專利名稱：骨保護素融合蛋白的制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用甲醇酵母表達生產重組骨保護素(OPG)融合蛋白的方法、含有由該方法生產的重組OPG蛋白的藥物制劑以及該藥物制劑在制備預防或治療哺乳動物骨丟失中的藥物中的用途。
背景技術：
OPG由幾個研究小組獨立發(fā)現。Simonet等(Cell.1997 Apr 18；89(2)309-19)在分析大鼠腸cDNA時發(fā)現了一個新的基因。他們在分析了大鼠、小鼠、人的cDNA后，根據序列的同源性，確定該新的基因為TNF受體家族的一員，將其命名為OPG(osteoprotegerin，骨保護素)。而Tsuda等(J-Biol-Chem.1998 Oct 16；273(42)27091-6)在人肺纖維細胞系IMR-90的培養(yǎng)基中，分離到一種肝素結合的堿性的糖蛋白，命名為OCIF(osteoelastogenesis inhibitory factor，破骨細胞生成抑制因子)，然后又從IMR-90的cDNA中克隆到其cDNA。此外，Tan等(Cell.1998 Apr 17；93(2)165-76)在分析不同的細胞系文庫時發(fā)現了OPG基因，Kwon等(FASEB Journal1998，Vol 12，p845-854)在表達序列標簽庫中尋找TNF受體中富半胱氨酸區(qū)域的同源序列時，發(fā)現了OPG基因，但他命名為TR1(TNF receptor-related molecule-1，TNF受體相關的分子-1)。還有，Yun等(J-Immunol.2001 Feb 1；166(3)1482-91)從FDC-1細胞系中克隆到OPG基因，命名為FDCR-1(follicular dendritic cellreceptor-1，小結樹突細胞受體-1)。
人、小鼠、大鼠的OPG蛋白均為401個氨基酸，人和小鼠的OPG蛋白與大鼠分別有85％和94％的同源性。前面21個氨基酸為信號肽，翻譯后被切除，形成380個氨基酸的成熟OPG蛋白。成熟蛋白共可形成7個結構域(D1-7)。N端D1-4，富含半胱氨酸，與TNFR家族其它成員的胞外域一樣參與配體的結合；C端D5-6為兩個緊密串聯的死亡域(death domain homologues regions，DDH)，類似于TNFR超家族中的幾種成員(如TNFR1、Fas)，參與調節(jié)細胞凋亡，不同的是TNFR1、Fas等僅含一個DDH；D7參與結合肝素和形成二聚體。研究發(fā)現，D1-4片段具有致破骨細胞(osteoclast，OC)形成的活性，切除194位后的C端對此活性沒有影響。
OPG是一種糖蛋白，有4-5個潛在的N糖基化位點，OPG單體在還原條件下大約為55-62kD，而去除糖基化后為40kD。OPG一般通過二硫鍵形成二聚體，在非還原條件下電泳大小為110-120kD。
人OPG基因是單拷貝基因，位于8q23-24區(qū)，全長29kb，編碼5個外顯子。實驗證實在成纖維細胞IMR 90中存在3種mRNA，分別為2.4kb、4.2kb、6.5kb。2.4kb mRNA不含內含子，為直接編碼OPG的模板，而4.2kb、6.5kb mRNA是DNA的選擇性剪接形式，分別含部分或全部內含子。OPG蛋白的表達非常廣泛。在人胚胎組織中，肺、腎、肝和腦組織中高表達。而成人組織中，OPG在胎盤、肝、胸腺、脊髓、腦中高表達，此外，在各種免疫組織、造血組織和間質中有表達。
研究發(fā)現，骨重建和骨丟失由TNF超家族的四個因子之間的平衡所控制OPG、OPGL、RANK、TRAIL。OPGL是OPG的配體，也稱為破骨細胞分化因子(osteoclast differentiation factor，ODF)，又稱TRANCE(TNF-related activation-induced cytokine，TNF相關的誘導激活的細胞因子)、RANKL(receptor activator ofnuclear factor κB ligand，核因子κB受體激活劑的配體)。OPGL整合在成骨細胞(osteoblast，OB)的細胞膜上，參與破骨細胞前體向破骨細胞分化中最基本的信號傳遞，通過與破骨細胞前體細胞膜上的RANK(receptor activator of nuclear factorκB，核因子κB受體激活劑)接觸，從而調節(jié)基因表達，促進OC后期的分化成熟。而OC在骨表面聚集、附著，合成并分泌多種溶酶體酶，這些酶降解膠原等有機骨基質，形成骨吸收小凹，因而是骨質疏松的重要因素之一。OPG通過與OPGL的結合，阻斷了OPGL和RANK之間的信號傳導，從而抑制了破骨細胞的成熟。此外，OPG與TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TNF相關的誘導凋亡的配體)結合，抑制TRAIL介導的凋亡。反之，TRAIL可以抑制OPG對OC的抑制作用。由此可見，OPG在維持四個因子間的平衡起著關鍵的作用。
OPG對于OC的分化和活性起著核心調節(jié)作用，其它骨吸收影響因子(如，PGE2，轉化生長因子TGFβ、骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMPs、甲狀旁腺激素PTH、糖皮質激素、雌激素)的作用是通過調節(jié)成骨細胞系的OPG和ODF表達，進而調節(jié)破骨細胞的分化和活性。OPG基因敲除小鼠成年后由于OC生成增加表現為嚴重的骨質疏松癥；而注射人重組OPG的小鼠出現明顯的骨量增加，伴隨OC數量減少，且其它組織未見明顯病變。OPG作用還具有特異性，即僅作用于骨組織，這為OPG的應用創(chuàng)造了較好的條件，因而具有良好的應用前景。目前，國外正在深入研究骨質疏松癥的發(fā)病機制，特別是OPG及其配體在分子水平上的精細調控機制；在應用方面則著力開發(fā)藥用OPG。
Fc指包括抗體的非抗原結合部分序列的分子或序列，優(yōu)選人源，可以來自任何一種同工型，如IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。Fc與OPG融合蛋白相比OPG具有更高的穩(wěn)定性，而且在體內的半衰期更長。而且研究發(fā)現，截短的OPG多肽融合于Fc的氨基端具有更大的優(yōu)勢。
而甲醇酵母表達體系是近幾年發(fā)展起來的高效表達系統(tǒng)，相比于大腸桿菌、哺乳動物細胞以及昆蟲細胞表達體系而言，甲醇酵母表達體系具有很好的表達可控制、可分泌表達、蛋白易于純化、表達量高、成本較低等優(yōu)點。
我們將OPG和Fc基因同時克隆到一個表達載體中，轉化甲醇酵母，篩選到了高表達菌株，然后摸索了發(fā)酵、純化工藝，實現了OPG融合蛋白的大規(guī)模生產，為其臨床應用奠定了基礎。使用本工藝生產OPG融合蛋白，表達量可以達到400mg/L，純化得率在60％以上。與已知的CHO表達系統(tǒng)相比，用甲醇酵母表達OPG融合蛋白具有更高的表達量、更高的可控性，而且生產成本更低，更容易實現大規(guī)模生產。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的在于提供用甲醇酵母表達OPG融合蛋白并分離純化制備OPG融合蛋白的生產方法。
本發(fā)明還提供一種OPG融合蛋白，及其在制備用于預防和治療哺乳動物骨丟失的藥物中的用途。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有本發(fā)明OPG融合蛋白和藥學上可接受的載體的藥物制劑。
本發(fā)明所述的OPG融合蛋白指OPG或其活性變體、片段與Fc或其變體、片段融合而成的蛋白。
本發(fā)明提供一種編碼OPG與Fc融合蛋白的核酸序列。眾所周知，一種氨基酸可以有多種密碼子編碼。本發(fā)明分別提供一種編碼OPG蛋白的核酸序列(SEQ IDNO3)和編碼Fc蛋白的核酸序列(SEQ ID NO4)，但在某些實施方案中，可以根據實際需要對核酸密碼子進行突變，特別是選用甲醇酵母偏愛密碼子，但編碼OPG融合蛋白的氨基酸序列不變。
本發(fā)明制得的OPG融合蛋白，其為R1-L-R2和R1-R2形式，其中R1為OPG蛋白、或其變體或片段，R2為Fc蛋白、或其變體或片段，L為接頭。
所述OPG蛋白、或其變體、片段選自(a)SEQ ID NO1所示的OPG蛋白序列；(b)氨基酸序列22-X，其中X為SEQ ID NO1所示的包括位置185-401的任何殘基，尤其是第22-201位氨基酸；(c)在(b)所述的氨基酸序列前加上Ile-Asp兩個氨基酸；或(d)在(b)所述的氨基酸序列前加上Met。
所述Fc蛋白、或其變體或片段選自(a)SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；(b)亞部分(a)的氨基酸序列，在以下一個或多個位置具有取代或缺失的不同氨基酸，其中的編號采用SEQ ID NO2的序列編號i.一個或多個半胱氨酸殘基；ii.一個或多個酪氨酸殘基；iii.缺失或用丙氨酸取代位置5的半胱氨酸；iv.缺失或用谷氨酰胺取代位置20的谷氨酸；v.缺失或用丙氨酸取代位置130的谷氨酸；vi.缺失或用丙氨酸取代位置105的賴氨酸；vii.缺失或取代位置107的賴氨酸；viii.缺失N端1-17位的氨基酸序列；ix.取代或缺失一個或多個殘基以消除Fc受體結合位點；x.取代或缺失一個或多個殘基以消除補體(C1q)結合位點；或xi.亞部分i-x的組合。
所述接頭選自(a)ala-(ala)n-ala，n可以是1-4間的整數；(b)gly-(gly)n-gly，n可以是0-4間的整數；(c)gly-pro-gly；(d)gly-gly-pro-gly-gly；(e)val；(f)tyr-val；(g)ser-gly-(gly)6-gly；或(h)亞部分(a)-(g)的任何組合。
本發(fā)明中所指的甲醇酵母包括巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、Pichiamathonolica等能夠利用甲醇作為唯一碳源的酵母。本發(fā)明使用的表達載體可以選用各種已知的載體，如商業(yè)化的載體pHIL-D2、pPIC9、pPICZα、pPIC3.5K等。將重組表達載體通過電轉化或原生質體轉化等方法轉入宿主細胞，利用合適的條件篩選重組子，可以誘導表達OPG融合蛋白。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，在合適的條件下發(fā)酵培養(yǎng)工程菌的步驟包括將經篩選的工程菌株活化，然后將其接入培養(yǎng)液(例如BMGY、YPD培養(yǎng)液)中，制備種子液。培養(yǎng)過夜后接種至發(fā)酵罐中，發(fā)酵用培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基(例如基礎鹽培養(yǎng)基)。發(fā)酵條件控制為pH4.0-8.0，較佳為4.5-6.0，最佳為pH5.0，溫度28℃-37℃，較佳為29℃-32℃，最佳為30℃，溶氧控制在30％以上。培養(yǎng)4-24小時后開始補料，加入甘油或葡萄糖等。當菌體OD值達到高密度(OD600為15-200)時，加入誘導劑(如甲醇)誘導表達，控制pH在3.0-7.0，最佳為pH3.0，誘導12-84小時結束。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施例中，從發(fā)酵產物中純化分離出OPG融合蛋白包括以下要點收集發(fā)酵產物，OPG融合蛋白表達產物存在于培養(yǎng)液或菌體中；如果表達產物存在于菌體中，則需破菌；經多步純化獲得產物(包括Protein A親和柱層析、離子柱層析、反向層析、透析、超濾或凝膠過濾等)；用SDS-PAGE和RP-HPLC檢驗，獲得純度大于95％的OPG融合蛋白。
該方法與已知的CHO表達系統(tǒng)相比，具有更高的OPG融合蛋白表達量、更高的可控性，而且生產成本更低，更容易實現大規(guī)模生產。
已確證，OPG融合蛋白在臨床應用上是安全有效的。因此，該多肽是安全的并適宜于藥物使用。
由采用本發(fā)明方法獲得的多肽和常規(guī)載體及助劑組成的藥物制劑，包括僅含有采用本發(fā)明方法獲得的多肽的藥物制劑，或以本發(fā)明多肽作為活性成分，與傳統(tǒng)的輔劑和添加物一起組成的藥物制劑。這類制劑包括注射針劑、口服制劑、含服制劑及肺部、氣道、鼻腔給藥制劑及其他非腸道給藥組合物。
注射針劑含有采用本發(fā)明方法獲得的活性多肽，優(yōu)選以無菌凍干物儲存。在給藥前與合適的等滲溶液混合，等滲溶液包括傳統(tǒng)的適于注射或注入的等滲水系統(tǒng)，其中含有用于注射液的普通添加物如穩(wěn)定劑和促溶劑，優(yōu)選生理鹽水或通過緩沖液調成的等滲溶液。
口服制劑含采用本發(fā)明方法獲得的活性多肽，包括按已知方法制備的固體組合物、液體組合物及噴霧組合物。這類組合物為含有采用本發(fā)明方法獲得的活性多肽與至少一種常用的惰性稀釋劑混合。這類組合物在一般情況下，也可加入惰性稀釋劑之外的其他添加物，如潤滑劑(例如硬脂酸鎂)、懸浮劑、崩解劑(如甘醇酸纖維素鈣)、穩(wěn)定劑(例如乳糖)、助溶劑(例如谷氨酸、天冬氨酸)、甜味劑、芳香劑以及防腐劑等。
含服制劑及肺部、氣道、鼻腔給藥制劑及其他非腸道給藥組合物含有采用本發(fā)明方法獲得的活性多肽，包括采用本發(fā)明方法獲得的活性多肽與普通添加物如惰性稀釋劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、潤滑劑等混合，然后采用已知方法制得的噴劑、搽劑、栓劑、藥膏等。
OPG融合蛋白可以用于預防和治療骨丟失類疾病，如骨質疏松癥(原發(fā)性骨質疏松癥、內分泌性骨質疏松癥、青少年骨質疏松癥和廢用性骨萎縮)、佩吉特病(變形性骨炎)、繼發(fā)性高鈣血癥、特發(fā)性或繼發(fā)性骨壞死的進行性骨丟失、類風濕性和骨性關節(jié)炎引起的骨丟失和關節(jié)軟骨損傷、牙周骨丟失、溶骨性的骨腫瘤和惡性腫瘤骨轉移，并且可以阻止骨與人工假體界面發(fā)生骨吸收從而預防假體松動。


圖1顯示本發(fā)明重組質粒1的構建示意圖。
圖2顯示OPG融合蛋白在甲醇酵母中的表達。
圖3顯示本發(fā)明重組質粒2的構建示意圖。
圖4顯示本發(fā)明重組質粒3的示意圖。圖中“Ampicillin”指氨芐青霉素抗性基因。
圖5顯示本發(fā)明重組質粒4的示意圖。
圖6為Protein A柱子層析圖譜及收集樣品電泳圖。
圖7為Sephacryl S-200HR層析圖。
具體實施例方式
實施例1表達載體為pPICZαC的工程菌構建本例利用Invitrogen公司的EasySelectTMPichia表達系統(tǒng)表達OPG融合蛋白。用pPICZαC為表達載體，將OPG基因與Fc基因克隆于α因子信號肽基因后。
1.1基因的克隆與重組質粒1的構建(圖1)。
設計并合成引物OPG1，OPG2，Fc1，Fc2(SEQ ID NO5、6、7、8)，以OPG1、OPG2為引物，以從肝組織中抽提的總RNA為模板合成的第一鏈cDNA為模板，PCR擴增OPG基因序列，其中在5’端和3’端分別引入Cla I和Eco RI位點。以Fc1、Fc2為引物，以從外周血淋巴細胞中抽提的總RNA為模板合成的第一鏈cDNA為模板，PCR擴增Fc基因，在5’端和3’端分別引入Kpn I和Xba I位點。PCR條件為94℃ 1分鐘，52℃1分鐘，72℃ 1分30秒，此為一循環(huán)，共35輪循環(huán)。PCR產物回收后，將其克隆至pGEM-T載體中，得到重組質粒pGEM-T-OPG和pGEM-T-Fc，經測序確定為OPG和Fc的基因序列。
用KpnI和Xba I切開表達質粒pPICZαC，然后與經KpnI和Xba I處理的Fc基因片段連接，將所得連接物轉化大腸桿菌TOP10F′(購自Invitrogen公司)。然后將該轉化的TOP10F′涂布到含有25μg/ml ZeocinTM的低鹽LB平板上。篩選轉化子得到重組質粒，然后用Cla I和Eco RI切開重組質粒，與經Cla I和Eco RI處理的OPG基因片段連接，然后轉化大腸桿菌TOP10F’。將該轉化的TOP10F′涂布到含有25ug/ml ZeocinTM的低鹽LB平板上，篩選轉化子得到重組質粒1。經DNA序列分析與設計序列相同。
1.2用重組質粒1轉化宿主菌X-33大量抽提重組質粒1，用Sac I線性化，然后用無水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉化制備好的X-33宿主菌，將其涂布到含有100ug/ml ZeocinTM的YPDS篩選培養(yǎng)基上。30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉化子。
1.3表達篩選從轉化子中挑選20個單克隆，分別接種到25ml的BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至OD600到5.0，離心收集菌體，懸浮到150ml的BMMY培養(yǎng)基中誘導表達，每24小時加入1.5ml甲醇，誘導表達72小時，取樣進行SDS-PAGE，看到在100kd左右有明顯的表達條帶，為OPG融合蛋白的二聚體，篩選高表達菌株為工程菌(圖2)。
實施例2表達載體為pPIC9的工程菌的構建本例使用Invitrogen公司的巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)表達OPG融合蛋白。
2.1重組質粒2的構建(圖3)
設計并合成引物OPG3、OPG4、Fc3、Fc4(SEQ ID NO9、10、11、12)，引物OPG3中引入XhoI酶切位點和酵母α信號肽切割位點(KEX2酶識別位點)，引物OPG4引入Sna BI，引物Fc3和Fc4分別引入Sna BI和Not I位點。以pGEM-T-OPG為模板，以OPG3、OPG4為引物，PCR擴增OPG基因，電泳回收基因片段，用Xho I和Sna BI酶切處理并回收。同時用XhoI和Sna BI酶切pPIC9質粒，電泳回收后與XhoI和Sna BI處理后的OPG基因片段連接，然后轉化大腸桿菌DH5α(購自Invitrogen公司)，篩選轉化子得到重組質粒pPIC9-OPG。然后以pGEM-T-Fc為模板，以Fc3、Fc4為引物，PCR擴增Fc基因，電泳回收基因片段，用Sna BI和Not I酶切處理并回收。同時用Sna BI和Not I酶切pPIC9-OPG質粒，電泳回收后與Sna BI和Not I處理的Fc基因片段連接，然后轉化大腸桿菌DH5α。將轉化的DH5α涂布到在含有100ug/ml氨芐青霉素的LB平板上，篩選轉化子得到重組質粒2。DNA序列分析證明基因序列正確。
2.2用重組質粒2轉化宿主菌GS115大量抽提重組質粒2，用SalI線性化，然后用無水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉化制備好的GS115宿主菌，涂布在MD篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉化子。
2.3表達篩選從MD平板上選20個單克隆分別接種到3ml MGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48小時后加入27ml MM培養(yǎng)基進行誘導，表達72小時，取樣進行SDS-PAGE檢測，篩選高表達的菌株為工程菌株。
實施例3表達載體為pMETαA的工程菌的構建本例使用Invitrogen公司Pichia mathonolica表達系統(tǒng)表達OPG融合蛋白。
3.1重組質粒3的構建用Xho I和Not I雙酶切實施例2中的重組質粒2，回收OPG和Fc融合蛋白基因片段，與經Xho I和Not I酶切處理的pMETαA質粒連接，轉化大腸桿菌DH5α。將轉化的大腸桿菌涂布到含有100ug/ml氨芐青霉素的LB平板上，篩選轉化子得到重組質粒3(圖4)。
3.2重組質粒3轉化宿主菌PMAD11大量抽提重組質粒3，用Apa I線性化，然后用無水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉化制備好的PMAD11宿主菌，涂布在MD篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉化子。
3.3表達篩選從MD平板上挑選20個單克隆分別接種到50ml的BMDY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)到OD600為6.0，離心收集菌體，重新懸浮到5ml的BMMY培養(yǎng)基中誘導表達，每24小時補加50ul的甲醇，誘導表達72小時，取樣進行SDS-PAGE，篩選高表達菌株為工程菌。
實施例4表達載體為pGAPZαA的工程菌的構建本例使用Invitrogen公司的連續(xù)表達載體pGAPZα載體表達OPG融合蛋白。
4.1重組質粒4的構建用Xho I和Not I雙酶切實施例2中的重組質粒2，回收OPG和Fc融合蛋白基因片段，與Xho I和Not I酶切處理的pGAPZαA質粒連接，轉化大腸桿菌TOP10F’，涂布含有25ug/ml ZeocinTM的低鹽LB平板上，篩選轉化子得到重組質粒4(圖5)。
4.2重組質粒1轉化宿主菌X-33大量抽提重組質粒1，用Avr II線性化，然后用無水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉化制備好的X-33宿主菌，涂布含有100ug/ml ZeocinTM的YPDS篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉化子。
4.3表達篩選從轉化子中挑選20個單克隆，分別接種到50ml的YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)表達72小時，取樣進行SDS-PAGE，篩選高表達菌株為工程菌。
實施例5工程菌的發(fā)酵將自存的實施例1中獲得的工程菌株接種于BMGY培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24小時后，作為種子液接種于發(fā)酵罐中。發(fā)酵培養(yǎng)基為加入了微量元素的基礎培養(yǎng)基溶液，發(fā)酵溫度30℃，pH5.0，控制溶解氧不低于30％。菌體生長24小時后開始補加甘油，同時將pH下調到4.0。菌體OD達到200時開始加入甲醇誘導表達，同時加1％蛋白胨保護目的蛋白。起始甲醇添加量控制為每升每小時1-2ml，隨后逐漸增大為每升每小時至5-10ml，通過調節(jié)攪拌速度和通氣量保持溶氧值大于20％，必要時通入純氧。連續(xù)誘導培養(yǎng)72小時后收獲培養(yǎng)液，離心收集上清，4.0℃或-20℃保存。測得OPG融合蛋白表達量為400mg/L。
實施例6發(fā)酵產物的純化將實施例5獲得的發(fā)酵液用磷酸鹽緩沖液調節(jié)pH至7.4～7.6，用MWCO20KD的超濾膜濃縮至原體積的1/5，上樣至Protein A Sepharose FF親和層析柱，目的蛋白結合后，用280nm紫外檢測儀監(jiān)測下，用0.1mol/L、pH7.6的磷酸鹽緩沖液沖洗至基線。圖6顯示Protein A柱子層析圖譜及收集樣品的電泳圖譜。在圖6A中，從左向右，第一峰為上樣峰，第二峰為pH3.5洗脫峰，為目的蛋白，第三峰為pH2.0洗脫雜蛋白峰。
用0.1mol/L pH3.5的乙酸鹽緩沖液洗脫目的蛋白，收集洗脫峰，用50mM的磷酸鹽緩沖液調節(jié)pH至7.2，然后用Sephacryl S-200HR層析收集第二洗脫峰為目的蛋白峰。SDS-PAGE顯示蛋白純度大于95％。圖7為Sephacryl S-200HR層析圖，圖中，最后一個蛋白峰為目的蛋白。純化得率在60％以上。
實施例7活性試驗取小鼠骨髓單核巨噬細胞系RAW264.7和骨髓間質細胞，含有20％滅活小牛血清的DMEM液調整細胞密度為1×106/ml、4×103/ml，加入24孔板中(1ml/孔)，加入1×10-8mol/ml的1，25-(OH)2D3和1×10-7mol/ml的地塞米松Dex，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)7天。破骨細胞分化實驗組加入實施例6中獲得的骨保護素融合蛋白(100ng/ml)，對照組、實驗組各有2孔內加入骨片；破骨細胞活性抑制實驗組在第7天觀察孔內有多核巨細胞后，加入實施例6中獲得的骨保護素融合蛋白(100ng/ml)培養(yǎng)24小時。
破骨細胞活性觀察(1)抗酒石酸鹽酸性磷酸酶染色(Leder-Stutt改良萘酚AS-TR磷酸酯法)實驗組和對照組的4孔進行TRACP染色，具有酸性磷酸酶活性的多核巨細胞呈紅色，胞核呈綠色(甲基綠復染)。(2)骨吸收陷窩將骨片用0.25％戊二醛固定，TRACP染色，TRACP陽性的、含有三個細胞核以上的巨細胞為成熟的破骨細胞；骨片放入50mM的氨水中超聲振蕩沖洗，去除骨片上的破骨細胞，對骨片進行甲苯胺藍染色，顯微鏡下觀察骨吸收陷窩；再次采用超聲振蕩沖洗骨片，在濃度遞進的酒精溶液中進行系列脫水，自然風干后，掃描電鏡封固前將骨片置于真空干燥機中數小時，骨片鍍金(厚度為30nm)，掃描電鏡下觀察骨吸收陷窩。(3)吸取24小時細胞培養(yǎng)的上清液，測酸性磷酸酶的濃度(干片法)。
實驗結果
(1)分化抑制實驗培養(yǎng)7天后，對照組出現了較多的多核巨細胞，TRACP染色為陽性，而實驗組(加入骨保護素融合蛋白)無多核巨細胞出現，并且TRACP染色為陰性。
骨吸收陷窩觀察TRACP染色(×40)第5組骨片上附著有紅染的多核巨細胞，而第6組的骨片上無TRACP陽性染色；甲苯胺藍染色(×400)第5組骨片上可以看到藍色的骨片出現孤立的、黑色邊緣圍繞的、中央部淡染的卵圓形凹陷，而第6組骨片的表面則是光滑的；掃描電鏡觀察(×5,000)第5組骨片上出現穿鑿樣、溶巖狀卵圓形凹陷。
(2)活性抑制實驗組加入骨保護素融合蛋白的3孔繼續(xù)培養(yǎng)24小時，TRACP染色轉為陰性，而對照組的另3孔TRACP染色仍為陽性。
結論單核細胞與骨髓間質細胞共育方法可用于體外培養(yǎng)破骨細胞；體外實驗證實實施例6中獲得的OPG融合蛋白對于破骨細胞的分化和活性均有抑制作用。
序列表<110>上海富純中南生物技術有限公司<120>骨保護素融合蛋白的制備方法和用途<130>032708<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>401<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(401)<223>OPG蛋白<400>1Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile1 5 10 15Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp20 25 30Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr35 40 45Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro50 55 60Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys65 70 75 80Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu85 90 95Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr100 105 110Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe115 120 125Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg130 135 140
Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys145 150 155 160Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys165 170 175Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr180 185 190Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg195 200 205Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val210 215 220Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile225 230 235 240Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu245 250 255Trp Lys His Gln Asn Lys Ala Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln260 265 270Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala275 280 285Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly290 295 300Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys305 310 315 320Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn325 330 335Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser340 345 350Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr355 360 365Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu370 375 380Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys385 390 395 400Leu
<210>2<211>232<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(232)<223>Fc蛋白<400>2Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala1 5 10 15Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro20 25 30Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val35 40 45Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val50 55 60Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln85 90 95Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala100 105 110Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro115 120 125Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr130 135 140Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser145 150 155 160Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr165 170 175Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr180 185 190Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe195 200 205Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225 230<210>3<211>2412<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>OPG蛋白的編碼序列<400>3atgaacaagt tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc60tacttgttca acgacacgac gcgcgagcac aaagacctgt agaggtaatt cacctggtgg 120caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 180gtcctttgca aaggaggttt catggaagta atactgcttc tttggagagt agtcgacaac 240tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 300acactgttta caggaggacc atggatggat tttgttgtga catgtcgttt caccttctgg 360gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 420cacacgcggg gaacgggact ggtgatgatg tgtctgtcga ccgtgtggtc actgctcaca 480ctatactgca gccccgtgtg caaggagctg cagtacgtca agcaggagtg caatcgcacc 540gatatgacgt cggggcacac gttcctcgac gtcatgcagt tcgtcctcac gttagcgtgg 600cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa 660gtgttggcgc acacgcttac gttccttccc gcgatggaac tctatctcaa gacgaacttt 720cataggagct gccctcctgg atttggagtg gtgcaagctg gaaccccaga gcgaaataca 780gtatcctcga cgggaggacc taaacctcac cacgttcgac cttggggtct cgctttatgt 840gtttgcaaaa gatgtccaga tgggttcttc tcaaatgaga cgtcatctaa agcaccctgt 900caaacgtttt ctacaggtct acccaagaag agtttactct gcagtagatt tcgtgggaca 960agaaaacaca caaattgcag tgtctttggt ctcctgctaa ctcagaaagg aaatgcaaca 1020tcttttgtgt gtttaacgtc acagaaacca gaggacgatt gagtctttcc tttacgttgt 1080cacgacaaca tatgttccgg aaacagtgaa tcaactcaaa aatgtggaat agatgttacc 1140gtgctgttgt atacaaggcc tttgtcactt agttgagttt ttacacctta tctacaatgg 1200ctgtgtgagg aggcattctt caggtttgct gttcctacaa agtttacgcc taactggctt 1260gacacactcc tccgtaagaa gtccaaacga caaggatgtt tcaaatgcgg attgaccgaa 1320agtgtcttgg tagacaattt gcctggcacc aaagtaaacg cagagagtgt agagaggata 1380tcacagaacc atctgttaaa cggaccgtgg tttcatttgc gtctctcaca tctctcctat 1440aaacggcaac acagctcaca agaacagact ttccagctgc tgaagttatg gaaacatcaa 1500tttgccgttg tgtcgagtgt tcttgtctga aaggtcgacg acttcaatac ctttgtagtt 1560aacaaagccc aagatatagt caagaagatc atccaagata ttgacctctg tgaaaacagc 1620ttgtttcggg ttctatatca gttcttctag taggttctat aactggagac acttttgtcg 1680gtgcagcggc acattggaca tgctaacctc accttcgagc agcttcgtag cttgatggaa 1740cacgtcgccg tgtaacctgt acgattggag tggaagctcg tcgaagcatc gaactacctt 1800agcttaccgg gaaagaaagt gggagcagaa gacattgaaa aaacaataaa ggcatgcaaa 1860tcgaatggcc ctttctttca ccctcgtctt ctgtaacttt tttgttattt ccgtacgttt 1920cccagtgacc agatcctgaa gctgctcagt ttgtggcgaa taaaaaatgg cgaccaagac 1980gggtcactgg tctaggactt cgacgagtca aacaccgctt attttttacc gctggttctg 2040accttgaagg gcctaatgca cgcactaaag cactcaaaga cgtaccactt tcccaaaact 2100tggaacttcc cggattacgt gcgtgatttc gtgagtttct gcatggtgaa agggttttga 2160
gtcactcaga gtctaaagaa gaccatcagg ttccttcaca gcttcacaat gtacaaattg 2220cagtgagtct cagatttctt ctggtagtcc aaggaagtgt cgaagtgtta catgtttaac 2280tatcagaagt tatttttaga aatgataggt aaccaggtcc aatcagtaaa aataagctgc 2340atagtcttca ataaaaatct ttactatcca ttggtccagg ttagtcattt ttattcgacg 2400ttataaaata tt 2412<210>4<211>1404<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>Fc蛋白的編碼序列<400>4gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60ctcgggttta gaacactgtt ttgagtgtgt acgggtggca cgggtcgtgg acttgaggac 120gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 180ccccctggca gtcagaagga gaaggggggt tttgggttcc tgtgggagta ctagagggcc 240acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 300tggggactcc agtgtacgca ccaccacctg cactcggtgc ttctgggact ccagttcaag 360aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 420ttgaccatgc acctgccgca cctccacgta ttacggttct gtttcggcgc cctcctcgtc 480tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 540atgttgtcgt gcatggcaca ccagtcgcag gagtggcagg acgtggtcct gaccgactta 600ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 660ccgttcctca tgttcacgtt ccagaggttg tttcgggagg gtcgggggta gctcttttgg 720atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 780tagaggtttc ggtttcccgt cggggctctt ggtgtccaca tgtgggacgg gggtagggcc 840gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 900ctactcgact ggttcttggt ccagtcggac tggacggacc agtttccgaa gatagggtcg 960gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1020ctgtagcggc acctcaccct ctcgttaccc gtcggcctct tgttgatgtt ctggtgcgga 1080cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1140gggcacgacc tgaggctgcc gaggaagaag gagatgtcgt tcgagtggca cctgttctcg 1200aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1260tccaccgtcg tccccttgca gaagagtacg aggcactacg tactccgaga cgtgttggtg 1320tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatgat aaatgtgcgt cttctcggag 1380agggacagag gcccatttac tatt 1404<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5
agcatcgatg aaacgtttcc tccaaagtac c 31<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6ctcgaattcc agggtaacat ctattccac29<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7atcggtaccg agcccaaatc ttctgac 27<210>8<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>12ttcgcggccg cttatcattt acccggagac 30
權利要求
1.一種產生OPG融合蛋白的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼OPG、其變體或片段的核苷酸序列和編碼Fc蛋白、其變體或片段的核苷酸序列可操作地連于表達載體，得到OPG融合蛋白重組表達載體；(b)將步驟(a)中的重組表達載體轉入甲醇酵母，篩選獲得表達OPG融合蛋白的工程菌；(c)在合適的條件下發(fā)酵培養(yǎng)步驟(b)獲得的工程菌；(d)從步驟(c)中的發(fā)酵培養(yǎng)產物中純化分離所述融合蛋白。
2.如權利要求1的方法，其特征在于，所述融合蛋白的形式為R1-L-R2和R1-R2，其中R1為OPG蛋白、或其變體或片段，R2為Fc蛋白、或其變體或片段，L為接頭。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述OPG蛋白、或其變體、片段選自(a)SEQ ID NO1所示的OPG蛋白序列；(b)氨基酸序列22-X，其中X為SEQ ID NO1所示的包括位置185-401的任何殘基，特別是第22-201位氨基酸；(c)在(b)所述的氨基酸序列前加上Ile-Asp兩個氨基酸；(d)在(b)所述的氨基酸序列前加上Met；所述Fc蛋白、或其變體或片段選自(A)SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；(B)亞部分(A)的氨基酸序列，在以下一個或多個位置具有取代或缺失的不同氨基酸，其中的編號采用SEQ ID NO2的序列編號i.一個或多個半胱氨酸殘基；ii.一個或多個酪氨酸殘基；iii.缺失或用丙氨酸取代位置5的半胱氨酸；iv.缺失或用谷氨酰胺取代位置20的谷氨酸；v.缺失或用丙氨酸取代位置130的谷氨酸；vi.缺失或用丙氨酸取代位置105的賴氨酸；vii.缺失或取代位置107的賴氨酸；viii.缺失N端1-17位的氨基酸序列；ix.取代或缺失一個或多個殘基以消除Fc受體結合位點；x.取代或缺失一個或多個殘基以消除補體(Clq)結合位點；xi.亞部分i-x的組合。
4.權利要求2的所述方法，其特征在于，所述接頭選自(a)ala-(ala)n-ala，n可以是1-4間的整數；(b)gly-(gly)n-gly，n可以是0-4間的整數；(c)gly-pro-gly；(d)gly-gly-pro-gly-gly；(e)val；(f)tyr-val；(g)ser-gly-(gly)6-gly；(h)亞部分(a)-(g)的任何組合。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟c)包括在pH 4.0-8.0、28-37℃、溶氧控制在30％以上的條件下發(fā)酵，培養(yǎng)4-24小時，然后加入甘油或葡萄糖；當菌體OD600值達到15-200時，加入誘導劑誘導表達，此時控制pH為3.0-7.0，誘導12-72小時。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟d)包括采用Protein A親和層析、分子篩層析獲得目的蛋白。
7.一種OPG融合蛋白，其特征在于，它為R1-L-R2或R1-R2形式，其中，R1為SEQ ID NO1的第22-201位氨基酸序列，R2為SEQ ID NO2所示的序列，L為接頭。
8.一種用于治療或預防哺乳動物骨丟失的藥物制劑，其特征在于，它含有權利要求7所述的OPG融合蛋白和藥學上可接受的載體。
9.權利要求7所述的OPG融合蛋白的用途，其特征在于，用于制備治療或預防哺乳動物骨丟失用的藥劑。
10.如權利要求9所述的用途，其特征在于，所述骨丟失選自骨質疏松癥、佩吉特病、骨髓炎、血鈣過多、與手術或服用類固醇相關的骨質減少、骨壞死、由類風濕關節(jié)炎引起的骨丟失、牙周骨丟失、溶骨性轉移、假肢松動和癌癥與癌癥相關的骨丟失。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種OPG融合蛋白的生產方法和用途，它為R1－L－R2形式，其中R1為OPG蛋白、其變體或片段，R2為Fc蛋白、其變體會片段；L為接頭。本發(fā)明獲得的融合蛋白可用于治療骨質疏松和腫瘤相關骨損失等。
文檔編號A61P19/08GK1566157SQ0312930
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月16日 優(yōu)先權日2003年6月16日
發(fā)明者倪健, 楊武劍, 羅鵬, 楊子義, 遲志永 申請人:上海富純中南生物技術有限公司