專利名稱：草酰氨基酸衍生物，其制備方法及其用作抑制脯氨酸羥化酶的藥物的制作方法
草酰氨基酸衍生物是已知的，例如，在FR-A 2，010，601，JP43/10614或生物化學(Bio chemistry)，27(8)，2934-2943(1988)中敘述過。然而，這些化合物用作藥物，以前并未敘述過?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)式Ⅰ的草酰氨基酸衍生物和其主要以鈍D-型和L-型的化合物及其藥用鹽是脯氨酸羥化酶和賴氨酸羥化酶的良好抑制物，
其中R和R′是相同或不同的C1-C6烷基或H，R1是H或C1-C4-烷基，R2是H，C1-C6-烷基，C1-C3-烷氧基，羧基，C1-C6-烷氧羰基，芳基，SH，NH2或鹵素，這里的烷基是未被取代或者被芳基，OH，SH，或NH2基團取代，或者R1和R2一起構成C2-C4-亞烷基鏈。
本發(fā)明涉及上述化合物作為藥物的用途，特別是用作影響膠原和類膠原物質(zhì)的代謝或生物合成的藥物。
本發(fā)明尤其涉及式Ⅰ中如下取代時的那些化合物的應用，其中R和R′是相同或不同的C1-C3-烷基，Na或K，R′是氫，甲基或乙基，R2是氫或C1-C4-烷基，這里的烷基是未取代或被苯基或SH取代或R1和R2一起形成C2-或C3-亞烷基鏈。
式Ⅰ中的化合物的用途在如下的情況時是特別好的，其中，R和R′是相同的甲基，乙基，Na或K，R1是氫或甲基，R2是氫，C1-C3-烷基，芐基或硫甲基，或R1和R2一起形成亞乙基鏈。
有3個或更多碳的烷基可以是直鏈和支鏈。芳基其含意可理解為芳香烴類，特別是苯基和萘基。鹵素可認為是F，Cl，Br和I，特別是Cl和Br。
式(Ⅰ)的化合物的制備是已知的，例如在FR-A2，010，601中所述。其制備方法只不過是將1-3當量的氨基酸酯氫鹵酸鹽，(最好是鹽酸鹽)和1-5當量的堿合并，這里使用的堿例如碳酸鹽或碳酸氫鹽，如碳酸鈉或碳酸鉀，或碳酸氫鈉或碳酸氫鉀，或者為叔胺，如三乙胺，三丁胺，乙基二異丙胺，或者為雜環(huán)胺如N-烷基嗎啉，吡啶，喹啉或二烷基苯胺。
如果需要，許多堿可同時使用。反應溫度是-30℃到150℃，以20℃到100℃較好。如果需要，反應也可在溶劑中進行，如乙醚或二甲氧基乙烷或四氫呋喃，氯化烴類如二氯甲烷，氯仿，三或四氯乙烯，苯，甲苯以及極性溶劑如二甲基甲酰胺，丙酮，醇類如甲醇或乙醇或二甲基亞砜。然后在-78℃和100℃之間，最好是在-20℃和+20℃之間慢慢加1-3當量草酸酯酰氯。如果需要，該反應也可在上述溶劑中進行。用薄層層析檢測反應是否完全。
如果需要，可用例如提取或者用硅膠層析處理產(chǎn)物，分離的產(chǎn)物可用重結晶純化。
式Ⅰ的R和/或R′為堿金屬，例如Na或K的化合物可以用如下方法制備，例如由式Ⅰ的R和/或R′為C1-C4-烷氧基的相應化合物在堿性介質(zhì)中水解，如NaOH或KOH，溶劑為低分子量醇中如甲醇或乙醇，或者在醚中如二甲氧基乙烷或四氫呋喃，如果需要可有水存在。所得鹽的金屬陽離子可用常規(guī)的方法通過離子交換劑酸化，以任何所需的陽離子取代。為此，例如將酸通過裝有陽離子交換劑的柱子，這種交換劑例如是基于聚苯乙烯/二乙烯苯(Amberlite CG-150或
Dowex-CCR-2)的樹脂。陽離子交換劑載有所要的陽離子，例如銨離子，是由伯胺、仲胺或叔胺產(chǎn)生的。洗脫液經(jīng)蒸發(fā)可得所要的鹽。
由伯，仲或叔胺產(chǎn)生的酸的銨鹽也可用下法制備，即向游離酸的醇溶液加等摩爾量的適當?shù)陌罚缓笳舻羧軇┘纯伞?br> 由外消旋物制備以D-或L-對映體為主的純化合物，同樣可用文獻已知的方法進行，例如，用分步結晶法或用酶處理法進行。另外一種可行的方法是由適當?shù)腄-或L-前體(起始物)直接合成純的對映體化合物。
本發(fā)明的物質(zhì)作為可逆的抑制劑對脯氨酸羥化酶是有效的。因此，這些物質(zhì)選擇性地抑制膠原特異的羥化反應，在該反應過程中，脯氨酸羥化酶羥化結合于蛋白中的脯氨酸。該反應在抑制劑的作用下，形成無功能的、羥化不全的膠原分子，該類分子只有少量釋放入細胞間隙中。羥化不全的膠原不能另外參入到膠原基質(zhì)中，而很容易發(fā)生蛋白水解性的降解過程。由于這些作用，細胞外沉積的膠原總量減少。因此，脯氨酸羥化酶抑制劑在治療主要由于膠原沉積引起的征候群方面是適宜的手段。其中特別包括肺、肝和皮膚(硬皮病)的纖維化以及動脈粥樣硬化。
另外，用已知的抑制劑如α，α′-聯(lián)吡啶對脯氨酸羥化酶的抑制導致巨噬細胞的生物合成膠原的抑制也是已知的(W.Muller etal，F(xiàn)EBS Lett，90，218以及下列等等(et seq)(1978))。結果不能發(fā)生補體活化經(jīng)典的途徑;因此，脯氨酸羥化酶抑制劑在像免疫綜合癥方面也起免疫抑制劑的作用。
因此，本發(fā)明的物質(zhì)可用作纖維化抑制劑，免疫抑制劑及抗動脈粥樣硬化劑。
抗纖維化的活性可用四氯化碳誘發(fā)的肝纖維變性模型測定。為此，用溶在橄欖油中的CCl4(1ml/Kg)處理大鼠每周兩次。受試物質(zhì)溶在適宜的溶劑每天給藥，如果合適甚至可每天給兩次，口服或腹腔注射。用組織學方法測定肝纖維變性的程度和用測定羥基脯氨酸分析肝中膠原的比例，如Kivirikkoetal.在(Anal、Biochem、19，249等等(1967))所述。纖維發(fā)生的活力可用放射免疫測定血清中的膠原組分和原膠原肽。本發(fā)明的化合物在濃度為1-100mg/kg時對這種模型是有效的。另一個評價抗生活性的模型是Kelley等(J.Lab、Clin、Med、96，954，(1980)敘述的博萊霉素誘發(fā)的肺纖維變性。為評價本發(fā)明化合物對肉芽發(fā)生組織的活性，可用Meier等在Experimentia6，469(1950)中敘述的棉球肉芽腫模型進行試驗。
本發(fā)明用以下實例更詳細的闡明實例制備實例1-6中化合物的通用方法。
在室溫氮氣下，將1當量氨基酸酯鹽酸鹽，2當量三乙胺和2當量N，N-二甲胺基吡啶先加到二氯甲烷中。然后在0℃-10℃慢慢滴加溶在二氯甲烷的1當量草酸酯酰氯?；旌衔镌谑覝財嚢?2小時，加入飽和碳酸氫鈉溶液后提取。分出有機層，用氯化鈉溶液洗滌，硫酸鎂干燥并蒸發(fā)。得到的粗產(chǎn)物進行層析。
實例1(N-草?；?-L-丙氨酸二甲基酯R＝R′＝CH3;R1＝H;R2＝CH3由5g，L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和3.3ml草酸甲酯酰氯得6g油狀實例1的化合物(層析EA/CH3OH5/1)實例2(N-草?；?-L-苯丙氨酸二甲酯R＝R′＝CH3;R1＝H;R2＝CH2C6H5由5gL-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽和2.2ml草酸甲酯酰氯得6.5g實例2的油狀化合物(層析EA/CH3OH5/1)實例3(N-草?；?-L-甘氨酸二甲酯R＝R′＝CH3;R1＝H;R2＝H由15g甘氨酸甲酯鹽酸鹽和11ml草酸單甲酯酰氯得到23g實例3的化合物;m.p.49℃(層析EA)
實例4(N-草?；?-L-脯氨酸二甲酯R＝R′＝CH3;R1＝CH2-CH2＝R2由2gL-脯氨酸甲酯鹽酸鹽和2.9g草酸單甲酯酰氯得1.5g油狀物(層析EA)實例5(N-草?；?-L-纈氨酸二甲酯R＝R′＝CH3;R1＝H;R2＝-OH(CH3)2由2gL-纈氨酸甲酯鹽酸鹽和2.8g草酸單甲酯酰氯得2g油狀物(層析CH/EA1/1)實例6(N-草酰基)-L-半胱氨酸二甲酯R＝R′＝CH3;R1＝H;R2＝CH2SH由2gL-半胱氨酸甲酯鹽酸鹽和3.9g草酸單甲酯酰氯得1.5g油狀物(層析CH/E1/1)實例7(N-草?；?-肌氨酸二乙酯R＝R′＝C2H5;R1＝CH3;R2＝H先將2g肌氨酸乙酯鹽酸鹽加到50ml乙醇中，室溫下滴加3.5ml(2當量)草酸二乙酯和1.8ml三乙胺在25ml乙醇中的溶液。在50℃攪拌5小時，然后回流2小時。溶液冷卻并蒸發(fā)至干。用二氯甲烷溶解剩余物，水洗一次，有機相經(jīng)硫酸鎂干燥并蒸除溶劑。粗產(chǎn)物進行層析(EA/CH1/1)產(chǎn)量0.35g制備實例8-14中的化合物的通用方法將1當量實例1-7的化合物在室溫下溶于2當量的0.1N堿金屬氫氧化物的醇溶液?；旌衔镌谑覝財嚢?2小時并蒸發(fā)干。剩余物用甲苯蒸發(fā)兩次，用戊烷洗滌數(shù)次，然后在高真空中干燥。
實例8(N-草?；?-L-丙氨酸二鉀鹽R＝R′＝K;R1＝H;R2＝CH3300mg實例1的化合物與32.5ml 0.1N氫氧化鉀乙醇溶液反應。
產(chǎn)量370mg白色結晶，m，p，＞300℃實例9(N-草?；?-L-苯丙氨酸二鈉鹽R＝R′＝Na;R1＝H;R2＝CH2C6H5420mg實例2的化合物與32.5ml 0.1N氫氧化鈉甲醇溶液反應。
產(chǎn)量440mg白色結晶，m.p＞300℃實例10(N-草?；?-L-甘氨酸二鉀鹽
R＝R2＝K;R1＝H;R2＝H5.5g實例3的化合物與314ml 0.1N氫氧化鉀甲醇溶液反應。
產(chǎn)量5.4g白色結晶，m.p＞300℃實例11(N-草?；?-L-脯氨酸二鈉鹽R＝R1＝Na;R1＝CH2CH2＝R2300mg實例4的化合物與1.5ml 0.1N的氫氧化鈉乙醇溶液反應。
產(chǎn)量290mg白色結晶，m.p＞300℃實例12(N-草?；?-L-纈氨酸二鈉鹽R＝R1＝Na;R1＝H;R2＝CH2SH300mg實例6的化合物與13.7ml 0.1N氫氧化鈉甲醇溶液反應。
產(chǎn)量300mg白色結晶，m.p＞300℃實例14(N-草酰基)-肌氨酸二鉀鹽R＝R'＝K;R1＝CH3;R2＝H120mg實例7的化合物與11.4ml 0.1N氫氧化鉀乙醇溶液反應。
產(chǎn)量130mg白色結晶，m.p＞300℃實例1-14的化合物列于下表(表1)
表1實施例 R R′ R1R2M.p./油1 CH3CH3H CH3油2 CH3CH3H CH2C6H5油3 CH3CH3H H 49℃4 CH3CH3CH2------CH2Oil5 CH3CH3H CH(CH3)2Oil6 CH3CH3H CH2SH Oil7 C2H5C2H5CH3H Oil8 K K H CH3＞300℃9 Na Na H CH2C6H5＞300℃10 K K H H ＞300℃11 Na Na CH2------CH2＞300℃12 Na Na H CH(CH3)2＞300℃13 Na Na H CH2SH ＞300℃14 K K CH3H ＞300℃本發(fā)明的化合物對酶活性的抑制測定類似于B.Peterkofsky和R.DiBlasio(Anal.Biochem.66，279-286，(1975))的方法。該試驗是在二價鐵離子，α-酮戊二酸和抗壞血酸的存在下，用酶法使脯氨酰羥化酶羥化那些羥化不全的膠原，以抑制酶活性80%(以Ki表示其值)來計算本發(fā)明化合物的抑制濃度實例8和10的化合物的結果列于表2。
表2(鹽類)化合物 Ki〔mM〕實施例8 0.04實施例10 0.01也可用細胞或組織培養(yǎng)法測定抑制活性。為此，可應用成纖維細胞或其它產(chǎn)生膠原的細胞或顱蓋，或者產(chǎn)生膠原的細官。本發(fā)明物質(zhì)對顱蓋培養(yǎng)基的抑制活性列于表3。用代謝標記14C的脯氨酸測定法使羥基脯氨酸/脯氨酸比值減少50%表示其抑制濃度(I C50)。
表3(酯類)化合物 IC50〔mM〕實施例1 0.35實施例3 0.00權利要求
1.影響膠原和類膠原物質(zhì)代謝或膠原生物合成的藥物的制備方法，其包括將Ⅰ的化合物，和它們的以D-及L-型為主的化合物和其藥用鹽加到藥品中，
式中R和R′是相同或不相同且為C1-C6的烷基或氫，R1是氫或C1-C4烷基，R2是氫或C1-C6烷基，C1-C3烷氧基，羧基，C1-C6烷氧羰基，芳基，SH，NH2或氫，這里烷基是未被取代或者被芳基，OH，SH或NH2取代，或R1和R2一起是C2-C4亞烷基鏈。
2.如權利要求1所要求的方法，其中R和R1是相同或不同的C1-C3烷基，Na或KR1是氫，甲基或乙基，R2是氫或C1-C4烷基，這里烷基是未被取代或被苯基或SH取代或R1和R2一起形成C2或C3亞烷基鏈。
3.根據(jù)權利要求1所要求的方法，其中，R和R1是相同的，為甲基，乙基，Na或K，R1是氫或甲基，R2是氫，C1-C3烷基，芐基或硫甲基，或R1和R2一起形成亞乙基鏈。
4.權利要求1-3的1項或多項所要求方法制備的藥物用于抑制脯氨酸羥化酶或賴氨酸羥化酶。
5.權利要求1-3的一項或多項所要求方法制備的藥物作為纖維抑制劑和免疫抑制劑。
6.制備含權利要求1-5中一或多項要求的或Ⅰ化合物及適應藥物載體的藥物的方法。
7.將權利要求1-3中一或多項要求的式Ⅰ化合物用于制備具有纖維抑制和/或免疫抑制活性的藥物。
8.將權利要求1-3中一或多項要求的式Ⅰ化合物用于影響膠原和類膠原物質(zhì)代謝或膠原生物合成。
9.將權利要求1-3中一或多項所要求的式Ⅰ化合物用于冶療由膠原和類膠原代謝或膠原生物合成造成的疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及式I的草酰氨基酸衍生物和它們的以D-和L-型為主的化合物及其藥用鹽，這些化合物是脯氨酰羥化酶及賴氨酸羥化酶優(yōu)良的抑制劑。
文檔編號A61K31/225GK1056683SQ9110301
公開日1991年12月4日 申請日期1991年5月11日 優(yōu)先權日1990年5月12日
發(fā)明者?？鹿隆ぐ偷? 哈拉得·布利哈德, 沃科馬·古澤勒-浦卡爾 申請人:赫徹斯特股份公司