專利名稱：一種微管蛋白解聚劑多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微管蛋白解聚劑多肽4及其應(yīng)用，具體涉及具有抑制微管蛋白聚合、治療急性淋巴細(xì)胞性白血病的多肽。
背景技術(shù)：
急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)是一種進(jìn)行性惡性疾病，其特征為大量的類似于淋巴母細(xì)胞的未成熟白細(xì)胞。這些細(xì)胞可在血液、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟和其它器官中發(fā)現(xiàn)。急性淋巴細(xì)胞性白血病占兒童急性白血病的80%，發(fā)病率高峰在3歲至7歲之間。ALL也可發(fā)生于成年人，占所有成年人白血病的20%。近年來(lái)隨著醫(yī)學(xué)研究的深入，對(duì)急性淋巴細(xì)胞性白血病的認(rèn)識(shí)和治療取得了很大進(jìn)展。其中，微管蛋白在急性淋巴細(xì)胞性白血病中扮演著重要角色。微管是細(xì)胞骨架的主要組成部分，由〃-微管蛋白和P-微管蛋白異二聚體組成，具有中空管狀結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。此外，還有一種r微管蛋白，它不是微管的組成成分，但參與微管的組裝。微管具有聚合和解聚的動(dòng)力學(xué)特性，在維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞分裂、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及物質(zhì)輸送等過(guò)程中起著重要作用。微管在細(xì)胞分裂前期聚合成為紡錘體，而紡錘體在有絲分裂中牽引染色體向兩極移動(dòng)進(jìn)入兩個(gè)子細(xì)胞中，完成細(xì)胞增殖。微管的組裝過(guò)程是α -和β -微管蛋白異性二聚體之間緊密的非共價(jià)相互作用，這一過(guò)程是受GTP水解驅(qū)動(dòng)的。異性二聚體不斷地在微管的正極生長(zhǎng)，在負(fù)極收縮，并且維持動(dòng)態(tài)穩(wěn)定。當(dāng)微管的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性被破壞時(shí)，細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程就有可能被阻止，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由于微管在細(xì)胞分裂中具有極其重要的作用，現(xiàn)已成為抗腫瘤藥物研究的重要靶點(diǎn)之一。微管蛋白抑制劑有兩種分類方法。一種是根據(jù)作用機(jī)制的不同分為兩種類型:①抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚劑；②促進(jìn)微管蛋白聚合的微管蛋白聚合劑。抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚劑有長(zhǎng)春堿類、秋水仙堿等化合物，多用于腫瘤治療。這類化合物其特點(diǎn)是作用于微管的長(zhǎng)春堿位點(diǎn)的微管蛋白解聚劑。研究表明，長(zhǎng)春堿類藥物作用于細(xì)胞微管蛋白并干擾細(xì)胞周期的有絲分裂階段，抑制微管聚合，阻止紡錘體微管的形成，從而阻止腫瘤細(xì)胞分裂增殖。該類生物堿自發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性以來(lái)，已有長(zhǎng)春堿(vinblastine, 15)、長(zhǎng)春新堿(vincristine, 16)、長(zhǎng)春地辛(vindesine, 17)和長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine, 18)用于臨床治療,而長(zhǎng)春氟寧(vinflunine, 19)、長(zhǎng)春甘酯(vinglycinate, 20)及脫水長(zhǎng)春堿(anhydrovinblastine, 21)正處于臨床研究階段。但這些都有自身的缺陷，如長(zhǎng)春堿與作用靶點(diǎn)親和力小，藥效不強(qiáng)。長(zhǎng)春新堿有兩個(gè)重要的因素限制了它在臨床上的應(yīng)用:(1)長(zhǎng)春新堿神經(jīng)系統(tǒng)毒性和局部刺激性較大；(2)水溶性相對(duì)較低，吸收能力差。因此，需要開(kāi)發(fā)水溶性好，特異性強(qiáng)的微管蛋白解聚劑用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病。微管蛋白解 聚劑包括大分子和小分子。大分子解聚劑的制備和使用限制了它們的發(fā)展，例如重組人微管蛋白抑制因子的體內(nèi)半衰期只有4分鐘。很多成功的小分子解聚劑，可以在納摩爾水平上抑制微管蛋白的活力，但小分子解聚劑缺乏特異性，如果在慢性疾病中長(zhǎng)期使用缺乏特異性的微管蛋白解聚劑可產(chǎn)生較大副作用。因而，從微管蛋白解聚劑的應(yīng)用角度來(lái)看，以急性淋巴細(xì)胞白血病作為研究對(duì)象是正確的選擇。在急性反應(yīng)期，機(jī)體能夠耐受短期的、微管蛋白廣譜解聚劑對(duì)正常生理功能的抑制，同時(shí)使關(guān)鍵組織器官的生理結(jié)構(gòu)免受破壞，增加了生存幾率。本專利中的微管蛋白解聚劑多肽4已證明在急性淋巴細(xì)胞白血病中有效，具有在其他腫瘤模型中開(kāi)發(fā)的前景。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本發(fā)明提供全新的序列，該序列微管蛋白解聚劑，對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病具有很好的療效。技術(shù)方案
微管蛋白解聚劑多肽4，其特征在于其序列為VELSQHYLTHR，見(jiàn)Seq N0.1。微管蛋白解聚劑多肽4在制備治療急性淋巴細(xì)胞白血病藥物中的應(yīng)用。有益效果
利用固相合成法化學(xué)合成微管蛋白解聚劑多肽4，該多肽具有全新的序列，該多肽可體外抑制微管蛋白，治療急性淋巴細(xì)胞白血病。在內(nèi)毒素休克模型實(shí)驗(yàn)中成功的增加了小鼠的生存率。我們發(fā)現(xiàn)的多肽解聚劑可以同時(shí)抑制微管蛋白聚合活力，并在體內(nèi)試驗(yàn)中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及肽4由上海生工合成。實(shí)施例1
微管蛋白解聚劑多肽4對(duì)體外微管蛋白聚合與解聚的作用。取新鮮牛腦組織，剝?nèi)ツX膜和大的血管，剪碎，用冷MES緩沖液洗滌1-2次，以每克腦組織0.5-lml的比例加入MES緩沖液，在4°C下，用電動(dòng)勻漿器勻漿；4°C，105000g離心lh，取上清，加入等體積的微管聚合緩沖液，37°C水浴保溫30min。26°C，105000g離心lh，取沉淀，加入約1/10勻漿體積的冷MES緩沖液，輕輕攪拌或用勻漿器將沉淀碾碎；將懸液放冰浴30min，使沉淀完全溶解。用Lowry’ s法測(cè)定蛋白含量(SDS聚酰胺凝膠電泳法)。微管蛋白用MES緩沖液稀釋至4-5mg/ml，置液氮中保存。取冷凍的微管蛋白溶液，快速用常溫水沖其壁，使之融化，放入冰浴，用MES緩沖液稀釋至所需濃度(2-3mg/ml)，加入ATP至lmmol/1。以從冰浴中馬上取出的微管蛋白溶液在分光光度計(jì)350nm處調(diào)定為“O”點(diǎn)。然后將比色杯在37°C溫度下測(cè)定微管蛋白溶液的OD值，連續(xù)20-30min,記錄溫度-吸光值曲線(T-OD曲線)，重復(fù)三次。抑制率計(jì)算:抑制率(％)=(對(duì)照管“0D”值一加藥管“0D”值)/對(duì)照管“0D” 實(shí)驗(yàn)組設(shè)五個(gè)劑量:0.75μΜ、1.5μΜ、3μΜ、12μΜ、24μΜ，陽(yáng)性對(duì)照組長(zhǎng)春新堿劑量
3 μ Μ，空白組加入等體積的溶劑DMSO ;按上述操作測(cè)定吸光值。結(jié)果，隨微管蛋白解聚劑多肽4濃度增加，聚合抑制率逐漸下降，說(shuō)明有聚合能力的微管蛋白隨藥物濃度的增加而不斷減少。
實(shí)施例2
微管蛋白解聚劑多肽4對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活I(lǐng)C50。采用MTT比色法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的U937細(xì)胞，以1.0 X 105加入96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)孔、陽(yáng)性藥物對(duì)照孔分別加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物微管蛋白解聚劑多肽4和陽(yáng)性對(duì)照藥物長(zhǎng)春新堿；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設(shè)五個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h，分別在0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h 每孔加入 MTT，作用 4h 后，加入 DMS0，孵育 30min，在酶標(biāo)儀620nm處測(cè)定吸光度A值，按公式腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值)X100%。計(jì)算出實(shí)驗(yàn)藥物的IC50為8.76μΜ。實(shí)施例3
用腫瘤模型檢測(cè)微管蛋白解聚劑多肽4的體內(nèi)活力。

建立U937腫瘤模型，陽(yáng)性對(duì)照藥物長(zhǎng)春新堿；空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)劑量:0.75、1.5 μ Μ、3 μ M mg/Kg。21天后，觀察小鼠存活數(shù)量，計(jì)算存活率。結(jié)果顯示，微管蛋白解聚劑多肽4可有效地保護(hù)小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，生存率達(dá)到65.1%。
權(quán)利要求
1.微管蛋白解聚劑多肽4，其特征在于其序列為VELSQHYLTHR。
2.微管蛋白解聚劑多肽4在制備治療急性淋巴細(xì)胞性白血病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明為一種微管蛋白解聚劑多肽及其應(yīng)用，涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及具有抑制微管蛋白聚合，治療治療急性淋巴細(xì)胞性白血病的多肽。其序列VELSQHYLTHR是全新的序列，它們可以在1微摩爾水平上體外抑制微管蛋白聚合，并在體內(nèi)試驗(yàn)中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K38/08GK103254284SQ201310208878
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月30日
發(fā)明者羅瑞雪 申請(qǐng)人:蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司