的試劑逐步釋放到體內(nèi)循環(huán)的傳輸系統(tǒng)。按照這個(gè)實(shí)例，這一系列納米微囊組分中，每一個(gè)都有一個(gè)可預(yù)先確定的釋放速率，來(lái)釋放微囊中的有治療意義的試劑。將所有這些不同組分同時(shí)注入體內(nèi)，就會(huì)達(dá)到一個(gè)可控的逐步的釋放過(guò)程。
盡管本發(fā)明是通過(guò)實(shí)施例來(lái)描述的，人們應(yīng)該理解本發(fā)明可以進(jìn)一步修飾。本發(fā)明申請(qǐng)有意涵蓋任何在基本發(fā)明原理內(nèi)的變化、應(yīng)用或改編，包括可知的或慣例的屬于本發(fā)明范疇的偏離，也包括對(duì)前面闡述的以及后面附加權(quán)利要求內(nèi)容中所講的關(guān)鍵部分的偏離。
權(quán)利要求
1.一種可降解的多聚納米微囊膜組分，其可用于包囊具有治療意義的試劑并增強(qiáng)在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，所述的納米微囊膜組分由聚乳酸和聚乙二醇的共聚物組成，該共聚物溶于丙酮，不溶于水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，所述的納米微囊膜組分進(jìn)一步包含脂質(zhì)成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的脂質(zhì)成分的量少于聚乳酸和聚乙二醇中每一種的量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的聚乳酸的分子量范圍是從5K到25K。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的聚乳酸的分子量至少10K。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的聚乙二醇的分子量至少2,000。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的聚乙二醇是甲氧基聚乙二醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，所述的納米微囊膜組分的體內(nèi)循環(huán)半衰期為至少35小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的有治療意義的試劑是大分子物質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的大分子是血紅蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的有治療意義的試劑是交聯(lián)的大分子鏈。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的有治療意義的試劑可交聯(lián)到納米微囊膜組分的內(nèi)表面。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，所述的納米微囊膜組分還提供一個(gè)具有對(duì)包裹的有治療意義的試劑選擇性透過(guò)的膜。
14.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，其中所述的脂質(zhì)成分是磷脂。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解的多聚納米微囊膜組分，所述的納米微囊膜組分可進(jìn)一步調(diào)整從而能在體內(nèi)保持住有治療意義的試劑，使其循環(huán)半衰期達(dá)到至少14小時(shí)。
16.一種血紅蛋白納米微囊組分，所述的組分由可生物降解的多聚納米微囊膜包裹有治療效果濃度的血紅蛋白制品；所述的納米微囊膜包括由聚乳酸和聚乙二醇形成的共聚物；該共聚物溶于丙酮，不溶于水；所述的納米微囊組分可以增強(qiáng)血紅蛋白制品的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的可降解的多聚納米微囊膜組分還包括脂質(zhì)成分。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的脂質(zhì)成分是磷脂。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的脂質(zhì)成分的量少于聚乳酸和聚乙二醇每一種的量。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的聚乙二醇是甲氧基聚乙二醇。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的聚乳酸的分子量范圍是從5K到25K。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的血紅蛋白是交聯(lián)的血紅蛋白鏈或聚血紅蛋白。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中共聚物的濃度可以增加來(lái)使納米微囊膜的厚度加大。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的聚乙二醇的分子量為2,000。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的聚乳酸的分子量為15K。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的交聯(lián)血紅蛋白鏈的分子量范圍為240K到360K。
27.根據(jù)權(quán)利要求22所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的血紅蛋白鏈進(jìn)一步交聯(lián)到納米微囊的內(nèi)表面。
28.根據(jù)權(quán)利要求16所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，所述的血紅蛋白納米微囊組分包含至少一種其它已知的可以抑制高鐵血紅蛋白生成的試劑。
29.根據(jù)權(quán)利要求16所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，所述的血紅蛋白納米微囊組分可被進(jìn)一步調(diào)整以具有選擇性地讓受體體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的生物物質(zhì)通過(guò)。
30.根據(jù)權(quán)利要求16所述的血紅蛋白納米微囊膜組分，其中所述的納米微囊組分可使血紅蛋白制品在體內(nèi)循環(huán)半衰期達(dá)到至少14小時(shí)。
31.一種可以增加體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的納米微囊組分的制備方法，其包括(a)加熱聚乳酸和聚乙二醇(PLA-PEG)的混合物；(b)加入含有有治療意義試劑的水溶液到上述混合物中；(c)從上述水溶液中沉淀出共聚物以獲得納米微囊組分；(d)從中提取納米微囊組分；其中所述的組分包括一種可生物降解的包裹了有治療意義試劑的多聚納米微囊膜。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的制備方法，其中所述的共聚物溶于丙酮，不溶于水。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的制備方法，其中所述的共聚物還包括一種脂質(zhì)成分。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的制備方法，其中所述的脂質(zhì)成分是磷脂。
35.根據(jù)權(quán)利要求31所述的制備方法，其中所述的加熱步驟是在有催化劑存在下進(jìn)行的。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的制備方法，其中所述的催化劑是2-乙基己酸亞錫。
37.根據(jù)權(quán)利要求31所述的制備方法，該方法還包括在將所述水溶液加入到共聚物混合液之前預(yù)先交聯(lián)所述的有治療意義的試劑。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的制備方法，其中所述的交聯(lián)包括把交聯(lián)試劑與所述水溶液混合至少2小時(shí)。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的制備方法，其中所述的交聯(lián)試劑是戊二醛。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的制備方法，其中所述的交聯(lián)試劑的濃度至少為0.25M。
41.根據(jù)權(quán)利要求38所述的制備方法，其中所述的交聯(lián)試劑與有治療意義的試劑的比例至少為6∶1。
42.根據(jù)權(quán)利要求31所述的制備方法，其中聚乳酸-聚乙二醇混合物中聚乳酸組分的分子量至少為10,000。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的制備方法，其中聚乳酸-聚乙二醇混合物中聚乙二醇組分的分子量至少為2,000。
44.根據(jù)權(quán)利要求37所述的制備方法，其中所述的交聯(lián)過(guò)程包括將交聯(lián)試劑與所述的水溶液混合大約5小時(shí)。
45.根據(jù)權(quán)利要求39所述的制備方法，其中交聯(lián)試劑是0.5M的戊二醛。
46.根據(jù)權(quán)利要求41所述的制備方法，其中所述的交聯(lián)試劑與有治療意義的試劑的比例為16∶1。
47.根據(jù)權(quán)利要求41所述的制備方法，該方法還包括將被包裹的有治療意義的試劑交聯(lián)到納米微囊的內(nèi)膜。交聯(lián)時(shí)先將聚乳酸-聚乙二醇混合物與有治療意義的試劑混合，然后再加入交聯(lián)試劑。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的制備方法，其中所述的交聯(lián)試劑是戊二醛。
49.根據(jù)權(quán)利要求31所述的制備方法，其中所述的有治療意義的試劑是大分子物質(zhì)。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的制備方法，其中所述的大分子物質(zhì)是血紅蛋白。
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的制備方法，其中所述的有治療意義的試劑是一種蛋白、酶、基因、RNA或DNA片段。
52.根據(jù)權(quán)利要求31所述的制備方法，其中所述的聚乳酸的分子量范圍是5K-25K。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的制備方法，其中所述的分子量至少是10K。
54.根據(jù)權(quán)利要求31所述的制備方法，其中加熱所述的共聚物混合液時(shí)，應(yīng)加熱到至少180℃。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的制備方法，其中所述的分子量范圍是15K-25K。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的制備方法，其中所述的加熱所述的共聚物的混合液時(shí)，應(yīng)加熱到至少200℃。
57.根據(jù)權(quán)利要求31所述的制備方法，其中被包裹的試劑的循環(huán)時(shí)間也得到了延長(zhǎng)。
58.根據(jù)權(quán)利要求50所述的制備方法，其中所述的大分子物質(zhì)是聚血紅蛋白。
59.一種能夠延長(zhǎng)有治療意義試劑的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的傳輸系統(tǒng)，所述的系統(tǒng)包括可生物降解的多聚納米微囊組分，該納米微囊組分由共聚物膜包裹有治療意義的試劑而組成；其中所述的共聚物膜包括聚乳酸和聚乙二醇的共聚物，并且溶于丙酮而不溶于水；所述的共聚物膜能夠調(diào)整用來(lái)使被包裹的有治療意義的試劑以可控速率釋放到體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的有治療意義的試劑是大分子物質(zhì)。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的大分子物質(zhì)是血紅蛋白。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的大分子物質(zhì)是聚血紅蛋白。
63.根據(jù)權(quán)利要求59所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的共聚物膜還包括一種脂質(zhì)成分。
64.根據(jù)權(quán)利要求59所述的傳輸系統(tǒng)，其中可生物降解的多聚納米微囊組分可被進(jìn)一步調(diào)整以具有選擇性地讓受體體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的生物物質(zhì)通過(guò)。
65.根據(jù)權(quán)利要求59所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的納米微囊組分能被進(jìn)一步調(diào)整以將其它生物物質(zhì)與有治療意義的試劑共同包囊。
66.根據(jù)權(quán)利要求59所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的有治療意義的試劑與共聚物膜的內(nèi)表面交聯(lián)。
67.根據(jù)權(quán)利要求60所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的大分子物質(zhì)是一種交聯(lián)的大分子鏈。
68.根據(jù)權(quán)利要求63所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的脂質(zhì)成分是磷脂。
69.一種能夠在體內(nèi)逐級(jí)釋放有治療意義試劑的傳輸系統(tǒng)，所述的傳輸系統(tǒng)由多種能以不同釋放速度釋放被包裹的有治療意義試劑的可生物降解的多聚納米微囊組分組成；其中每一種所述的可生物降解的多聚納米微囊包括由聚乳酸和聚乙二醇的共聚物構(gòu)成的共聚物膜，所述的共聚物能夠溶于丙酮，不溶于水。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的有治療意義的試劑是大分子物質(zhì)。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的大分子物質(zhì)是血紅蛋白。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的大分子物質(zhì)是聚血紅蛋白。
73.根據(jù)權(quán)利要求69所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的共聚物膜還包括一種脂質(zhì)成分。
74.根據(jù)權(quán)利要求69所述的傳輸系統(tǒng)，其中可生物降解的多聚納米微囊組分可被進(jìn)一步調(diào)整以具有選擇性地讓受體體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的生物物質(zhì)通過(guò)。
75.根據(jù)權(quán)利要求69所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的納米微囊組分可被進(jìn)一步調(diào)整以將其它生物物質(zhì)與有治療意義的試劑共同包囊。
76.根據(jù)權(quán)利要求69所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的有治療意義的試劑與共聚物膜的內(nèi)表面進(jìn)行交聯(lián)。
77.根據(jù)權(quán)利要求70所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的大分子物質(zhì)是一種交聯(lián)的大分子鏈。
78.根據(jù)權(quán)利要求73所述的傳輸系統(tǒng)，其中所述的脂質(zhì)成分是磷脂。
79.一種納米微囊組分，由可生物降解的多聚納米微囊膜包裹具有有效治療濃度的大分子物質(zhì)構(gòu)成；所述的納米微囊膜由聚乳酸和聚乙二醇的共聚物組成；該共聚物能夠溶于丙酮，不溶于水；所述的納米微囊組分能夠進(jìn)行調(diào)整以延長(zhǎng)其包裹的大分子物質(zhì)在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。
80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的納米微囊組分，其中所述的可生物降解的多聚納米微囊膜還包括一種脂質(zhì)成分。
81.根據(jù)權(quán)利要求80所述的納米微囊組分，其中所述的脂質(zhì)成分是磷脂。
82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的納米微囊組分，其中所述的磷脂成分在微囊中的量低于聚乳酸和聚乙二醇中每一種的量。
83.根據(jù)權(quán)利要求79所述的納米微囊組分，其中所述的聚乙二醇是甲氧基聚乙二醇。
84.根據(jù)權(quán)利要求79所述的納米微囊組分，其中所述的聚乳酸的分子量范圍為5K-25K。
85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的納米微囊組分，其中所述的大分子是一種交聯(lián)大分子。
86.根據(jù)權(quán)利要求84所述的納米微囊組分，其中可用提高共聚物濃度的方法使納米微囊膜的厚度增加。
87.根據(jù)權(quán)利要求83所述的納米微囊組分，其中所述的聚乙二醇的分子量為2,000。
88.根據(jù)權(quán)利要求84所述的納米微囊組分，其中所述的聚乳酸的分子量為15k。
89.根據(jù)權(quán)利要求79所述的納米微囊組分，其中所述的大分子物質(zhì)進(jìn)一步交聯(lián)到納米微囊的內(nèi)表面。
90.根據(jù)權(quán)利要求79所述的納米微囊組分，其中所述的納米微囊組分還能進(jìn)一步調(diào)整以使體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的分子能夠選擇性地透過(guò)。
91.根據(jù)權(quán)利要求79所述的納米微囊組分，其中所述的納米微囊組分能夠調(diào)整以使所述大分子物質(zhì)在體內(nèi)循環(huán)的半衰期達(dá)到至少14小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種可生物降解的多聚納米微囊及其應(yīng)用。此納米微囊適于包裹有治療意義的試劑，以此增加其體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1564680SQ02819847
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2002年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月31日
發(fā)明者托馬斯·M·S·張, 俞衛(wèi)萍, 道格拉斯·波溫達(dá) 申請(qǐng)人:麥吉爾大學(xué)