專利名稱：一種治療仔豬白痢的中藥復(fù)方連翁止痢顆粒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸藥領(lǐng)域，涉及一種治療仔豬白痢的中藥復(fù)方制劑，具體來說，涉及一種連翁止痢顆粒及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
仔豬白痢為仔豬外感暑濕之邪，濕熱郁結(jié)腸內(nèi)，胃腸氣血阻滯，正氣與暑濕熱毒相搏，腸道粘膜及腸壁脈絡(luò)受損，化為膿血而導(dǎo)致的濕熱痢，因此當(dāng)以清熱燥濕，涼血解毒止痢之法進(jìn)行治療，邪毒被祛，則諸證可解?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃連、白頭翁、老鸛草和大黃炭的具有抗炎、抗菌和調(diào)節(jié)免疫功能的作用。仔豬白痢是由大腸桿菌感染導(dǎo)致的腹瀉，該病的發(fā)生除與大腸桿菌在腸道內(nèi)定居和產(chǎn)生腸毒素的作用有關(guān)外，還與由于年齡、免疫狀態(tài)、生理機(jī)能、飼養(yǎng)條件等多種誘因造成的消化機(jī)能紊亂有關(guān)。在各種不利因素的影響下，仔豬消化道內(nèi)食物分解不全的產(chǎn)物或由于發(fā)酵產(chǎn)生的低級脂肪酸，刺激腸蠕動加快而引起瀉下。病豬消化機(jī)能紊亂使腸道菌群失調(diào)，有害細(xì)菌大量繁殖，產(chǎn)生更多的有毒產(chǎn)物，如細(xì)菌內(nèi)毒素和腸毒素。這些有毒產(chǎn)物及食物分解不全的產(chǎn)物刺激腸粘膜發(fā)生炎癥過程，可促進(jìn)液體從腸壁向腸腔滲出，力口重了瀉下。食糜中的大量脂肪酸被向后推移，與大腸腔內(nèi)的堿性離子(鈉、鈣、鉀、鎂)結(jié)合，成為白色脂肪酸皂化物而使糞便變成灰白色，在臨床上即表現(xiàn)為白痢?，F(xiàn)有中藥技術(shù)在治療仔豬白痢方面缺乏系統(tǒng)性，有些因療效不確切而中斷使用，有些使用價格昂貴的藥物，本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，將上述中藥合用，制備成一種稱之為“連翁止痢顆?！钡募冎兴幹苿?，各藥材相互配合，發(fā)揮協(xié)同增效作用，使用方便、作用機(jī)理明確、毒副作用小、治療仔豬白痢不影響人類健康。本發(fā)明的連翁止痢顆粒的制備方法包括藥材的浸潤、提取、濃縮、制粒等步驟，本發(fā)明可以有效的提聞有效成分的提取得率，提聞生物利用度，減少有效成分的損失，該制備方法適合于連翁止痢顆粒的工業(yè)化生產(chǎn)。顆粒劑有利于豬的消化、吸收，大大提高了藥物的生物利用度，既節(jié)約了中藥資源，又可適當(dāng)提高藥效。連翁止痢顆粒在使用時采用拌料飼喂，也可混水灌服，使用方便的特性有利于該藥的推廣應(yīng)用。臨床試驗結(jié)果顯示，本發(fā)明的連翁止痢顆粒用于治療仔豬白痢效果良好。其用法用量為一次量，每Ikg體重，仔豬0. 25g，一日2次，連用3日。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供由黃連、白頭翁、大黃炭、老鸛草四味中藥經(jīng)粉碎加工制備而成的顆粒齊U，具有清熱燥濕，解毒止痢的功效。方用味苦性寒之黃連為君，清熱燥濕，解毒止??；白頭翁為臣，助黃連止??；老鸛草大為佐，使黃連、白頭翁解毒止痢倍增；黃炭為使，既可協(xié)君藥黃連解毒，又能取其炒炭之收斂功效以助君臣止瀉；四味相配，互相協(xié)同，優(yōu)勢互補(bǔ)，共收清熱燥濕，解毒止痢之功。
本發(fā)明提供了一種連翁止痢顆粒及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明所用的連翁止痢顆粒使用方便、作用機(jī)理明確、毒副作用小、治療仔豬白痢不影響人類健康。顆粒劑是由中藥經(jīng)浸潤、提取、濃縮、制粒制成的，此劑型口服給藥，應(yīng)用方便。而且經(jīng)提取、濃縮后，藥物的有效成分容易釋放，顯效較快。將中藥提取、濃縮制成顆粒后，運輸方便，同時提高了制劑的穩(wěn)定性，便于保存。顆粒劑的生產(chǎn)工藝相對簡單，易操作，對生產(chǎn)機(jī)械無特殊要求，易生產(chǎn)。因此，該處方制成顆粒劑，通過實驗所選劑型工藝亦可 行，便于生產(chǎn)、使用、貯存和運輸。本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)。一種治療仔豬白痢的中藥顆粒劑，由以下重量配比的中藥原料藥制備而成黃連100-300g,白頭翁100-300g，老鸛草100-300g，大黃炭100_300g。優(yōu)選的由以下重量配比的中藥原料藥制備而成黃連200g，白頭翁200g，老鸛草200g，大黃炭200g。本發(fā)明還包括，本發(fā)明的顆粒劑的制備方法，該方法包括將白頭翁、黃連、老鸛草進(jìn)行提取、濃縮、然后加入大黃炭進(jìn)行制粒的步驟。其中，所述提取采用乙醇回流提取。優(yōu)選的所述提取包括以下步驟( I)黃連、白頭翁、老鸛草加入10倍量50%乙醇浸潤30分鐘都可使藥材浸潤透。(2)回流提取三次，每次I小時,每次加入10倍量50%乙醇。(3)回收乙醇后對提取液合并濃縮，濃縮到濃縮液相對密度I. 25 (60°C)。(4)提取液減壓濃縮至相對密度為1.25 (60°C)的稠膏，加入大黃炭粉，混勻，干燥，粉碎，得到藥物活性成分。其中，所述制粒包括以下步驟藥物活性成分加入輔料，混勻，加入乙醇潤濕，制粒，烘干，整粒，制成。優(yōu)選的本發(fā)明的制備方法，包括以下步驟(I)黃連、白頭翁、老鸛草加入10倍重量的50%乙醇浸潤30分鐘使藥材浸潤透。(2)回流提取三次，每次I小時，每次加入10倍重量的50%乙醇。(3)回收乙醇后對提取液濃縮，濃縮程度到濃縮液相對密度I. 25 (60°C)。(4)提取液減壓濃縮至相對密度為I. 25(60°C)的稠膏，加入大黃炭粉，混勻，干燥，粉碎，加入適量輔料(蔗糖糊精=2:1)，混勻，70%乙醇潤濕，制粒，烘干，整粒，制成1000g。其中輔料加入量以使成品達(dá)到IOOOg為準(zhǔn)。本發(fā)明還包括本發(fā)明顆粒劑的檢測方法，包括黃連的薄層鑒別，大黃炭的薄層鑒另IJ，白頭翁藥材的薄層鑒別，白頭翁皂苷B4的薄層鑒別。其中黃連的薄層鑒別，步驟如下 (I)供試品溶液的制備取本品粉末0. 3g，加甲醇30ml，加熱回流15分鐘，濾過，蒸干，殘渣加甲醇IOml溶解，作為供試品溶液。( 2 )對照品溶液的制備取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作為對照品溶液。(3)對照藥材溶液的制備
取黃連對照藥材粉末0. 05g，加甲醇10ml，同法制成對照藥材溶液。(4)陰性對照溶液的制備取缺黃連陰性對照品0. 3g,同法制成陰性對照溶液。(5)薄層鑒別以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑，硅膠G薄層板，點樣量liU，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。其中，大黃的薄層鑒別，步驟如下( I)供試品溶液的制備取本品粉末0. 4g，加甲醇50ml，浸泡I小時，濾過，蒸干，殘渣加水IOOml使溶解， 再加鹽酸10ml，加熱回流30分鐘(油浴，IlO0C )，放冷，用乙醚分3次振搖提取，每次40ml，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷2ml使溶解，作為供試品溶液。( 2)對照藥材溶液的制備取大黃對照藥材0. Ig,同法制成對照藥材溶液。(3)陰性對照溶液的制備稱取按處方制備工藝制備缺失大黃炭陰性對照品0. 26g，同法制成陰性對照溶液。(4)薄層鑒別以石油醚(30-60°C)_甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，羧酸甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板，點樣量4 yl，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。其中，白頭翁藥材的薄層鑒別，步驟如下取本品3g，加石油醚30ml，超聲提取20分鐘，濾過。殘渣加70%乙醇超聲提取兩次，每次加70%乙醇30ml，提取時間20分鐘。濾過，合并提取液，濃縮，用70%乙醇定容至10ml，作為供試品溶液。另取白頭翁藥材lg，同法制備對照藥材溶液。取缺失白頭翁的陰性對照樣品2g，同法制備陰性對照溶液。以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，硅膠G薄層板，點樣量2 iil，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。其中，白頭翁皂苷B4的薄層鑒別，步驟如下取本品3g，加石油醚10ml，超聲提取20分鐘，濾過，殘渣加70%乙醇超聲提取兩次，每次30ml，提取20分鐘。濾過，合并提取液，濾液蒸干，殘渣加甲醇IOml使溶解，作為供試品溶液。再取缺失白頭翁的陰性對照樣品3g，同法制成陰性(同時按處方量制成的缺失白頭翁樣品)對照溶液；取白頭翁皂苷B4對照品，加甲醇制成每ImL含0. 5mg的溶液，作為對照品溶液。以氯仿甲醇水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，硅膠G薄層板，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加熱至斑點顯色清晰。本發(fā)明顆粒劑的使用方法如下按2g/kg/d以下劑量連續(xù)拌飼給藥5d,對仔豬無毒副作用；按體重0. 5g/kg/d劑量，分2次拌飼給藥3d，能有效治療仔豬白痢病。本發(fā)明的檢測方法是經(jīng)過篩選獲得的，篩選過程如下
2. I黃連的薄層鑒別( I)供試品溶液的制備取本品粉末0. 3g，加甲醇30ml，加熱回流15分鐘，濾過，蒸干，殘渣加甲醇IOml溶解，作為供試品溶液。( 2)對照品溶液的制備取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作為對照品溶液。(3)對照藥材溶液的制備取黃連對照藥材粉末0. 05g,加甲醇IOml,同法制成對照藥材溶液。

(4)陰性對照溶液的制備取缺黃連陰性對照品0. 3g,同法制成陰性對照溶液。(5)薄層鑒別試驗參照2005版獸藥典方法，制成供試品、對照品、對照藥材及陰性對照品溶液。試驗主要進(jìn)行黃連薄層鑒別條件優(yōu)化包括展開劑、點樣量、預(yù)飽和時間、薄層板等因素對色譜分離的影響。a展開劑的考察以硅膠G板，點樣量2iU，分別用以苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水(6:3:1.5:1. 5:0. 3)和正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2) [2]作為展開劑展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑，斑點清晰集中，確定正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑。b點樣量的考察以硅膠G板，分別點樣2 ill和I iU，以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開齊U，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。IiU的點樣量，分離度更好，確定點樣量Iu I。c飽和時間的考察以硅膠G板，點樣I iU，以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。分別考察了展開劑預(yù)飽和時間0分鐘、10分鐘對色譜圖的影響。結(jié)果表明，展開劑預(yù)飽和時間為0分鐘和20分鐘對色譜分離無明顯影響。確定展開劑無需預(yù)飽和。d薄層板的考察以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑，點樣量liU，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。對不同薄層板(G板、GF254板)進(jìn)行了考察，結(jié)果色譜行為差異不大。參照藥典選擇薄層G板。(6)小結(jié)通過薄層色譜(不同展開劑、不同點樣量、不同的預(yù)飽和時間、不同薄層板)優(yōu)化，采用色譜條件以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑，硅膠G薄層板，點樣量liU，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾。該鑒別方法簡便快速，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，收入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。2. 2大黃的薄層鑒別
( I)供試品溶液的制備取本品粉末0. 4g，加甲醇50ml，浸泡I小時，濾過，蒸干，殘渣加水IOOml使溶解，再加鹽酸10ml，加熱回流30分鐘(油浴，IlO0C )，放冷，用乙醚分3次振搖提取，每次40ml，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷2ml使溶解，作為供試品溶液。(2)對照藥材溶液的制備取大黃對照藥材0. Ig,同法制成對照藥材溶液。
(3)陰性對照溶液的制備稱取按處方制備工藝制備缺失大黃炭陰性對照品0. 26g,同法制成陰性對照溶液。(4)薄層鑒別試驗參照2005版獸藥典[3]中大黃藥材的薄層鑒別方法，以石油醚(30_60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 5 :1)的上層溶液為展開劑，主要考察了不同點樣量、不同預(yù)飽和時間、不同薄層板、不同展距對色譜分離的影響。a點樣量的考察以硅膠G薄層板，分別點樣2 ill和4 iil，以石油醚(30-60°C)_甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上層溶液為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。結(jié)果2iU的點樣量，斑點不清晰，確定點樣量4iU。b飽和時間的考察以硅膠G薄層板，點樣量4 iil，以石油醚(30-60°C)_甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。分別考察了展開劑預(yù)飽和時間0分鐘和10分鐘對色譜分離效果的影響。結(jié)果表明，展開劑預(yù)飽和時間為Omin和IOmin對色譜分離無顯著差異。確定展開無需預(yù)飽和。c薄層板的考察以石油醚(30-60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，點樣量4 Ul，展開，展距5cm，展畢，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。對不同薄層板(G板、GF254板、H板)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，硅膠H板展開斑點成點性更好，確定選擇薄層H板。d展距的選擇以石油醚(30_60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 :5 :1)的上層溶液為展開劑，羧酸甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板，點樣量4iU，展開，展距分別為5cm和10cm，取出，晾干，分別置紫外光燈(365nm)下及氨蒸氣中熏后日光下檢視。展距IOcm時分離效果更好，確定展距10cm。(5)小結(jié)通過薄層色譜條件(不同點樣量、不同預(yù)飽和時間、不同薄層板、不同展距)優(yōu)化，采用色譜條件以石油醚(30-60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上層溶液為展開劑，羧酸甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板，點樣量4 yl，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同的橙黃色熒光斑點；置氨蒸氣中熏后，斑點變?yōu)榧t色，陰性對照無干擾。該鑒別方法簡便快速，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，收入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。
2. 3白頭翁藥材的薄層鑒別(I)方法一取本品0. 3g，加入70%乙醇10ml，振搖20min，過濾，濾液濃縮至1ml，作為供試品溶液。另取對照藥材粉末O.lg，同法制成供試品溶液。取缺失白頭翁的顆粒劑0. 2g，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法，分別吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液各Iu 1，點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(70 30 10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，展距5cm,取出，晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱5 10分鐘，日光下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，本品無相對應(yīng)的斑點。(2)方法二 取本品1.5g，加水10ml，加鹽酸4ml，回流提取lh，過濾，濾液濃縮至5ml，用50ml氯仿萃取一次，氯仿提取液濃縮至5ml，制得供試品溶液。另取白頭翁藥材0. 5g，同法制成對照藥材溶液；取缺失白頭翁的陰性對照品lg，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法，分別吸取供試品溶液、對照品藥材溶液和陰性對照溶液各I U 1，點于同一硅膠 G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(65 35 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，本品無相對應(yīng)的斑點。(3)方法三取本品3g，加石油醚30ml，超聲提取20分鐘，濾過。殘渣加70%乙醇超聲提取兩次，每次加70%乙醇30ml，提取時間20分鐘。濾過，合并提取液，濃縮，用70%乙醇定容至10ml，作為供試品溶液。另取白頭翁藥材lg，同法制備對照藥材溶液。取缺失白頭翁的陰性對照樣品2g，同法制備陰性對照溶液。照薄層色譜法，分別吸取供試品溶液、對照品溶液及陰性對照溶液各Iu 1，點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(65 35 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的褐色斑點，陰性對照樣品無干擾。確定方法三為供試品溶液制備制備方法。(4)薄層鑒別實驗照方法三，分別制備供試品、對照品及陰性對照品溶液，進(jìn)一步優(yōu)化白頭翁薄層鑒條件，主要考察了不同展開劑、不同點樣量、不同飽和時間、不同薄層板、檢視方法對檢出效果的影響。a展開劑的考察以硅膠G 板，點樣 I iil，分別用氯仿-甲醇-水(60:40:10 ；65:35:10 ； 55:45:10)和正丁醇-醋酸乙酯-水(4:1:5)作為展開劑,展開,展距5cm,取出，晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果氯仿-甲醇-水(60:40:10)展開效果最佳，斑點清晰，Rf值大小適宜。確定氯仿-甲醇-水(60:40:10)作為展開劑。b點樣量的考察以硅膠G板，分別點樣I ill和2 iil，以氯仿-甲醇-水(60 40 10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果1 Ul點樣量，斑點不清晰且拖尾。確定點樣量為2iU。c飽和時間的考察
以硅膠G板，點樣2 yl，以氯仿-甲醇-水(60 40 10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，展距5cm,取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。分別考察了預(yù)飽和時間0分鐘和20分鐘對色譜分離效果的影響。結(jié)果展開劑預(yù)飽和時間為0分鐘和20分鐘對色譜分離效果無顯著影響。確定展開無需預(yù)飽和。d薄層板及檢視方法的考察以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，點樣量2 Ul，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。對不同薄層板(G板、GF254板、H板)進(jìn)行了考察。結(jié)果薄層板的類型對白頭翁的薄層分離效果影響不大，且在紫外下均無特征斑點，但硅膠G板和GF254板成點性較好，考慮到硅膠G板較通用，確定選擇硅膠G薄層板在日光下檢視。 (5)小結(jié)通過供試品溶液制備方法、薄層色譜條件(不同展開劑、不同點樣量、不同預(yù)飽和時間、不同檢視方法)優(yōu)化，采用色譜條件以氯仿-甲醇-水￠0 40 10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，硅膠G薄層板，點樣量2 yl，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。該鑒別方法簡便快速，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，收入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。2. 4白頭翁皂苷B4的薄層鑒別取本品3g，加石油醚10ml，超聲提取20分鐘，濾過，殘渣加70%乙醇超聲提取兩次，每次30ml，提取20分鐘。濾過，合并提取液，濾液蒸干，殘渣加甲醇IOml使溶解，作為供試品溶液。再取缺失白頭翁的陰性對照樣品3g，同法制成陰性(同時按處方量制成的缺失白頭翁樣品)對照溶液；取白頭翁皂苷B4對照品，加甲醇制成每ImL含0. 5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國獸藥典》2010年版二部，附錄32頁)試驗，吸取上述兩種溶液各2 yl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(60 40 10)10°C以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。結(jié)論通過供試品溶液制備方法、薄層色譜條件優(yōu)化，采用色譜條件以氯仿甲醇水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，硅膠G薄層板，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯一個相同顏色的主斑點，陰性對照無干擾。該鑒別方法簡便快速，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)。通過參照藥典與文獻(xiàn)方法，分別進(jìn)行了有效成分白頭翁皂苷B4和白頭翁對照藥材的檢出研究，結(jié)果兩種方法均能有效檢出藥物中的白頭翁。但因目前市場上無法購得中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)的白頭翁對照藥材，因為選用白頭翁皂苷B4對照品進(jìn)行白頭翁的薄層鑒別，該方法專屬性很好，沒有干擾，所以選擇以白頭翁皂苷B4作為對照來檢出復(fù)方的白頭翁，將白頭翁皂苷B4薄層鑒別的方法收入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。2. 5老鸛草的薄層鑒別( I)供試品溶液的制備取復(fù)方4. 5g，加甲醇45ml，水浴回流30分鐘，濾過，蒸干，殘渣加甲醇16ml溶解，作為供試品溶液。(2)對照藥材溶液的制備取老鸛草對照藥材lg，同法制成對照藥材溶液。 (3)陰性對照溶液的制備取缺失老鸛草陰性樣品3. 5g，同法制成陰性對照溶液。(4)薄層鑒別實驗照薄層色譜法實驗，主要考察了不同展開劑、不同顯色劑對色譜分離的影響。a展開劑的考察以硅膠G薄層板上，點樣量2iU，分別以氯仿-甲醇(10:1)，石油醚-丙酮(5:1)，石油醚-丙酮(2:1),甲苯-氯仿-丙酮(40:25:35)作為展開劑,展開，展距5cm,取出，晾干，置紫外365nm下檢視。在各展開條件下，對照藥材均無明顯斑點。b顯色劑的考察以硅膠G薄層板上，點樣量2 U 1，石油醚-丙酮(2:1)為展開劑，展開，展距5cm，取出，晾干，分別以10%硫酸乙醇、茴香醛顯色，日光下檢視，對照藥材無明顯斑點。(5)小結(jié)在不同展開體系和不同顯色劑條件下，對照藥材均無明顯斑點，不能從本品中有效檢出老鸛草藥材，老鸛草藥材的薄層鑒別方法尚待于進(jìn)一步研究，暫不列入本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的中藥顆粒劑是經(jīng)過實驗篩選獲得的，藥效學(xué)實驗數(shù)據(jù)如下以本發(fā)明實施例2所得連翁止痢顆粒對大腸桿菌感染導(dǎo)致的仔豬白痢的臨床防治效果試驗本試驗選擇患有腹瀉，排乳白或灰白色漿糊狀腥臭糞便，尾根腹側(cè)、肛門周圍粘有糞便等典型仔豬白痢臨床癥狀的揚(yáng)州江都寶龍豬場的大約梅三元雜交瘦肉仔豬為初選對象，無菌采集8頭疑似仔豬白痢患豬的肛門棉拭子和2頭病死豬發(fā)炎小腸粘膜病料，按細(xì)菌學(xué)經(jīng)典檢驗方法，經(jīng)分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、染色反應(yīng)、生化試驗和抗原血清型凝集試驗等鑒定證實，其病原主要是08:F4、0138:F4血清型的致病性大腸桿菌，據(jù)此確診該豬場仔豬所患疾病為致病性大腸桿菌引起的仔豬白痢病。選擇該豬場同日齡健康仔豬作為藥物耐受性試驗的實驗動物。通過選擇25 35日齡健康斷奶仔豬65頭作連翁止痢顆粒耐受性試驗，150頭患白痢斷奶仔豬作實驗性療效試驗和80頭25 40日齡患白痢斷奶仔豬作擴(kuò)大臨床療效試驗。具體方法如下由于引發(fā)仔豬白痢的因素很多，在試驗分組的設(shè)計過程中，應(yīng)充分考慮天氣、環(huán)境、母豬等因素對試驗結(jié)果的影響，從而確保試驗盡可能在相同條件下進(jìn)行，以減少試驗誤差，達(dá)到客觀評價藥物療效的目標(biāo)。因此，整個試驗采用同窩對照試驗原則，力求減少主、客觀因素對實驗結(jié)果的影響。試驗期間，試驗仔豬給予不添加任何抗菌素的全價飼料，按常規(guī)
飼養(yǎng)管理飼養(yǎng)。
I藥物耐受性試驗選取25 35日齡、體重5 6. 5kg的臨床健康斷奶仔65頭，逐頭稱重、編打耳號后，隨機(jī)分為3組，參照中華人民共和國獸藥典和大鼠急性毒性試驗結(jié)果[5]，其中2個給藥組各20頭仔豬，分別按連翁止痢顆粒2g/Kg/d、lg/Kg/d的劑量分2次拌飼內(nèi)服，I個空白對照組25頭仔豬，給予相應(yīng)量的醫(yī)用淀粉，連續(xù)給藥5d。給藥后每天觀察，仔細(xì)記錄各頭仔豬的采食、飲水、排便和毒性反應(yīng)出現(xiàn)的時間、死亡情況，連續(xù)觀察10d。觀察期內(nèi)自由采食和飲水。觀察期結(jié)束后分別稱重，統(tǒng)計各組的日均增重，最后各組處死2頭存活仔豬，進(jìn)行眼觀病理學(xué)檢查。2實驗性療效試驗選擇該場25 35日齡、體重為5飛.5kg的自然患白痢斷奶仔豬150頭，經(jīng)確認(rèn)仔豬未用過任何藥物治療后，逐頭編打耳號、稱重后，將同窩仔豬隨機(jī)分為5組即連翁止痢顆粒高、中、低劑量組，仔豬止痢顆粒藥物對照(陽性藥物對照)組和陽性對照(患病不給藥)組，每組各30頭。所有試驗組用藥途徑均為拌飼，分2次/d(間隔8 10h)，連用3d。按仔豬 耳號建立病歷檔案，從給藥當(dāng)日起，每天觀察并按組逐頭記錄仔豬的精神狀態(tài)、飲食狀況、腹瀉程度和糞便性狀，好轉(zhuǎn)所需時間等，觀察期為7d。觀察期結(jié)束后于IOd分別稱重，統(tǒng)計各組的日均增重(已死亡豬的日均增重記為0)，詳細(xì)分組及給藥試驗處理見表I。表I各試驗組處理情況
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il3擴(kuò)大臨床療效試驗選擇該場25 40日齡、體重為5 7. 5kg的自然患白痢斷奶仔豬80頭，經(jīng)確認(rèn)仔豬未用過任何藥物治療后，逐頭編打耳號，將同窩仔豬隨機(jī)分為2組即連翁止痢顆粒治療組和仔豬止痢顆粒治療(陽性藥物對照)組，每組40頭。兩種藥物都按體重0. 5g/Kg/d劑量(其中連翁止痢顆粒根據(jù)上述實驗性治療試驗結(jié)果確定劑量，仔豬止痢顆粒按說明書給藥)分2次(間隔8 10h)拌飼給藥，連用3d。按仔豬耳號建立病歷檔案，用藥后每天觀察記錄療效情況，觀察期為7d。因本不同窩試驗仔豬日齡和初始體重存在一定的個體差距，故不再進(jìn)行日均增重統(tǒng)計，其治療結(jié)果判斷以仔豬排出糞便性質(zhì)變化，作為藥物治療效果的判定標(biāo)準(zhǔn)，治療效果分痊愈、有效、無效3個級別，具體標(biāo)準(zhǔn)如下痊愈治療后患豬糞便成型，干稀適度，顏色正常，尾根腹側(cè)及肛門周圍粘有糞便，仔豬活動、精神和食欲恢復(fù)正常，觀察期內(nèi)無復(fù)發(fā)。有效治療后患豬糞便明顯變稠，拉稀次數(shù)明顯減少。仔豬食欲、活動和精神狀態(tài)有明顯改善。
無效治療后患豬精神、食欲、糞便無明顯改善，甚至加重或死亡。5 結(jié)果5. I藥物耐受性試驗結(jié)果試驗期間，連翁止痢顆粒2g/Kg/d劑量組和lg/Kg/d劑量組試驗仔豬采食、飲水、排便均未見異常和任何副作用及中毒現(xiàn)象。給予醫(yī)用淀粉的空白對照組有3頭仔豬分別在試驗開始后2 4d內(nèi)出腹瀉，在未經(jīng)治療的情況下，經(jīng)4 5(1逐步恢復(fù)，該組其余試驗仔豬均未見出現(xiàn)任何異常現(xiàn)象。觀察期結(jié)束后分別稱重，日均增重統(tǒng)計結(jié)果顯示連翁止痢顆粒中劑量組最高，為0. 259Kg/d，其次是連翁止痢顆粒高劑量組為0. 258Kg/d，空白對照組最低為0. 252，但3組間無明顯差異(P>0. 05)，詳細(xì)結(jié)果見表3。最后各組隨機(jī)撲殺2頭仔豬，經(jīng)剖檢胃、腸、心、肝、脾、腎、輸尿管等臟器均未見明顯病理變化，說明連翁止痢顆粒2g/Kg/d以下劑量對仔豬是安全的。表2耐受性試驗各組生長性能n=20，25
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IIIft P；Il 2 ±U, OHB0. 259±0. 01:10. 252士(>, OliH5. 2實驗性療效試驗結(jié)果至試驗結(jié)束，連翁止痢顆粒高劑量組、中劑量組和藥物對照組的治愈率分別為66. 7%,70. 0%和73. 3% ;總有效率分別為83. 4%,86. 7%和86. 7%，日均增重分別為:0. 129±0. 066Kg、0. 132±0. 064Kg和0. 131 ±0. 080Kg，且均無仔豬死亡，說明3組療效相當(dāng)，經(jīng)統(tǒng)計分析治愈率、總有效率和日均增重均無顯著性差異(P>0. 05)。而連翁止痢顆粒低劑量組的治愈率為53. 3%，總有效率為66. 7%，日均增重為0. 103±0. 066Kg,與連翁止痢顆粒高劑量組、中劑量組和藥物對照組的治愈率、總有效率和日均增重相比，均有顯著性差異(P〈0. 05)，但又顯著高于陽性對照(醫(yī)用淀粉)組的治愈率(36. 7%)、總有效率(56. 7%)和日均增重(0. 084±0. 073Kg) (P〈0. 05)。連翁止痢顆粒高劑量組、中劑量組、藥物對照組和陽性對照組的試驗?zāi)┲嘏c日均增重均極顯著地低于空白對照組(p〈0. 05)，這是因為前5組的試驗動物是患白痢病的仔豬，而后者的試驗動物是基本健康仔豬，所以它們在末重與日均增重之間理應(yīng)有極顯著差異。詳細(xì)結(jié)果見表3。表3連翁止痢顆粒治療仔豬白痢的療效試驗結(jié)果n=25，30

權(quán)利要求
1.一種治療仔豬白痢的中藥顆粒劑，其特征在于，由以下重量配比的中藥原料藥制備而成黃連100-300g，白頭翁100-300g，老鸛草100-300g，大黃炭100_300g。
2.一種治療仔豬白痢的中藥顆粒劑，其特征在于，由以下重量配比的中藥原料藥制備而成黃連200g，白頭翁200g，老鸛草200g，大黃炭200g。
3.權(quán)利要求I所述的顆粒劑的制備方法，其特征在于，包括將白頭翁、黃連、老鸛草進(jìn)行提取、濃縮、然后加入大黃炭進(jìn)行制粒的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述提取采用乙醇回流提取。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述提取包括以下步驟 (1)黃連、白頭翁、老鸛草加入10倍量50%乙醇浸潤30分鐘都可使藥材浸潤透， (2)回流提取三次，每次I小時， (3)回收乙醇后對提取液濃縮，濃縮程度到濃縮液相對密度I.25 (60°C), (4)提取液減壓濃縮至相對密度為1.25(60°C)的稠膏，加入大黃炭粉，混勻，干燥，粉碎，得到藥物活性成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述制粒包括以下步驟 藥物活性成分加入輔料，混勻，加入乙醇潤濕，制粒，烘干，整粒，制成。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)黃連、白頭翁、老鸛草加入10倍量50%乙醇浸潤30分鐘， (2)回流提取三次，每次I小時， (3)回收乙醇后對提取液濃縮，濃縮程度到濃縮液相對密度I.25 (60°C), (4)濃縮液中加入大黃炭粉，混勻，干燥，粉碎，加入蔗糖和糊精，兩者比例為2:1，混勻，用70%乙醇潤濕,制粒,烘干,整粒,制成1000g。
8.權(quán)利要求I所述的顆粒劑的檢測方法，其特征在于，包括黃連的薄層鑒別，大黃炭的薄層鑒別，白頭翁藥材的薄層鑒別，白頭翁皂苷B4的薄層鑒別。
9.權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于，其中黃連的薄層鑒別，步驟如下 (1)供試品溶液的制備 取本品粉末0. 3g，加甲醇30ml，加熱回流15分鐘，濾過，蒸干，殘渣加甲醇IOml溶解，作為供試品溶液， (2)對照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作為對照品溶液， (3)對照藥材溶液的制備 取黃連對照藥材粉末0. 05g，加甲醇10ml，同法制成對照藥材溶液， (4)陰性對照溶液的制備 取缺黃連陰性對照品0. 3g，同法制成陰性對照溶液， (5)薄層鑒別 以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)為展開劑，硅膠G薄層板，點樣量liU，展開，展距IOcm,取出，晾干,置紫外光燈(365nm)下檢視， 其中，大黃的薄層鑒別，步驟如下 (I)供試品溶液的制備 取本品粉末0. 4g，加甲醇50ml，浸泡I小時，濾過，蒸干，殘渣加水IOOml使溶解，再加鹽酸10ml，加熱回流30分鐘(油浴，IlO0C )，放冷，用乙醚分3次振搖提取，每次40ml，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷2ml使溶解，作為供試品溶液， (2)對照藥材溶液的制備 取大黃對照藥材0. lg，同法制成對照藥材溶液， (3)陰性對照溶液的制備 稱取按處方制備工藝制備缺失大黃炭陰性對照品0. 26g，同法制成陰性對照溶液， (4)薄層鑒別· 以石油醚(30-60°0-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上層溶液為展開劑，羧酸甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板，點樣量4 u 1，展開，展距10cm，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視， 其中，白頭翁藥材的薄層鑒別，步驟如下 取本品3g，加石油醚30ml，超聲提取20分鐘，濾過，殘渣加70%乙醇超聲提取兩次，每次加70%乙醇30ml，提取時間20分鐘，濾過，合并提取液，濃縮，用70%乙醇定容至10ml，作為供試品溶液， 另取白頭翁藥材lg，同法制備對照藥材溶液， 取缺失白頭翁的陰性對照樣品2g，同法制備陰性對照溶液， 以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，硅膠G薄層板，點樣量2 u 1，展開，展距5cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105°C加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視， 其中，白頭翁皂苷B4的薄層鑒別，步驟如下 取本品3g，加石油醚10ml，超聲提取20分鐘，濾過，殘渣加70%乙醇超聲提取兩次，每次30ml，提取20分鐘，濾過，合并提取液，濾液蒸干，殘渣加甲醇IOml使溶解，作為供試品溶液， 再取缺失白頭翁的陰性對照樣品3g，同法制成陰性(同時按處方量制成的缺失白頭翁樣品)對照溶液； 取白頭翁皂苷B4對照品，加甲醇制成每ImL含0. 5mg的溶液，作為對照品溶液， 以氯仿甲醇水(60 40 10) 10°C以下放置的下層溶液為展開劑，硅膠G薄層板，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加熱至斑點顯色清晰。
10.一種權(quán)利要求I所述顆粒劑的使用方法，其特征在于，按2g/kg/d以下劑量連續(xù)拌飼給藥5d，對仔豬無毒副作用；按體重0. 5g/kg/d劑量，分2次拌飼給藥3d，能有效治療仔豬白痢病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療仔豬白痢的中藥復(fù)方連翁止痢顆粒及其制備方法和應(yīng)用。以黃連300g，白頭翁300g，老鸛草200g，大黃炭200g為原料，按照科學(xué)的處方組成和工藝制備，由于經(jīng)過體外提取，藥物的有效成分可在動物的消化道內(nèi)直接被吸收，大大提高了藥物的生物利用度，既節(jié)約了中藥資源，又可適當(dāng)提高藥效。方用味苦性寒之黃連為君，清熱燥濕，解毒止??；白頭翁為臣，助黃連止??；大黃炭為佐，使黃連、白頭翁解毒止痢倍增；老鸛草為使，既可協(xié)君藥黃連解毒，又能取其炒炭之收斂功效以助君臣止瀉；四味相配，互相協(xié)同，優(yōu)勢互補(bǔ)，共收清熱燥濕，解毒止痢之功。連翁止痢顆粒在使用時采用混水灌服，使用方便的特性有利于該藥的推廣應(yīng)用。
文檔編號A61K36/718GK102764314SQ201210290320
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月15日
發(fā)明者付海寧, 龐云露, 沈巍, 王春元, 王艷玲, 賈德強(qiáng), 郝智慧, 鐘英杰 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué), 青島康地恩動物藥業(yè)有限公司, 青島康地恩藥業(yè)股份有限公司