專利名稱：制備轉tgev-s基因玉米的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及制備轉TGEV-S基因玉米的方法。
背景技術：
豬傳染性胃腸炎(Transmissible Gastroenteritis,TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus, TGEV)引起的，該病是以嘔吐、嚴重腹 寫、脫水和對2周齡以內仔豬高度致死性為特征的高度接觸性傳染病，不同品種和年齡的豬均易感。TGE主要危害新生仔豬，隨著日齡的增大，該病的死亡率逐漸下降，16日齡以上仔豬的死亡率為10%左右。5周齡以上仔豬死亡率更低，成年豬幾乎沒有死亡，但往往會造成生產(chǎn)性能下降，飼料報酬率降·低，經(jīng)濟損失較大。豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白(TGEV S蛋白)形成病毒粒子表面的突起，攜帶主要的B淋巴細胞抗原決定族，是唯一能誘導產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護作用的結構蛋白。TGEV S抗原分為A，B，C和D共4個抗原位點，有研究成果證明這四個抗原位點均位于S蛋白N端的543個氨基酸殘基之內。隨著植物基因工程技術的發(fā)展，利用轉基因植物作為生物反應器生產(chǎn)動物或人基因工程疫苗應用在疾病的預防及治療方面已成為植物基因工程的一個新興研究領域。和細菌、酵母及哺乳動物細胞等傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)系統(tǒng)相比較而言，用轉基因植物作為生物反應器生產(chǎn)基因工程疫苗具有以下幾個方面的優(yōu)勢:①植物細胞具有全能性，能夠再生植株且易于成活植物細胞完整的真核細胞表達系統(tǒng)使表達產(chǎn)物具有較好的免疫原性及生物活性；③植物細胞壁、細胞膜和細胞器的天然生物膠囊作用能避免抗原蛋白在消化道中被降解，有效地誘導腸胃黏膜免疫反應，同時又能起到一定的緩釋作用，這使得植物疫苗口服給藥比經(jīng)注射給藥效果更明顯。④口服植物疫苗能誘導粘膜免疫反應。以上這些優(yōu)點使轉基因植物口服疫苗適合應用于通過提高體液免疫特別是腸道免疫水平來預防病原的感染。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種在植物中表達TGEV S蛋白的方法。本發(fā)明所提供的在植物中表達TGEV S蛋白的方法，包括如下步驟:將TGEV S蛋白的編碼基因導入出發(fā)植物，得到表達所述TGEV S蛋白的轉基因植物。上述方法中，所述出發(fā)植物為玉米。上述方法中，所述編碼基因為如下I)或2)或3)或4)所示:I)其核苷酸序列是SEQ ID NO:2中自5'末端第1-2208位核苷酸所示DNA分子；2)其核苷酸序列是SEQ ID NO: 2所示DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。上述方法中，所述編碼基因是通過如下所述的重組表達載體導入的。上述方法中，所述TGEV S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于制備轉基因玉米的重組表達載體。本發(fā)明所提供的重組表達載體，按照如下方法制備:用SacI和EcoRI雙酶切載體PBI221，回收農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因N0S3'末端終止子片段，再將其插入載體pSP72的SacI和EcoRI位點間，得到重組載體，計作pBPC18 ；將E35S啟動子插入pBPC18的HindIII和XbaI位點，得到中間重組載體I ;將Hsp70 intronl用BglII和BamHI酶切后插入所述中間重組載體I的BamHI位點,得到重組載體，計作PBAC154 ；將所述TGEV S蛋白的編碼基因插入載體PBAC154的BamHI和SacI位點，得到重組載體，計作PBAC175 ；用HindIII和BamHI酶切質粒pBARGUS，回收含有CaMV 35S啟動子和玉米Adhl內含子的目的片段，再將其插入到PSP72的HindIII和BamHI位點，得到中間重組載體2 ;將編碼抗除草劑草甘膦的玉米EPSP基因插入中間重組載體2的BamHI和EcoRI位點，獲得重組載體，計作PSHK49 ；將pSHK49用EcoRI酶切后補成平端，引入含HindII位點的適配子序列，計作PSHK49H3 ;所述適配子序列具體為CCCAAGCTTGGG ；用HindII酶切pSHK49H3，回收含有CaMV 35S啟動子和玉米Adhl內含子和EPSP基因的片段，將其插入到PBAC175的HindIIII位點，得到目的重組表達載體。上述重組載體中，農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因N0S3'末端終止子(0.26kb)序列如Genbank ACCESSION AF502128，從 2778-3030 位；E35S 啟動子(Enhanced CaMV 35S)序列如Seq ID:N0.3 ；Hsp70 intronl序列如Seq ID:N0.4 ;編碼抗除草劑草甘膦的玉米EPSP基因的序列如GenBank Accession Number X63374.1自5’末端第I至1335核昔酸序列。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種預防豬傳染性胃腸炎的產(chǎn)品。本發(fā)明所提供的預防豬傳染性胃腸炎的產(chǎn)品，其活性成分為上述任一所述方法制備得到的轉基因植物的組織或器官。所述組織或器官為葉片。上述任一所述方法制備得到的轉基因植物的組織或器官在制備預防豬傳染性胃腸炎的產(chǎn)品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述應用中，所述組織或器官為葉片。本發(fā)明實現(xiàn)了 TGEV S蛋白在植物中的表達。具體是通過構建表達載體PBAC176將豬傳染性胃腸炎病毒保護性抗原基因(TGEV-S)導入玉米基因組中。從分子水平對轉基因植株進行了分析，初步表明目的基因TGEV-S已導入轉基因玉米的基因組中，并確認TGEV-S基因在7個Tl代轉基因玉米中獲得了穩(wěn)定整合與表達。本發(fā)明將TGEV S蛋白編碼基因導入玉米基因組中，在玉米中表達TGEV-S，為口服疫苗的研制和開發(fā)奠定基礎。


圖1為載體pBAC176的結構圖。圖2為轉TGEV-S基因玉米植株的誘導、分化與田間移栽。A誘導，B篩選，C分化，D壯苗，E移栽。圖3為轉基因Ttl代玉米植株外源TGEV-S基因片段的PCR檢測結果。M=Trans2Kplus marker ；0:空白對照；-:非轉基因玉米對照；+:陽性質粒對照;1_30:T0代玉米植株。圖4為轉基因Ttl代玉米植株外源TGEV-S基因片段的PCR-Southern檢測結果。+:陽性質粒pBAC176(PCR產(chǎn)物千倍稀釋后);0:空白；-:陰性對照；其它為轉基因玉米TO代植株。圖5為轉基因T1代玉米植株外源TGEV-S基因片段的PCR檢測結果。M=Trans2Kplus marker ；0:空白對照；-:非轉基因玉米對照；+:陽性質粒對照；1_30:T1代玉米植株。圖6為轉基因T1代玉米植株外源TGEV-S蛋白間接ELISA分析。檢測陽性的樣本用方框標出。圖7為阻斷ELISA檢測小鼠血清TGEV特異性抗體檢測OD值倒數(shù)柱狀圖。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。PCR反應試劑Ex Taq DNA聚合酶、dNTPsUOXPCR緩沖液、氨卞青霉素、卡那霉素和各種限制性內切酶等購自大連寶生物公司。pGEM-T Easy Vector Kit、大腸桿菌ToplO、MarkerII1、質粒小量提取試劑盒、高純度質粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等購自天根生化公司。地高辛(DIG)標記與檢測試劑盒和化學發(fā)光檢測試劑盒購自RocheDiagnostics GmbH公司； 其他普通生化試劑購自Sigma公司、Promega公司或國產(chǎn)?；驑屝吞?PDS-1000/He (BioRad)，基因槍轉化所用的金粉購自BioRad公司。質粒pBARGUS 在文獻“Vasil，V.，et al, Bio/technology, 10(6):667_674，1992”中公開過。玉米自交系501在文獻“楊東歌，楊鳳萍，陳緒清，張立全，張曉東.外源脫水應答轉錄因子CBF4基因轉化玉米的獲得.作物學報，2009，35 (10):1759_1763”中公開過。實施例1、基因的制備及驗證利用PCR方法，從TGEV-S重組質粒病毒克隆出TGEV-S基因。重組質粒TS (含TGEV的S基因N端2.2kb片段與pMD18_T質粒載體連接而得)由北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所張莉老師提供；利用上游引物(TGEVS-F，5'-GGA TCCATG AM MA CTA TTT GTG G-3')和下游引物(TGEVS-R，5'-GAG CTC ATT ATA CAT CAC ATGGCG TTA CAG-3')，從重組質粒TS中利用PCR克隆出S基因，并上海英駿生物技術有限公司進行測序。反應體系:10XPCR Buffer 2.5 μ L，上下游引物各I μ L，dNTP (2.5mM) 2 μ L，模板 0.5 μ L，Ex Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L，ddH20 17.5 μ L，總體積 25 μ L。反應程序如下:95°C預變性5min ;94°C變性Imin ;57°C退火1.5min ;72°C延伸1.5min，共30個循環(huán)；72°C最后延伸IOrnin0將獲得的片段連接到pGEM-T，獲得陽性重組質粒定名為pT_TGEVS，測序鑒定，結果:獲得的突變基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:1 所示。也可人工合成SEQ ID NO:2所示DNA，再利用本領域常規(guī)手段將人工合成后的DNA連入 pGEM-T，獲得 pT-TGEVS。實施例2、轉基因植物的制備1、重組表達載體pBAC176基礎載體pSP72購自Promega，產(chǎn)品目錄號P2191。農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因N0S3 ^末端終止子(0.26kb)序列由pBI221 (GenbankACCESSION AF502128,從 2778-3030 位)用 SacI 和EcoRI 雙酶切回收，插入pSP72 (Promega)的SacI和EcoRI位點，用藍白斑篩選法獲得質粒pBPC18(2.7kb)。E35S 啟動子(Enhanced CaMV 35S)(Seq ID:N0.3)和 Hsp70 intronl (SeqID:N0.4)均為人工合成序列，由上海生工公司合成。E35S啟動子用Hindlll/Xbal酶切插入pBPC18的HindII I/Xbal位點，得到中間重組載體；Hsp70 intronl用BglII/BamHI酶切插入中間重組載體的BamHI位點，所得篩選插入分析正確的重組質粒，定名為pBAC154(4237bp)。重組質粒pT-TGEVS用BamHI和SacI雙酶切，回收2.2kb的TGEV-S基因，插入中間載體PBAC154 (4.2kb片段)的BamHI和SacI位點，獲得的重組表達載體定名為pBAC175。該重組表達載體PBAC175中含有E35S-HSP70 intronl-TGEVS_N0S3’的表達序列區(qū)段。將質粒pBARGUS用HindIII和BamHI酶切，回收1.0kb片段，該片段含CaMV 35S啟動子(0.45kb) +玉米Adhl內含子(0.55kb)序列，插入到pSP72的HindIII和BamHI位點，得到中間重組載體；然后將編碼抗除草劑草甘膦的玉米EPSP基因插入到中間重組載體的 BamHI 和 EcoRI 位點獲得重組質粒 pSHK49。EPSP 基因含有 GenBank Accession NumberX63374.1自5’末端第I至1335核苷酸序列。pSHK49用EcoRI位點酶切后補成平端，引入含HindIII位點的適配子(adaptor)CCCAAGCTTGGG 序列，命名為 pSHK49H3。用HindIII 酶切 pSHK49H3，回收 2.3kb 的 35S+intron+EPSP 序列片段，插入到pBAC175的HindIIII位點，選擇正向插入的陽性質粒。獲得最終的TGEV-S表達載體PBAC176。其結構圖見圖1。圖1中，組成型啟動子:35S和E35S;內含子:Adhl Intron和HSP70 Intronl (即HSP70的第一個內含子)；草甘膦篩選標記基因:EPSP ；目的基因:TGEV-S ;終止子:N0S3’ ；氨芐基因:Amp。表達載體pBAC176以EPSP基因作為選擇標記，其目的基因TGEV-S以增強型啟動子E35S為驅動。2、轉化取授粉后IOd左右的玉米優(yōu)良自交系501的果穗，用75%乙醇表面消毒后挑取其幼胚接種到誘導培養(yǎng)基(N6基本培養(yǎng)基+1Omgr1AgNO3+1OOmgL—1肌醇+21^1^2，^D+SOgL—1蔗糖+TgL—1瓊脂)上，25°C暗培養(yǎng)3 5d后誘導出胚性愈傷組織。將純化好的PBAC176載體調整濃度為Iygy ΙΛ按文獻“Zhang X-D(張曉東)，Li D-M(李冬梅)，Xu W_Y(徐文英)，Jiang Y-Y (蔣有擇)，Hu D-F (胡道芬)，Han L-X (韓立新).Development of TransgenicWheat by biolistic Bomb ardment Transferring Basta Resistance Gene and NovelHMW Glutenin Subumit Genes.Acta Agriculturae Boreall-Sinica(華北農(nóng)學報)，1997,12(1): 133-136 (in Chinese) ”中所述方法進行基因槍微彈的制備，PDS-1000/He型基因槍轟擊胚性愈傷組織，5d后將愈傷組織轉移到含有草甘膦的篩選培養(yǎng)基(誘導培養(yǎng)基中加入Smgr1草甘膦)上篩選20d左右。然后選取生長正常的愈傷組織轉移到分化培養(yǎng)基(N6基本培養(yǎng)基 +0.Smgr1AgNO3+1OOmgr1 肌醇 +1.SmgL^KT+SOgr1 蔗糖 +TgL—1 瓊脂 +lmgL—1 草甘膦)上分化，分化的幼苗在壯苗培養(yǎng)基(1/2MS基本培養(yǎng)基+Zmgr1多效唑+lOOmgL—1肌醇+0.SmgL^NAA+SOgL.1蔗糖+TgL—1瓊脂)培養(yǎng)后移栽到實驗田。得到的植物為Ttl代植株，如圖2，A:玉米幼胚誘導培養(yǎng)基上誘導愈傷組織；B:愈傷在篩選培養(yǎng)基上篩選；C:分化；D:壯苗;E:移栽。3、Ttl代轉基因植株驗證(I) PCR 驗證以Ttl代轉基因植株的葉片基因組DNA為模板，用弓I物對TGEV651-F/TGEV1625-R進行PCR擴增。非轉基因植株為陰性對照，PBAC176為陽性對照，水為空白對照。上游引物為TGEV651-F:5’ -CGCTGGCACGCTTGTAGACCTTTGG-3’ ；下游引物為TGEV1625-R:5’ -CCATAACCACTACGCTTCATAC-3’ ；反應體系為見表I。反應條件:95°C預變性5min ;94°C變性lmin，57°C復性40sec，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物加入適量的上樣緩沖液在0.8%瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測。表1、反應體系中各種成分及體積
權利要求
1.一種在植物中表達TGEV S蛋白的方法，包括如下步驟:將TGEV S蛋白的編碼基因導入出發(fā)植物，得到表達所述TGEV S蛋白的轉基因植物。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述出發(fā)植物為玉米。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述編碼基因為如下I)或2)或3)或4)所示: 1)其核苷酸序列是SEQID NO:2中自5'末端第1-2208位核苷酸所示DNA分子； 2)其核苷酸序列是 SEQID NO: 2所示DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述編碼基因是通過權利要求5所述的重組表達載體導入的。
5.一種重組表達載體，按照如下方法制備: 用SacI和EcoRI雙酶切載體pBI221，回收農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因N0S3'末端終止子片段，再將其插入載體PSP72的SacI和EcoRI位點間，得到重組載體，計作pBPC18 ； 將E35S啟動子插入pBPC18的HindIII和XbaI位點，得到中間重組載體I ;將Hsp70intronl用BglII和BamHI酶切后插入所述中間重組載體I的BamHI位點,得到重組載體，計作 pBAC154 ； 將所述TGEV S蛋白的編碼基因插入載體pBAC154的BamHI和SacI位點，得到重組載體，計作PBAC175 ； 用HindIII和BamHI酶切質粒pBARGUS，回收含有CaMV 35S啟動子和玉米Adhl內含子的目的片段，再將其插入到PSP72的HindIII和BamHI位點，得到中間重組載體2 ;將編碼抗除草劑草甘膦的玉米EPSP基因插入中間重組載體2的BamHI和EcoRI位點，獲得重組載體，計作pSHK49 ； 將pSHK49用EcoRI酶切后補成平端，引入含HindIII位點的適配子序列，計作PSHK49H3 ； 用HindIII酶切pSHK49H3，回收含有CaMV 35S啟動子和玉米Adhl內含子和EPSP基因的片段，將其插入到PBAC175的HindIIII位點，得到目的重組表達載體。
6.一種預防豬傳染性胃腸炎的產(chǎn)品，其活性成分為權利要求1-4中任一所述方法制備得到的轉基因植物的組織或器官。
7.根據(jù)權利要求6所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述組織或器官為葉片。
8.權利要求1-4中任一所述方法制備得到的轉基因植物的組織或器官在制備預防豬傳染性胃腸炎的產(chǎn)品中的應用。
9.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于:所述組織或器官為葉片。
全文摘要
本發(fā)明公開了制備轉TGEV-S基因玉米的方法。本發(fā)明提供的在植物中表達TGEV S蛋白的方法，包括如下步驟將TGEV S蛋白的編碼基因導入出發(fā)植物，得到表達所述TGEV S蛋白的轉基因植物。本發(fā)明實現(xiàn)了TGEV S蛋白在植物中的表達。本發(fā)明將TGEVS蛋白編碼基因導入玉米基因組中，在玉米中表達TGEV-S，為口服疫苗的研制和開發(fā)奠定基礎。
文檔編號A61P31/14GK103114105SQ20111036533
公開日2013年5月22日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權日2011年11月17日
發(fā)明者王金洛, 張曉東, 楊兵, 曾作財, 許承楊 申請人:北京市農(nóng)林科學院