專利名稱：抗肺癌的燈臺葉中藥組合物、其制備方法及其在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥組合物，具體涉及一種抗肺癌的燈臺葉中藥組合物、其制備方法及其在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用
背景技術(shù)：
在環(huán)境污染、職業(yè)暴露等因素的多方面影響下，世界范圍內(nèi)肺癌發(fā)病率持續(xù)上升，已成為對人類健康危害最大的惡性腫瘤。在我國城市中肺癌占所有腫瘤死亡的17.8%，在惡性腫瘤發(fā)病率排序中已經(jīng)上升為第一位。根據(jù)2010年中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒結(jié)果顯示2009年中國城市肺癌死亡率為49. 6/10萬人,農(nóng)村肺癌死亡率為39. 64/10萬人,分別占腫瘤死亡人數(shù)的29. 2%和24. 7%ο在城鎮(zhèn)地區(qū),每死亡4人，即有I人死于癌癥,而在因癌癥死去的每3-4人中，即有I人是肺癌。目前肺癌仍缺乏安全高效的治療藥物，肺癌患者預(yù)后和存活率都較差。因此研發(fā)新型抗肺癌藥物是十分迫切與必要的。天然植物來源的長春堿、喜數(shù)堿等已經(jīng)被開發(fā)為有效的抗腫瘤藥物，繼續(xù)從中藥和天然藥物中尋找和開發(fā)抗肺癌藥物是當(dāng)前的研究熱點。燈臺樹scholaris(L.) R. Sr.，為夾竹桃科雞骨常山屬的喬木，主要含有生物堿、黃酮、三萜類等成分，性味甘、淡、平，具有清熱解毒、消腫止痛、平喘止咳、截瘧、發(fā)汗、健胃等作用。燈臺樹根、莖、皮、葉均可入藥，以皮和葉用藥為主。近年來，隨著對其化學(xué)成分、藥理活性等方面研究的逐步展開，發(fā)現(xiàn)其活性成分豐富，在抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗糖尿病和降血脂等方面顯示出重要的潛在藥用價值。燈臺葉是燈臺樹的干燥葉，傳統(tǒng)常用于治療肺熱、咳嗽、痰多等癥。燈臺葉主要含有生物堿類、黃酮類、三萜類等成分。專利已有報道燈臺葉治療咳嗽哮喘、咽炎的制劑(200710063724. O公開了一種治療咳嗽哮喘的中藥組合物；201010171142. 6公開了一種治療咽炎的藥物)，關(guān)于燈臺葉抗肺癌的專利未有報道。據(jù)文獻報道，燈臺樹皮85%乙醇提取物具有很好的抗腫瘤活性，從其分離得到的不同極性溶劑部位，對HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒作用以甲醇溶解后的不溶部位、總提取物和氯仿部位最好，而這些部位生物堿含量豐富。(參見Jagetia GC, Baliga MS. The effectof seasonal variation on the antineoplastic activity of Alstonia scholarisR. Br, in HeLa cells [J]. J Ethnopharmaco1. 2005, 96(1-2) :37-42.)從燈臺樹中分離得到的燈臺堿(echitamine)是燈臺樹的主要生物堿成分之一,它在體外對HeLa、HepG2、HL60、KB、MCF-7、Vero、纖維肉瘤和艾氏腹水癌細(xì)胞都具有細(xì)胞毒作用，體內(nèi)對大鼠纖維肉瘤，S180肉瘤和小鼠艾氏腹水瘤有抑制生長的作用(參見Jagetia GC, Baliga MS, VenkateshP, et al. Evaluation of the cytotoxic effect of the monoterpene indole alkaloidechitamine in-vitro and in tumour-bearing mice[J]. J Pharm Pharmacol. 2005, 57(9)1213-1219.)。燈臺葉和燈臺樹皮、根類似，也含有大量類似的生物堿等成分，因此從燈臺葉中提取具有抗腫瘤活性的有效組分并開發(fā)抗肺癌藥物是一條可行的途徑，且有利于燈臺樹資源的充分利用和可持續(xù)發(fā)展。但是現(xiàn)有技術(shù)對從燈臺葉中提取抗腫瘤藥物的研究還是初步的，尚未有能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的具體藥物的報道，更未見從燈臺葉中提取的具體用于抗肺癌藥物的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗肺癌的燈臺葉中藥組合物、其制備方法及其在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用，以實現(xiàn)抗肺癌 藥物的產(chǎn)業(yè)化。完成上述第一個發(fā)明任務(wù)的方案是一種抗肺癌的燈臺葉中藥組合物，其特征在于，該組合物的原料藥為中藥燈臺葉。進一步優(yōu)化，上述抗肺癌的燈臺葉中藥組合物是由燈臺葉提取物中的總生物堿組分和總?cè)平M分組成，所述的總生物堿組分和總?cè)平M分，是按其原料生藥量的質(zhì)量比1:0. I 1:10 組合；
較好的組合為兩種組分按其原料生藥量質(zhì)量比1:0. 5 1:5組合；
最理想的組合為兩種組分按其原料生藥量質(zhì)量比1:1組合。其中所述的總生物堿組分以鴨腳樹葉堿為代表性成分；所述的總?cè)平M分以齊墩果酸和熊果酸為代表性成分。HPLC圖譜見


。其中燈臺葉，性味苦，涼，具有止咳、祛痰、消炎的功效。更具體地說，本發(fā)明的抗肺癌中藥組合物，是指按照以下制備方法得到的組合物
步驟(I):燈臺葉用乙醇回流提取，回收溶劑，得到提取濃縮液；
步驟(2):將提取濃縮液上于大孔樹脂上，先用水、低濃度乙醇洗去雜質(zhì)，再用中濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總生物堿組分，最后用高濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總?cè)平M分，分別真空干燥，即得總生物堿組分和總?cè)平M分；
步驟⑶將步驟⑵中的總生物堿組分和總?cè)平M分組合在一起(混合均勻)，得本發(fā)明的藥物組合物。步驟(3)中，總生物堿組分和總?cè)平M分是其原料生藥量的質(zhì)量比1:0. f 1:10組合；較好的組合比例為按其原料生藥量質(zhì)量比1:0.5 1:5組合；最理想的組合比例為按其原料生藥量質(zhì)量比1:1組合。兩種組分的組合比例超出1:1時，可以用另外的原料藥，提取總生物堿組分或者總?cè)毥M分補充到組合物中。本發(fā)明采用大孔樹脂把燈臺葉的乙醇提取物分離成不同的組分，通過體內(nèi)外實驗對其抗肺癌活性組分進行篩選，得到燈臺葉抗肺癌活性組分為總生物堿和總?cè)平M分，并將兩個組分進行組合，得到燈臺葉的抗肺癌組合物。這樣的研究未經(jīng)報道，而且能進行大規(guī)模生產(chǎn)，適宜開發(fā)成抗肺癌中藥新藥。完成本發(fā)明第二個發(fā)明任務(wù)的方案是，上述燈臺葉的抗肺癌中藥組合物的制備方法，包括如下步驟
步驟(I):燈臺葉用乙醇回流提取，回收溶劑，得到提取濃縮液；
步驟(2):將提取濃縮液上于大孔樹脂上，先用水、乙醇洗去雜質(zhì)，再用中濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總生物堿組分，最后用高濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總?cè)平M分，分別真空干燥，即得總生物堿組分和總?cè)平M分；步驟⑶將步驟⑵中的總生物堿組分和總?cè)平M分組合在一起(混合均勻)，得本發(fā)明的藥物組合物。步驟(3)中，總生物堿組分和總?cè)平M分是其原料生藥量的質(zhì)量比1:0. f 1:10組合；較好的組合比例為按其原料生藥量質(zhì)量比1:0. 5 1:5組合；最理想的組合比例為按其原料生藥量質(zhì)量比1:1組合。兩種組分的組合比例超出1:1時，可以用另外的原料藥，提取總生物堿組分或者總?cè)毥M分補充到組合物中以上制備方法的進一步優(yōu)化，具體操作步驟是
步驟⑴燈臺葉用6 15倍量的體積百分比709Γ95%乙醇回流提取廣4次，每次f4h，回收溶劑，得到提取濃縮液；
步驟(2):將提取濃縮液上于HPD400A、NKA-9、DlOl、DA201、AB-8型大孔樹脂上，先用2 6BV的水及2 6BV的體積百分比20% 40%乙醇洗去雜質(zhì)，再用4 10BV的體積百分比50%飛5%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總生物堿組分，最后用Γ ΟΒν的體積百分比709Γ95%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總?cè)平M分，分別真空干燥，即得總生物堿組分和總?cè)平M分；
步驟(3):將步驟(2)中的總生物堿組分和總?cè)平M分混合均勻，得本發(fā)明的抗肺癌中藥組合物。本發(fā)明中藥組合物制備方法的優(yōu)化方案是
步驟⑴燈臺葉用8 12倍量的體積百分比809Γ90%乙醇回流提取廣3次，每次
I.5^3h,回收溶劑，得到提取濃縮液；
步驟(2):將提取濃縮液上于D101、DA201、AB-8型大孔樹脂上，先用3 5BV的水及3 5BV的體積百分比30% 40%乙醇洗去雜質(zhì)，再用5 8BV的體積百分比55% 60%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總生物堿組分，最后用5 8BV的體積百分比759Γ85%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總?cè)平M分，分別真空干燥，即得總生物堿組分和總?cè)平M分；
步驟(3):將步驟(2)中的總生物堿組分和總?cè)平M分混合均勻，得本發(fā)明的抗肺癌中藥組合物。中藥組合物制備方法的優(yōu)化方案中，本發(fā)明推薦的條件是
步驟(I):燈臺葉用10倍量的體積百分比85%乙醇回流提取2次，每次2h，回收溶劑，得到提取濃縮液；
步驟(2):將提取濃縮液上于AB-8型大孔樹脂上，先用4BV的水及4BV的體積百分比40%乙醇洗去雜質(zhì)，再用6BV的體積百分比60%乙醇洗脫，收集體積百分比60%乙醇洗脫液，回收乙醇，得到總生物堿組分，最后用6BV的體積百分比80%乙醇洗脫，收集體積百分比80%乙醇洗脫液，回收乙醇，得到總?cè)平M分，分別真空干燥，即得總生物堿組分和總?cè)平M分；
步驟(3):將步驟(2)中的總生物堿組分和總?cè)平M分混合均勻，得本發(fā)明的抗肺癌中藥組合物。完成本發(fā)明第三個發(fā)明任務(wù)的方案是，上述燈臺葉的抗肺癌中藥組合物在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的組合物所制備抗肺癌藥物在使用時為口服給藥。
可通過混合，填充，壓片等常規(guī)的方法制備固體口服組合物。燈臺葉提取物藥理實驗的數(shù)據(jù)
1.不同溶劑提取物的制備 取200 g燈臺葉各5份，分別加10倍量85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、水回流提取，(2次，2 h/次)，濾過，合并濾液，分別回收溶劑，濃縮至一定體積，60 °C減壓干燥。五個溶劑部位分別記為DTY-85-T，DTY-70-T，DTY-50-T，DTY-30-T，DTY-W-T。取不同提取物干燥粉末，稱重，計算提取得率，結(jié)果見表I。表I燈臺葉藥材提取物結(jié)果
2.體外細(xì)胞活性篩選
細(xì)胞株Α549和SPC-A-I肺癌細(xì)胞
取對數(shù)生長期Α549、SPC-A-I細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液分別配成6Χ104、9X IO4的單細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100 μ L。實驗組加90 μ L不含牛血清的培養(yǎng)基，另加入燈臺葉藥液10 μ L，使其最終生藥濃度分別為10 mg/mL, 5 mg/mL,
2.5 mg/mL, I mg/mL,陽性對照組加順鉬(1:10) 10 μ L，空白對照組加100 μ L終濃度為
O.5%DMS0:乙醇(I: I)溶液。每組設(shè)6個平行孔，另設(shè)本底對照孔(等體積含相應(yīng)濃度藥物的無細(xì)胞培養(yǎng)液)，置于37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，每孔加入MTT液10 4 1^，培養(yǎng)4 11，棄去每孔中的液體，每孔加DMSO 100 μ L，振蕩10 min后置于570 nm (檢測波長)和630nm (參比波長)酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD值，計算細(xì)胞生長抑制率(按以下公式)，用SPSS
11.5軟件求其半數(shù)抑制濃度(IC5tl)。以上實驗重復(fù)3次。細(xì)胞生長抑制率=(對照組OD均值-實驗組OD均值)/對照組OD均值 X 100%
表2 A549和SPC-A-I細(xì)胞藥效評價結(jié)果
_A549 細(xì)胞__SPC-A-I 細(xì)胞_
提取物IC50IC50IC50IC50
(mg生藥/mL)(呢提取物/mL) (mg生藥/mL) (_提取物/mL) DTY-85-T2M275.483.17297.03
DTY-70-T3.723 27.361 84340.56
DTY-50-T4.20__371.28__4J7__412.83
DTY-30-T7.13536.897.87592.61
DTY-W-T-
表示沒有活性
在給藥 36h 后，DTY-85-T、DTY-70-T、DTY-50-T 對 A549 細(xì)胞模型的 IC5tl 分別為 275. 48、327. 36,371. 28 μ g提取物/mL，對 SPC-A-1 細(xì)胞模型的 IC5tl 分別為 297. 03,340. 56,412. 83μ g提取物/mL，均 小于藥物抗腫瘤活性評價的國際標(biāo)準(zhǔn)500 μ g提取物/mL，其中以85%乙醇提取得到的燈臺葉提取物的體外抗肺癌的活性最好。本發(fā)明中的藥物組合物在抗肺癌方面的作用，以下為組合物藥理實驗的數(shù)據(jù)
I. 在細(xì)胞水平上篩選有效組分
細(xì)胞活性篩選組分的制備取燈臺葉藥材5 kg，加10倍量85%乙醇回流提取2次，每次2h，濾過，合并濾液，回收乙醇至浸膏。將浸膏上于AB-8大孔樹脂，依次用水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇進行梯度洗脫，將這10個洗脫部位分別回收溶劑，60°C減壓干燥，得10個洗脫組分。十個溶劑組分分別記為DTY-水組分、DTY-10%乙醇組分、DTY-20%乙醇組分、DTY-30%乙醇組分、DTY-40%乙醇組分、DTY-50%乙醇組分、DTY-60%乙醇組分、DTY-70%乙醇組分、DTY-80%乙醇組分、DTY-95%乙醇組分。細(xì)胞活性篩選
細(xì)胞株A549和SPC-A-I肺癌細(xì)胞
取對數(shù)生長期A549、SPC-A-I細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液分別配成6X104、9 X IO4的單細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100 μ L。實驗組加90 μ L不含牛血清的培養(yǎng)基，另加入燈臺葉藥液10 μ L，使其最終生藥濃度分別為25 mg/mL, 12. 5 mg/mL,5 mg/mL, 2. 5 mg/mL，陽性對照組加順鉬(I: 10) 10 μ L，空白對照組加100 μ L終濃度為
O.5%DMS0:乙醇(I: I)溶液。每組設(shè)6個平行孔，另設(shè)本底對照孔(等體積含相應(yīng)濃度藥物的無細(xì)胞培養(yǎng)液)，置于37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，每孔加入MTT液10 μ L，培養(yǎng)4h，棄去每孔中的液體，每孔加DMSO 100 μ L，振蕩10 min于570 nm (檢測波長)和630 nm(參比波長)波長酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD值，計算細(xì)胞生長抑制率(按以下公式)，用SPSS
11.5軟件求其半數(shù)抑制濃度(IC5tl)。以上實驗重復(fù)3次。細(xì)胞生長抑制率=(對照組OD均值-實驗組OD均值)/對照組OD均值 X 100%
表3 A549和SPC-A-I細(xì)胞藥效評價結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種抗肺癌的燈臺葉中藥組合物，其特征在于，該組合物的原料藥為中藥燈臺葉。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物，其特征在于，所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物是由燈臺葉提取物中的總生物堿組分和總?cè)平M分組成；所述的總生物堿組分和總?cè)平M分按其原料生藥量的質(zhì)量比1:0. f 1:10組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物，其特征在于，所述的總生物堿組分和總?cè)平M分按其原料生藥量的質(zhì)量比1:0. 5 1:5組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物，其特征在于，所述的總生物堿組分和總?cè)平M分按其原料生藥量的質(zhì)量比1:1組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物，其特征在于，所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物是按照以下方法制備得到的組合物 步驟(I):燈臺葉用乙醇回流提取，回收溶劑，得到提取濃縮液； 步驟(2):將提取濃縮液上于大孔樹脂上，先用水、低濃度乙醇洗去雜質(zhì)，再用中濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總生物堿組分，最后用高濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總?cè)平M分，分別真空干燥，即得總生物堿組分和總?cè)平M分； 步驟(3):將步驟(2)中的總生物堿組分和總?cè)平M分混合均勻，得本發(fā)明的藥物組合物。
6.權(quán)利要求I所述抗肺癌的燈臺葉中藥組合物的制備方法，其特征在于，步驟如下 步驟(I):燈臺葉用乙醇回流提取，回收溶劑，得到提取濃縮液； 步驟(2):將提取濃縮液上于大孔樹脂上，先用水、低濃度乙醇洗去雜質(zhì)，再用中濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總生物堿組分，最后用高濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總?cè)平M分，分別真空干燥，即得總生物堿組分和總?cè)平M分； 步驟(3):將步驟(2)中的總生物堿組分和總?cè)平M分混合均勻，得本發(fā)明的抗肺癌中藥組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述抗肺癌的燈臺葉中藥組合物的制備方法，其特征在于具體操作步驟是 步驟⑴燈臺葉用6 15倍量的體積百分比709Γ95%乙醇回流提取廣4次，每次f4h，回收溶劑，得到提取濃縮液； 步驟(2):將提取濃縮液上于HPD400A、NKA-9、DlOl、DA201、AB-8型大孔樹脂上，先用2 6BV的水及2 6BV的體積百分比20% 40%乙醇洗去雜質(zhì)，再用4 10BV的體積百分比50%飛5%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總生物堿組分，最后用Γ ΟΒν的體積百分比709Γ95%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總?cè)平M分，分別真空干燥，即得總生物堿組分和總?cè)平M分； 步驟(3):將步驟(2)中的總生物堿組分和總?cè)平M分混合均勻，得本發(fā)明的抗肺癌中藥組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述抗肺癌的燈臺葉中藥組合物的制備方法，其特征在于步驟(I)、(2)的操作條件是 步驟(I):燈臺葉用10倍量的體積百分比85%的乙醇回流提取2次，每次2h，回收溶齊U，得到提取濃縮液； 步驟(2):將提取濃縮液上于AB-8型大孔樹脂上，先用4BV的水及4BV的體積百分比40%乙醇洗去雜質(zhì)，再用6BV的體積百分比60%乙醇洗脫，收集體積百分比60%乙醇洗脫液，回收乙醇，得到總生物堿組分，最后用6BV的體積百分比80%乙醇洗脫，收集體積百分比80%乙醇洗脫液，回收乙醇，得到總?cè)平M分，分別真空干燥，即得總生物堿組分和總?cè)平M分。
9.權(quán)利要求I所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗肺癌的燈臺葉中藥組合物在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的組合物所制備的抗肺癌藥物在使用時為口服給藥。
全文摘要
抗肺癌的燈臺葉中藥組合物、其制備方法及其在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。該組合物的原料藥為中藥燈臺葉。該組合物是由燈臺葉提取物中的總生物堿組分和總?cè)平M分組成；總生物堿組分和總?cè)平M分分別按其原料生藥量的質(zhì)量比1:0.1~1:10組合。本發(fā)明還提供了該組合物的制備方法，以及其在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明對C57BL/6荷瘤小鼠有很好的抑瘤作用，能夠顯著提高小鼠的免疫力，與環(huán)磷酰胺組相比，燈臺葉組合物能夠顯著提高荷瘤小鼠的免疫指數(shù)(胸腺指數(shù)、脾指數(shù)和肝指數(shù))及小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子(TNF-a和IL-6)，因此燈臺葉組合物具有較強的抗肺癌活性，較低的毒副作用，療效安全可靠，是有效的抗肺癌藥物。
文檔編號A61P35/00GK102631396SQ20121014175
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月7日
發(fā)明者劉璇, 張振海, 杜萌, 陳彥 申請人:江蘇省中醫(yī)藥研究院