專利名稱：一種體外抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小鵝瘟是由小鵝瘟病毒(GPV)引起的雛鵝和雛番鴨一種急性或亞急性的敗血癥，小腸發(fā)生急性卡他性或纖維素壞死性炎癥，主要侵害4-20日齡雛鵝，傳染快、發(fā)病率與死亡率都高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大損失。本病是1956年由我國方定一在揚(yáng)州發(fā)現(xiàn)，1965年來，歐洲很多國家報(bào)道有本病的存在。轉(zhuǎn)移因子(TF，Transfer Factor)又稱傳輸因子，可以作為細(xì)胞免疫促進(jìn)劑，是T淋巴細(xì)胞釋放的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸復(fù)合物，這種物質(zhì)將供體 的某種特定的細(xì)胞免疫功能特異地轉(zhuǎn)移給受體正常的淋巴細(xì)胞，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，提高受體的細(xì)胞免疫功能；同時(shí)促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分泌作用，能夠誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放干擾素和白介素，從而增強(qiáng)受體的抵抗力，這種轉(zhuǎn)移因子分子量小、無毒、活性強(qiáng)、無抗原性、不起過敏反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于治療動(dòng)物病毒性疾病、細(xì)胞免疫減弱或缺陷病以及惡性腫瘤、真菌性疾病時(shí)，可以起輔助治療作用。目前已經(jīng)有一些抗小鵝瘟的藥品和制劑，但由于現(xiàn)有的藥品制劑針對(duì)性不強(qiáng)，療效有限，而且治療性的制劑多是在發(fā)病之后才應(yīng)用的，不能起到根本的治療作用。目前已報(bào)道的轉(zhuǎn)移因子的提取方法大多關(guān)于非特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種體外抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種體外抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子的制備方法，以雞脾臟或
外周血液為基礎(chǔ)原料，制備單層淋巴細(xì)胞，經(jīng)植物血凝素(Phytohemagglutinin, PHA)和鴨肝炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞，從而促進(jìn)體外產(chǎn)生大量抗小鵝瘟病毒特異轉(zhuǎn)移因子，具體步驟如下
1)淋巴細(xì)胞的制備首先選擇健康雞，在無菌的條件下采取雞脾臟或抗凝血，制成單層淋巴細(xì)胞；
2)淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以單層形式傳代，備用；
3)病毒的接種將小鵝瘟病毒接種于12-14日齡鵝胚的絨尿腔中，37°C培養(yǎng)72-120h增殖病毒，將尿囊液收集，然后經(jīng)過超聲波破碎處理后離心，留沉淀，根據(jù)病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心，得到較為純病毒；
4)經(jīng)過植物血凝素和小鵝瘟病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞，即得抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子。步驟I)所述雞脾細(xì)胞制備過程中胰酶濃度要求O. 2-0. 25%，pH為7. 2-7. 5，用量為組織體積量的6-8倍。
步驟4)所述促進(jìn)雞脾臟細(xì)胞或血淋巴細(xì)胞分化增殖的植物凝血素使用濃度為60_180mg/L。本發(fā)明是關(guān)于小鵝瘟病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，小鵝瘟病毒不僅感染雛鵝，同樣感染雛番鴨，制備生產(chǎn)出相應(yīng)的轉(zhuǎn)移因子對(duì)于預(yù)防本疾病的發(fā)生提供保障。本發(fā)明采用的體外制備方法，這樣減少了生物個(gè)體因素的影響，這樣在臨床使用時(shí)減少了對(duì)機(jī)體不必要應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)起到應(yīng)有的效應(yīng)。本發(fā)明的制備方法簡單、易操作、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例I
一種體外抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，本實(shí)施例是以雞外周血液為基礎(chǔ)原料， 制備單層淋巴細(xì)胞，經(jīng)植物血凝素和小鵝瘟病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞，從而促進(jìn)體外產(chǎn)生大量抗小鵝瘟病毒特異轉(zhuǎn)移因子，具體步驟如下
1.抗凝血的采集選擇健康無傳染病雞，采血部位消毒，用50mL的無菌注射器，心臟采集抗凝血，加入濃度為lmg/mL的肝素鈉5mL ；
2.淋巴細(xì)胞分離抗凝血與淋巴細(xì)胞分離液(購北京普利生物試劑有限公司，按使用說明操作)按I :1的比例加入消毒后的離心管中，淋巴細(xì)胞分離液加到離心管的底部，3000r/min離心15min,收集中間的白色層，然后用pH7. O的Hanks液反復(fù)清洗淋巴細(xì)胞3次，5000r/min，離心lOmin，收集沉淀，用含30%的犢牛血清DMEM (購買InvitrogenCorporation,按使用說明操作)80mL充分混勻,然后分裝于IOOmL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5% C02，37°C恒溫箱中培養(yǎng)，經(jīng)3天的培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞貼壁生長形成單層；
3.淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，首先將長成單層淋巴細(xì)胞層用O.2%的胰酶37°C短時(shí)間消化，吹打分散，加入Hanks液終止，再洗2遍，取1/3加入到干凈培養(yǎng)瓶，5% C02，37°C恒溫培養(yǎng)，每天觀察一次，長成單層為止；
4.病毒的接種將小鵝瘟病毒接種于12日齡鵝胚的絨尿腔中，37°C培養(yǎng)72h增殖病毒，將尿囊液收集，然后經(jīng)過超聲波破碎處理后離心，留沉淀，根據(jù)病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心，得到較為純病毒；
5.誘導(dǎo)培養(yǎng)當(dāng)單層淋巴細(xì)胞長成后，更換成維持液(含5%犢牛血清DMEM)，同時(shí)加入濃度為60mg/L的植物血凝素，小鵝瘟病毒(濃度為640血凝單位/mL)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)過2天的誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后將細(xì)胞瓶經(jīng)過微振蕩，將培養(yǎng)液移置于離心管中離心，收集上清液；
6.轉(zhuǎn)移因子的制備上清液利用超聲波細(xì)胞破碎儀(工作狀態(tài)破碎3s停3s，300W，10min)破碎后，離心取上清，經(jīng)O. 22um濾膜過濾，濾液經(jīng)過截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾，利用正向壓力超濾，收集濾液再次過濾除菌，分裝，即為抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子。實(shí)施例2
一種體外抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，本實(shí)施例是以雞外周血液為基礎(chǔ)原料，制備單層淋巴細(xì)胞，經(jīng)植物血凝素和小鵝瘟病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞，從而促進(jìn)體外產(chǎn)生大量抗小鵝瘟病毒特異轉(zhuǎn)移因子，具體步驟如下1.抗凝血的采集選擇健康無傳染病雞，采血部位消毒，用50mL的無菌注射器，心臟采集抗凝血，加入濃度為lmg/mL的肝素鈉5mL ；
2.淋巴細(xì)胞分離抗凝血與淋巴細(xì)胞分離液(購北京普利生物試劑有限公司，按使用說明操作)按I :1的比例加入消毒后的離心管中，淋巴細(xì)胞分離液加到離心管的底部，2500r/min離心20min,收集中間的白色層，然后用pH7. 2的Hanks液反復(fù)清洗淋巴細(xì)胞4次，4000r/min，離心lOmin，收集沉淀，用含30%的犢牛血清DMEM (購買InvitrogenCorporation,按使用說明操作)80mL充分混勻，然后分裝于IOOmL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5% C02，37°C轉(zhuǎn)瓶機(jī)中培養(yǎng)，經(jīng)4天的培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞貼壁生長形成單層；
3.淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，首先將長成單層淋巴細(xì)胞層用O.2%的胰酶37°C短時(shí)間消化2 min,吹打分散，加入Hanks液終止，再洗3遍，取1/3加入到干凈培養(yǎng)瓶，5% C02，37°C恒溫培養(yǎng)，每天觀察一次，長成單層為止；
4.病毒的接種將小鵝瘟病毒接種于13日齡鵝胚的絨尿腔中，37°C培養(yǎng)96h增殖病 毒，將尿囊液收集，然后經(jīng)過超聲波破碎處理后離心，留沉淀，根據(jù)病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心，得到較為純病毒；
5.誘導(dǎo)培養(yǎng)當(dāng)單層淋巴細(xì)胞長成后，更換成維持液(含5%犢牛血清DMEM)，同時(shí)加入濃度為100mg/L的植物血凝素，小鵝瘟病毒(濃度為1280血凝單位/mL)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)過4天的誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后將細(xì)胞瓶經(jīng)過微振蕩，將培養(yǎng)液移置于離心管中離心，收集上清液；
6.轉(zhuǎn)移因子的制備上清液利用超聲波細(xì)胞破碎儀(工作狀態(tài)破碎3s停3s，300W，10min)破碎后，離心取上清，經(jīng)0. 22um濾膜過濾，濾液經(jīng)過截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾，利用正向壓力超濾，收集濾液再次過濾除菌，分裝，即為抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子。實(shí)施例3
一種體外制備抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子的方法，主要包括雞脾臟制備單層淋巴細(xì)胞、添加植物血凝素和病毒誘導(dǎo)等步驟，具體操作如下
1.脾臟的采集選取健康無傳染病的雞，在無菌條件下摘取脾臟，然后用滅菌生理鹽水沖洗表面的血液及內(nèi)臟表面液體，用精酒消毒表面，剔除臟器表面脂肪組織和筋膜，用無菌眼科剪和眼科鑷從脾臟內(nèi)部取部分組織，置于30mL的燒杯中，然后將其剪碎成直徑小于
0.Icm的塊，再用pH 7. 2的Hanks液清洗3次碎組織中的血液及雜質(zhì)，盡可能保證組織干凈;
2.脾細(xì)胞制備上述碎組織中加入6倍量的pH為7.2、濃度0. 2%的胰酶液，放入37°C的水浴鍋中消化20min ，每5min搖動(dòng)一次，以便組織充分消化，直到組織變成透明，周邊發(fā)毛為止，說明消化完全，可以取出燒杯，吸取胰液，加入預(yù)熱維持液PH 7. 2的Hanks液，用吸管吹打100次充分使組織分散，然后經(jīng)過濾留取濾液；
3.淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，取濾液10uL，稀釋100倍，然后顯微鏡下觀察，與血細(xì)胞計(jì)數(shù)規(guī)則一樣，確定稀釋倍數(shù)；將用DMEM(購買Invitrogen Corporation,按使用說明操作)液稀釋后的濾液分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件5% C02、37°C恒溫箱上培養(yǎng)，每天觀察兩次，在顯微鏡下觀察是否形成單層細(xì)胞，確定傳代培養(yǎng)；
4.病毒的接種將小鵝瘟病毒接種于14日齡鵝胚的絨尿腔中，37°C培養(yǎng)120h增殖病毒，將尿囊液收集，然后經(jīng)過超聲波破碎處理后離心，留沉淀，根據(jù)病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心，得到較為純病毒；
5.誘導(dǎo)培養(yǎng)傳代培養(yǎng)成單層淋巴細(xì)胞后，更換營養(yǎng)液為維持液，同時(shí)加入濃度為140mg/L植物血凝素和小鵝瘟病毒(濃度為1280血凝單位/mL)，進(jìn)行2天的誘導(dǎo)培養(yǎng)；
6.轉(zhuǎn)移因子的制備利用超聲波細(xì)胞破碎儀(工作狀態(tài)破碎3s停3s，300W，10min)破碎后，離心取上清，過濾，再經(jīng)過截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾，利用正向壓力超濾，收集濾液再次過濾除菌，分裝，即為抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子。實(shí)施例4
一種體外制備抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子的方法，主要包括雞脾臟制備單層淋巴細(xì)胞、添加植物血凝素和病毒誘導(dǎo)等步驟，具體操作如下
1.脾臟的采集選取健康無傳染病的雞，在無菌條件下摘取脾臟，然后用滅菌生理鹽水沖洗表面的血液及內(nèi)臟表面液體，用精酒消毒表面，剔除臟器表面脂肪組織和筋膜，用無菌眼科剪和眼科鑷從脾臟內(nèi)部取部分組織，置于30mL的燒杯中，然后將其剪碎成直徑小于
O.Icm的塊，再用pH為7. O的Hanks液清洗3次碎組織中的血液及雜質(zhì)，盡可能保證組織干凈;
2.脾細(xì)胞制備上述碎組織中加入8倍量的pH為7.6、濃度O. 25%的胰酶液，放入37°C的水浴鍋中消化30min ，每5 min搖動(dòng)一次，以便組織充分消化，直到組織變成透明，周邊發(fā)毛為止，說明消化完全，可以取出燒杯，吸取胰液，加入預(yù)熱的維持液PH為7. O的Hanks液，用吸管吹打60次充分使組織分散，然后經(jīng)過濾留取濾液；
3.淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，取濾液10uL，稀釋100倍，然后顯微鏡下觀察，與血細(xì)胞計(jì)數(shù)規(guī)則一樣，確定稀釋倍數(shù)；將用DMEM(購買Invitrogen Corporation,按使用說明操作)液稀釋后的濾液分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶或轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)條件5% C02、37°C恒溫箱上培養(yǎng)，每天觀察兩次，在顯微鏡下觀察是否形成單層細(xì)胞，確定傳代培養(yǎng)；
4.病毒的接種將小鵝瘟病毒接種于13日齡鵝胚的絨尿腔中，37°C培養(yǎng)IOOh增殖病毒，將尿囊液收集，然后經(jīng)過超聲波破碎處理后離心，留沉淀，根據(jù)病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心，得到較為純病毒；
5.誘導(dǎo)培養(yǎng)傳代培養(yǎng)成單層淋巴細(xì)胞后，更換營養(yǎng)液為維持液，同時(shí)加入濃度為180mg/L植物血凝素和小鵝瘟病毒(濃度為1280血凝單位/mL)，進(jìn)行I天的誘導(dǎo)培養(yǎng)；
6.轉(zhuǎn)移因子的制備利用超聲波細(xì)胞破碎儀(工作狀態(tài)破碎3s停3s，400W，10min)破碎后，離心取上清，過濾，再經(jīng)過截留分子量為6000道爾頓的中空纖維膜超濾，利用正向壓力超濾，收集濾液再次過濾除菌，分裝，即為抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子。實(shí)驗(yàn)例I :動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)
取300只12日齡健康雛鵝，隨機(jī)分成對(duì)照、試驗(yàn)、空白三組，每組100只，在新環(huán)境中適應(yīng)三天，自由采食，攻毒劑量為I. 0 108CFU/只，攻毒后第三天試驗(yàn)組開始接種抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子，每只肌注O. 2ml/只，每天一次，對(duì)照組注射生理鹽，空白全程生理鹽水，觀察臨床癥狀和死亡率作為指標(biāo)反應(yīng)本品的臨床應(yīng)用效果。結(jié)果顯示對(duì)照組發(fā)病率100%和死亡率100%，空白組沒有變化，試驗(yàn)組發(fā)病率30%，而死亡率2%。實(shí)驗(yàn)例2 :動(dòng)物安全試驗(yàn)
取健康小白鼠150只，隨機(jī)分成空白、注射組、口服三組，每組50只，空白口服和注射蒸餾水2 ml/只，注射組注射本品5 ml/只，口服組灌服本品5 ml/只，觀察小白鼠的變化。結(jié)果顯示三組都無異常變化。說明本品安全，無不良反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)例3 皮膚刺激性試驗(yàn)
取30只小白兔，分成對(duì)照、皮下注射、皮內(nèi)注射2組，采用脫毛劑對(duì)家兔脊柱兩側(cè)被毛脫去，保證皮膚的完整性，然后注射本品I ml/只，對(duì)照組注射生理鹽水，分成單次給藥、多次給藥觀察皮膚的變化。結(jié)果顯示，注射生理鹽水的10只中，有6只發(fā)生紅腫，一天消腫，試驗(yàn)組中各有4只發(fā)生，12小時(shí)內(nèi)全部消腫。實(shí)驗(yàn)例4 :本實(shí)驗(yàn)例采用各種常規(guī)方法對(duì)發(fā)明的抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子的檢測(cè)
I、多肽含量的測(cè)定用Folin-酚法或分光光度法測(cè)定多肽，以鵝外周血液為基礎(chǔ)原料多肽含量O. 51g/L，以鴨脾臟為原料制備的轉(zhuǎn)移因子多肽含量O. 40g/L。2、蛋白質(zhì)的測(cè)定采用20%磺基水楊酸方法，提取液沒有發(fā)生渾濁和沉淀現(xiàn)象，呈 陰性，不含蛋白質(zhì)。 3、無菌檢測(cè)根據(jù)《中華人民共和國獸藥典2011版》進(jìn)行檢測(cè)，沒有細(xì)菌生長。4、核糖含量測(cè)定利用分光光度法測(cè)定，以鴨外周血液為基礎(chǔ)原料核糖含量
O.39g/L，以鴨脾臟為原料制備的轉(zhuǎn)移因子核糖含量O. 47g/L。5、外觀及pH值測(cè)定黃色澄明液體，酸度值為7. 0-7. 3之值。通過以上實(shí)驗(yàn)例，我們可以得到本發(fā)明所提取的抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子是安全高效的抑制小鵝瘟病毒，提取得到的天然純生物活性物質(zhì)對(duì)禽類有預(yù)防疾病發(fā)生的作用，提高機(jī)體的免疫力。本品的體外制備方法是可行的，這種發(fā)明方法不僅操作簡便，減小工作強(qiáng)度，應(yīng)在臨床上廣泛推廣。
權(quán)利要求
1.一種體外抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于以雞脾臟或外周血液為基 礎(chǔ)原料，制備單層淋巴細(xì)胞，經(jīng)植物血凝素和抗小鵝瘟病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞，從而促進(jìn)體外產(chǎn)生大量抗小鵝瘟病毒特異轉(zhuǎn)移因子，具體步驟如下 1)淋巴細(xì)胞的制備首先選擇健康雞，在無菌的條件下采取雞脾臟或抗凝血，制成單層淋巴細(xì)胞； 2)淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以單層形式傳代，備用； 3)病毒的接種將小鵝瘟病毒接種于12-14日齡鵝胚的絨尿腔中，37°C培養(yǎng)72-120h增殖病毒，將尿囊液收集，然后經(jīng)過超聲波破碎處理后離心，留沉淀，根據(jù)病毒的粒子大小利用密度梯度高速離心，得到較為純病毒； 4)經(jīng)過植物血凝素和小鵝瘟病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞，即得抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的一種體外抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征是步驟I)所述雞脾細(xì)胞制備過程中胰酶濃度要求0. 2-0. 25%，pH為7. 2-7. 5，用量為組織體積量的6-8倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的一種體外抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征是步驟4)所述促進(jìn)雞脾臟細(xì)胞或血淋巴細(xì)胞分化增殖的植物凝血素使用濃度為60-180mg/L0
全文摘要
本發(fā)明公開一種體外抗小鵝瘟病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，利用體外淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方式，經(jīng)過小鵝瘟病毒的誘導(dǎo)制備抗小鵝瘟轉(zhuǎn)移因子。本發(fā)明是以鵝脾臟或外周血液為基礎(chǔ)原料，制備單層淋巴細(xì)胞，經(jīng)植物血凝素和小鵝瘟病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)單層淋巴細(xì)胞，從而促進(jìn)體外產(chǎn)生大量抗小鵝瘟病毒特異轉(zhuǎn)移因子。該轉(zhuǎn)移因子能夠有效的抑制抗小鵝瘟病毒,使正常的機(jī)體免受抗小鵝瘟疾病的感染，起到根本的預(yù)防作用,提高機(jī)體的免疫力。本發(fā)明方法具有簡單、易操作等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K35/28GK102697809SQ20121013630
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者萬升, 吳紅云, 郭俊清 申請(qǐng)人:鄭州后羿制藥有限公司