專利名稱：兩種含不同CpG序列PCV2-ORF2基因疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因疫苗使用的佐劑和其制備方法，具體是兩種含有14個CpG-ODN重復(fù)基序及18個CpG-ODN重復(fù)基序的PCV20RF2基因核酸疫苗。
背景技術(shù)：
基因疫苗(gene vaccine)是近年來隨著基因治療而發(fā)展起來的第三代疫苗。它是將編碼某一特定保護性抗原蛋白的外源基因與真核表達載體進行重組后，直接導(dǎo)入動物體內(nèi)，利用免疫原基因在宿主體內(nèi)表達出抗原蛋白質(zhì)引起機體的免疫應(yīng)答，以達到預(yù)防和治療疾病的目的。與常規(guī)疫苗相比，基因疫苗具有如下優(yōu)點免疫效果好；不散毒，無污染； 保護性免疫持續(xù)時間長；方法簡便、價格低廉；核酸疫苗具有相同的理化性質(zhì)，為聯(lián)合免疫提供了可能；便于貯藏和運輸；不受個體已有的免疫反應(yīng)(如母源抗體)的影響。豬圓環(huán)病毒是一種小的、二十面體對稱、無囊膜、共價閉合、單股環(huán)狀DNA病毒，是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原。根據(jù)PCV的致病性及全基因組序列，可分為兩個血清型PCV-1與PCV-2。PCV-2含有兩個主要閱讀框ORFl和0FR2。其中0RF2為702bp， 編碼233個氨基酸，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的免疫原性，是構(gòu)建重組疫苗的首選基因。在核酸疫苗的免疫應(yīng)答過程中，高效免疫增強劑的應(yīng)用，能全面提高機體的整體免疫水平，增強抗病防御和免疫應(yīng)答能力，提高疫苗保護率。其中，CpG-ODN (CpG寡聚脫氧核苷酸)的研究是其中的焦點。CpG序列已被證實能作為疫苗的高效免疫增強劑，使用得當能夠大幅度提高疫苗的免疫保護率和機體的免疫水平。近來大量免疫學(xué)研究證實含CpG序列的DNA分子具有以下免疫效果(1)誘導(dǎo)B細胞增殖、分化、成熟和分泌免疫球蛋白；(2) 抗誘生的細胞凋亡；(3)誘導(dǎo)單核細胞分泌IL-12及其他細胞因子；(4)活化自然殺傷(NK) 細胞的裂解活性和干擾素(IFN-Y)分泌。但CpG-ODN具有種屬特異性，本發(fā)明中的CpG-ODN 都是經(jīng)過實驗證實對豬具有免疫增強作用的序列。


圖1 :PCV2的0RF2基因的PCR擴增產(chǎn)物，其中條帶1為DNA標準DL 2000,條帶2、 3、4、7、9為陽性PCR產(chǎn)物(0RF2)，條帶5、6、8為陰性PCR產(chǎn)物。圖2 重組質(zhì)粒pVAXl-0RF2的PCR鑒定，其中條帶1為DNA標準DL 2000，條帶2_5 為從pVAXl-0RF2上PCR擴增出的0RF2片段，條帶6為陽性對照(從PCV2病毒DNA上擴增出的0RF2片段)。圖3 免疫熒光檢測結(jié)果，其中圖A為pVAXl-0RF2-CpG(14CpG)轉(zhuǎn)染組間接免疫熒光檢測結(jié)果(IOOx放大)，圖B為pVAXl-0RF2轉(zhuǎn)染組間接免疫熒光檢測結(jié)果(IOOx放大)， 圖C為pVAXl空載體轉(zhuǎn)染組間接免疫熒光檢測結(jié)果(100倍放大)。圖4 仔豬平均日增重記錄結(jié)果圖5 豬體溫檢測結(jié)果圖
圖6 豬外周血抗體水平檢測結(jié)果圖7 病理組織切片圖，其中，左側(cè)一列(A組)為PBS組，中間一列(B組)為空載體組，右側(cè)一列(C組)為疫苗(14CpG)注射組。圖8 攻毒后組織病理變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的足提供兩種新的供豬免疫疫苗使用的CpG-ODN基序，可使 DNA疫苗產(chǎn)生更有效的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的第二個目的是提供本發(fā)明核酸疫苗的制備方法。本發(fā)明CpG-ODN作為免疫增強劑的優(yōu)越性制備方法簡單，易于保存和運輸；質(zhì)量易于控制，易規(guī)?；a(chǎn)，成本低廉，易于保存和運輸；安全性好。細胞因子是機體內(nèi)本身存在的免疫調(diào)節(jié)分子，對人體無毒副作用，同時也受機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的控制；易于構(gòu)建和改造，利用分子生物學(xué)技術(shù)在基因水平可實現(xiàn)人們所期望的免疫應(yīng)答強度和類型。
具體實施例方式本發(fā)明的佐劑的制備方法詳述如下(1)人工合成不同的CpG-ODN基序14 個 CpG-ODN 重復(fù)基序
GTCGTTTAACGTTTGACGTTTCGTCGTTTTAACGTTTTGACGTTTCAACGTTTGACGTTTCAACGTTTTGAC GTTTCAACGTTTGACGTTTCAACGTTTTGACGTT (SEQ ID NO :1)18 個 CpG-ODN 重復(fù)基序
AACGTCAAACGTTAAAACGACGAAACGTCAAACGTAAAGACGAAAACGTCAAAACGTTAAAACGACGAAAC GTCAAACGTAAAGACGAAAACGTCAAAACGTTAAAACGACGAAACGTCAAACGTTAAACGACGA (SEQ IDNO 2)利用引物ORFk、0RF2r擴增出PCV2SD1株的完整0RF2基因，序列如下ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTC CGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCT CTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAAGCGAACCACAGTCAGAACGCCCTTCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCA ATATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAG GTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAGA TGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTCACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCTGCCATACCATAACCC AGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAAC AACAAAAGAAATCAGCTGTGGCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGA AAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACC CCCCACTTAACCCTAAGTGA(SEQ ID NO 3)(2)采用基因工程重組技術(shù)，選擇合適的含酶切位點，將目的基因和CpG-ODN序列克隆入真核細胞表達載體PVAXl ；
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(3)用步驟( 所得的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化原核宿主菌，挑選陽性克隆，測序鑒定后，再進行擴增培養(yǎng)；(4)大量提取和純化目的基因的重組質(zhì)粒DNA。(5)免疫原性的檢測實施例1. PCR擴增0RF2基因根據(jù)PCV2SD1 株(Gene bank accession number :DQ346683)全序列設(shè)計如下 PCR 引物。引物序列為 0RF2s :5，-ATCgCTAgCgCCgCCACCATgACgTATCCAA-3‘ ；0RF2r :5，-gCCgCg AAgCnTCgCTTAgggTTAAgT-3',為便于克隆，在上游引物和下游引物中分別添加了 Nhe I酶切位點和Hind III酶切位點。PCR反應(yīng)體系如下10XPCR buffer 5 μ 1 ；dNTP Mixture 4 μ 1 ；P5s 2 μ 1 ；P5r 2 μ 1 ；模板 2 μ 1 ;Ex Taq E 0. 5 μ 1 ；用 ddH20 補至 50 μ 1。PCR 擴增條件為預(yù)變性95°C 5min，變性94°C lmin，，退火55°C Imin，延伸72 °C Imin，35個循環(huán)后， 72°C 延 IOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)8 %的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示，表明擴增出了與0RF2相應(yīng)的7(^bp的特異片段，與預(yù)期結(jié)果相符。 實施例2. pVAXl-0RF2載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Hind 111/Nhe I消化PCR純化產(chǎn)物和pVAXl，分別獲得0RF2基因片段和線性載體PVAX1，將產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳，按照上海生工膠回收試劑盒說明書進行。連接、轉(zhuǎn)化、挑菌、提質(zhì)粒、用限制性內(nèi)切酶Hind III/Nhe I和測序鑒定。以待鑒定重組質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)8g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析， 結(jié)果如圖2所示，表明擴增出了與0RF2相應(yīng)的7(^bp的特異片段，與預(yù)期結(jié)果相符。將PCR陽性質(zhì)粒送上海生工生物有限公司進行測序鑒定，測序結(jié)果與0RF2序列相符。如下所示(黑體字部分為0RF2序列)
ATGGCTGCGCGCACC ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCG CAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCG CTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAAG CGAACCACAGTCAGAACGCCCTTCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTC TTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAGG TTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGTG CTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTCACCTATGACCCCTATGTAAAC TACTCCTCCTGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTACTTTACCCCCAAACC TGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTGTGGCTGAGA CTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACG ACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCC CCACTTAACCCTAAGTGAAAGCTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACT AGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGCCCGTTTAAACCCGCT GATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCCAGCCCATCTGTTTGTTTGC實施例3. CpG-ODN的設(shè)計及合成
由上海生工生物工程有限公司合成不同的CpG-ODN基序14 個 CpG-ODN 重復(fù)基序
gtcgtttaacgtttgacgtttcgtcgttttaacgttttgacgtttcaacgtttgacgtttcaacgttttgac gtttcaacgtttgacgtttcaacgttttgacgtt18 個 CpG-ODN 重復(fù)基序
aacgtcaaacgttaaaacgacgaaacgtcaaacgtaaagacgaaaacgtcaaaacgttaaaacgacgaaac gtcaaacgtaaagacgaaaacgtcaaaacgttaaaacgacgaaacgtcaaacgttaaacgacga用Mlu I分別單酶切重組質(zhì)粒PVAX1-0RF2和人工合成的CpG序列，取酶切產(chǎn)物分別在8g/L和20g/L的瓊脂糖凝膠上進電泳，用凝膠回收試劑盒回收目的片段?；厥掌瑪嘤?DNA連接試劑盒(DNA Ligation KitVer. 2. 0)進行連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞。將Mlu I酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送上海生工生物有限公司測序鑒定，測序結(jié)果與人工合成的 CpG序列相符，如下所示(黑體字部分為CpG序列)14個CpG-ODN重復(fù)基序測序結(jié)果
TGTACGGGCCAGATATACGCGTT'Gtcgtttaacgtttgacgtttcgtcgttttaacgttttgacgtttcaacg TTTGACGTTTCAACGTTTTGACGTTTCAACGTTTGACGTTTCAACGTTTTGACGTT CACGCGTTGACATTGA 18個CpG-ODN重復(fù)基序測序結(jié)果
TGTACGGGCCAGATATACGCGTaacgtcaaacgttaaaacgacgaaacgtcaaacgtaaagacgaaaacgtc
aaaacgttaaaacgacgaaacgtcaaacgtaaagacgaaaacgtcaaaacgttaaaacgacgaaacgtcaaac GTTAAACGACGA ACGCGTTGACATTGA實施例4.重組質(zhì)粒的純化和轉(zhuǎn)染細胞按常規(guī)方法提取質(zhì)粒，按!Iomega試劑盒使用說明書進行純化。使用 Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Gnvitrogen公司)轉(zhuǎn)染正常生長的H(15細胞。實施例5.目的蛋白的表達檢測將質(zhì)粒和消化的H(15細胞一起轉(zhuǎn)染，5% CO2、37°C培養(yǎng)三天后，取出玻片，用PBS 液沖洗三次，100%冷丙酮固定15 30min，再用PBS液洗滌三次；用含有5% BSA封閉2h， 沖洗三次，每次5min ；加入一抗(豬抗PCV2血清)，37°C作用池后，沖洗3次；加入二抗 (異硫氰熒光素標記的山羊抗豬IgG)，室溫避光作用lh，沖洗3次；吸干，滴加50%甘油水溶液，倒置于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖3所示，在轉(zhuǎn)染了 pVAXl-0RF2-CpG 質(zhì)粒和pVAXl-0RF2質(zhì)粒的細胞培養(yǎng)孔中都觀察到了熒光，說明有目的蛋白表達，在轉(zhuǎn)染了 PVAXl空載體質(zhì)粒的陰性對照組中未觀察到熒光。實施例6.疫苗免疫試驗及攻毒保護性試驗(1)試驗設(shè)計40頭3周齡的仔豬，隨機分成8組，每組5頭，各組飼養(yǎng)管理條件相同。用紫外分光光度計測量所提取的含有14CpG和ISCpG的質(zhì)粒濃度，調(diào)整為200μ g/ml，400y g/ml， 800 μ g/ml，耳背部肌肉注射核酸疫苗。正常對照組注射Iml PBS，空載體組注射Iml pVAXl。 于第1、14天進行疫苗免疫，于58天攻毒進行攻毒保護試驗，攻毒用的PCV2SD1株病毒液為106_2TCID5(1/ml，每頭豬頸部肌肉注射1ml，于77天時將剩余試驗豬全部剖殺。按下表對各組進行免疫注射。表1. 1免疫接種動物試驗分組情況
權(quán)利要求
1.一種含CpG重復(fù)基序的PCV20RF2基因疫苗，其特征在于由PCV2SD1株的完整0RF2 和CpG-ODN重復(fù)基序插入哺乳動物真核表達載體pVAXl獲得，其中所述的CpG-ODN重復(fù)基序為HCpG-ODN重復(fù)基序或18CpG-0DN重復(fù)基序。
2.如權(quán)利要求1所述的PCV20RF2基因疫苗，其特征在于所述的14CpG_0DN重復(fù)基序的序列如SEQ ID NO 1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的PCV20RF2基因疫苗，其特征在于所述的18CpG_0DN重復(fù)基序的序列如SEQ ID NO 2所示。
4.如權(quán)利要求1-3所述的PCV20RF2基因疫苗，其特征在于所述的PCV2SD1株的完整 0RF2的序列如SEQ ID NO 3所示。
5.如權(quán)利要求1所述的PCV20RF2基因疫苗，其特征在于所述的PCV2SD1株的完整0RF2 是使用如下引物擴增獲得0RF2s :5’ -ATCgCTAgCgCCgCCACCATgACgTATCCAA-3’0RF2r :5， -gCCgCgAAgCTTTCgCTTAgggTTAAg T-3，。
6.權(quán)利要求1-5所述基因疫苗的制備方法，其包括如下步驟(1)人工合成擴增PCV2SD1株完整0RF2的引物，在擴增0RF2的引物中引入了Hind III、Nhe I酶切位點，以PCV2SD1株的DNA為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴增0RF2全基因；(2)通過酶切，將0RF2基因插入pVAXl相應(yīng)的多克隆位點中，產(chǎn)生pVAXl_0RF2重組質(zhì)粒，并進行酶切和PCR鑒定；(3)人工合成HCpG-ODN重復(fù)基序和18CpG-0DN重復(fù)基序；(4)將HCpG-ODN重復(fù)基序或18CpG-0DN重復(fù)基序通過MluI單酶切，連接到已構(gòu)建好的真核表達載體PVAX1-0RF2的骨架結(jié)構(gòu)中，構(gòu)建CpG-pVAXl-0RF2重組質(zhì)粒。
7.—種能夠增強疫苗免疫效果的含CpG基序的寡核苷酸，其特征在于所述寡核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 2 所示。
8.權(quán)利要求7所述的含CpG基序的寡核苷酸在增強核酸疫苗免疫效果中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明為兩種含有14個CpG-ODN重復(fù)基序及18個CpG-ODN重復(fù)基序和表達豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)ORF2基因的核酸疫苗。本發(fā)明是為了提高豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)基因免疫的效果，構(gòu)建含14個及18個CpG基序和PCV2-ORF2的真核重組表達質(zhì)粒CpG-pVAX1-ORF2。經(jīng)酶切鑒定和序列測定，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細胞，經(jīng)間接免疫熒光試驗證實CpG-pVAX1-ORF2可表達PCV2Cap蛋白。該核酸疫苗中插入了具有免疫增強作用的CpG-ODN重復(fù)基序，可增強核酸疫苗的免疫效果，該核酸疫苗可在動物體內(nèi)持續(xù)不斷的產(chǎn)生Cap蛋白，使機體不斷產(chǎn)生抗體，對豬體提供持久的免疫保護力，在PCV2的防控中具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K39/39GK102335440SQ20111030121
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月9日
發(fā)明者叢曉燕, 吳家強, 徐紹建, 時建立, 李俊, 王金寶, 程凱慧 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所