硫酸軟骨素b的應(yīng)用及含有硫酸軟骨素b的疫苗劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種硫酸軟骨素B的應(yīng)用及含有硫酸軟骨素B的疫苗劑，將硫酸軟骨素B作為佐劑應(yīng)用在疫苗中，即每單份疫苗劑中含有5～105μg的硫酸軟骨素B。硫酸軟骨素B作為疫苗佐劑，毒副作用小，在免疫劑量范圍內(nèi)使用是安全可靠的，能夠有效誘導(dǎo)抗原特異性的體液免疫應(yīng)答，且所誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答效果優(yōu)于無佐劑組，硫酸軟骨素B性能穩(wěn)定，生物學(xué)效價(jià)較高、無毒害作用，可添加于多種傳統(tǒng)疫苗和基因工程疫苗中作為疫苗佐劑。
【專利說明】硫酸軟骨素 B的應(yīng)用及含有硫酸軟骨素 B的疫苗劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種硫酸軟骨素 B的應(yīng)用及含硫酸軟骨素 B的疫苗劑，屬于免疫學(xué)技 術(shù)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著疫苗研宄的不斷深入，特別是分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，研制出的新 型基因工程疫苗純度高、特異性強(qiáng)，但分子小，免疫原性相對較弱，難以產(chǎn)生有效的免疫應(yīng) 答。因此應(yīng)用佐劑來增強(qiáng)其免疫原性就顯得尤為重要。
[0003] 目前，已認(rèn)證應(yīng)用于人類的佐劑仍寥寥無幾，鋁鹽佐劑就是其中之一。鋁鹽佐劑在 提高抗體水平和安全方面已獲得長期的實(shí)踐證實(shí)，但由于其會引起過敏、誘導(dǎo)退行性神經(jīng) 病變等缺點(diǎn)，迫切需要開發(fā)新型疫苗佐劑以克服這些缺陷，更好的為人類服務(wù)。
[0004] 硫酸軟骨素 （Chondroitin Sulfate)是一種硫酸化的線性粘多糖，由葡萄糖醛酸 和N-乙酰氨基半乳糖組成的二糖單位重復(fù)而成。根據(jù)硫酸基團(tuán)的位置不同，分為硫酸軟骨 素 A，硫酸軟骨素 B和硫酸軟骨素 C。硫酸軟骨素廣泛地分布于動物組織中，主要存在于皮 膚、血管、心臟瓣膜和肌腱部分。具有多種生理和病理功能，參與細(xì)胞分裂、胚胎形成、神經(jīng) 元的可塑性和機(jī)體抵抗病毒和細(xì)菌等過程。普遍用于治療骨骼相關(guān)疾病、腦損傷復(fù)合等疾 病。硫酸軟骨素具有提高免疫作用的功能。研宄發(fā)現(xiàn)：體外培養(yǎng)條件下，硫酸軟骨素能顯著 提高B細(xì)胞的增殖，通過蛋白激酶C抑制劑GF109203X誘導(dǎo)免疫功能低下小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證 明硫酸軟骨素是通過蛋白激酶C作用于B細(xì)胞的。注射硫酸軟骨素4?5天后，脾臟內(nèi)B 細(xì)胞和CD138+細(xì)胞大量增值，CD138+細(xì)胞能迀移到骨髓作為漿細(xì)胞影響體液免疫，從而提 高體液免疫應(yīng)答。還有研宄報(bào)道硫酸軟骨素能通過激活Thl輔助淋巴細(xì)胞、誘導(dǎo)干擾素的 產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。
[0005] 硫酸軟骨素 B (Chondroitin Sulfate B)，亦稱硫酸皮膚素 （Dermatan Sulfate DS)，最初由豬皮細(xì)胞中萃取得到，故稱為硫酸皮膚素。除具有硫酸軟骨素的一般特點(diǎn)外，還 有研宄發(fā)現(xiàn)一定濃度的硫酸軟骨素 B能抑制癌細(xì)胞的生長。硫酸軟骨素 B作為硫酸軟骨素 的一種能在體內(nèi)外激活B細(xì)胞。硫酸軟骨素 B還能成為自身抗原引起固有免疫應(yīng)答。CD5+ B細(xì)胞通過表達(dá)固有免疫B細(xì)胞受體和產(chǎn)生自身抗原調(diào)節(jié)固有免疫，⑶5+ B細(xì)胞對于固有 免疫至關(guān)重要，而硫酸軟骨素 B能激活CD5+ B細(xì)胞，從而提高固有免疫應(yīng)答。
[0006] 通過以上推斷，硫酸軟骨素 B具有免疫增強(qiáng)作用，有必要研發(fā)硫酸軟骨素 B在疫苗 中的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決現(xiàn)有疫苗佐劑存在種類少、毒副作用大等問題，本發(fā)明提供一種安全、有 效、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的硫酸軟骨素 B佐劑以及含有硫酸軟骨素 B佐劑的疫苗劑。
[0008] 本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：硫酸軟骨素 B作為佐劑在疫苗中的應(yīng)用。
[0009] 所述硫酸軟骨素 B為市購產(chǎn)品，分子式為（C14H21NO14S)n，分子量約為41KDa。結(jié)構(gòu) 式如圖1所示。
[0010] 本發(fā)明提供一種含有硫酸軟骨素 B的疫苗劑，其特征在于：每單份疫苗劑中含有 5?105 μ g的硫酸軟骨素 B。
[0011] 所述每單份疫苗劑為臨床使用的常規(guī)單次注射參考量。
[0012] 所述硫酸軟骨素 B的含量優(yōu)選65 μ g。
[0013] 本發(fā)明的還提供一種含有硫酸軟骨素 B疫苗劑的制備方法，其特征在于經(jīng)過下列 步驟：按每單份疫苗劑加入5?105 μ g硫酸軟骨素 B的量，在抗原劑中加入硫酸軟骨素 B， 再加生理鹽水至注射所需量，按常規(guī)混合均勻，即得含有硫酸軟骨素 B的疫苗劑。
[0014] 所述抗原劑為常規(guī)甲肝抗原、乙肝抗原或狂犬病毒抗原中的一種。
[0015] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果：（1)硫酸軟骨素 B佐劑是人體組織 中的成分，是普遍使用的藥物，毒副作用小，在免疫劑量范圍內(nèi)使用是安全可靠的；（2)硫 酸軟骨素 B佐劑能夠有效的誘導(dǎo)抗原特異性的體液免疫應(yīng)答，且其所誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答 效果優(yōu)于無佐劑組；（3)硫酸軟骨素 B佐劑能夠有效的誘導(dǎo)抗原特異性的體液免疫應(yīng)答，且 一定劑量時(shí)其所誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答效果優(yōu)于鋁佐劑組；（4)硫酸軟骨素 B佐劑原料易得， 為市售產(chǎn)品，制備工藝簡單，成本低，性能穩(wěn)定，生物學(xué)效價(jià)較高、無毒害作用，可添加于多 種傳統(tǒng)疫苗和基因工程疫苗中作為疫苗佐劑；（5)硫酸軟骨素 B佐劑與疫苗聯(lián)合應(yīng)用能有 效增強(qiáng)疫苗體液免疫應(yīng)答，免疫效果優(yōu)于無佐劑的疫苗。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為硫酸軟骨素 B的分子結(jié)構(gòu)式。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限 制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件或按照制造廠 商所建議的條件。文中所述的較佳條件實(shí)施方法僅作示范之用。
[0018] 實(shí)施例1 本實(shí)施例提供的硫酸軟骨素 B佐劑用量為5 μ g。
[0019] 本例提供的含有硫酸軟骨素 B佐劑的甲肝疫苗是：按每單份疫苗劑加入5 μ g硫酸 軟骨素 B的量，在甲肝（HAV)抗原中加入硫酸軟骨素 B，再加生理鹽水至200 μ L，按常規(guī)混 合均勻，即得含有硫酸軟骨素 B的甲肝疫苗劑。
[0020] 其中，硫酸軟骨素 B為市購產(chǎn)品，分子式為（C14H21NO14S)η，分子量約為41KDa，購自 購自美國SiGM公司；HAV抗原為市購的滴度為256EU/ml的18EU HAV抗原液，購自中國醫(yī) 學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研宄所。
[0021] 本實(shí)施例1所得含有硫酸軟骨素 B佐劑的甲肝疫苗的免疫試驗(yàn)和效果如下： A、免疫 將6?8周齡、18?22g的清潔級ICR小鼠隨機(jī)分為硫酸軟骨素 B佐劑組、氫氧化鋁佐 劑組、無佐劑組和空白組，共四組，每組8只；所用氫氧化鋁為常用的氫氧化鋁膠體佐劑，其 制法參照《中國藥典(三部)》，（國家藥典委員會.北京：人民衛(wèi)生出版社.2005:118-119)， 在人體中的劑量為1. 8?2. 7mg。
[0022] 硫酸軟骨素 B佐劑組：注射實(shí)施例1的含有硫酸軟骨素 B佐劑的甲肝疫苗至小鼠 體內(nèi)，注射劑量為每只小鼠200 μ L，其中200 μ L疫苗中含有硫酸軟骨素 B 5 yg，甲肝抗原 18EU。
[0023] 氫氧化鋁佐劑組：將氫氧化鋁0.5mg與甲肝抗原18EU混合后加生理鹽水至 200 μ L，經(jīng)腹腔皮下多點(diǎn)注射到小鼠體內(nèi)，注射劑量為每只小鼠200 μ L。
[0024] 無佐劑組：將甲肝抗原18EU與生理鹽水混合至200uL，再經(jīng)腹腔皮下多點(diǎn)注射到 小鼠體內(nèi)，注射劑量為每只小鼠200 μ L。
[0025] 空白組：僅注射生理鹽水，注射劑量為每只小鼠 200uL。
[0026] 免疫方案：在第0周經(jīng)腹腔皮下多點(diǎn)注射到小鼠體內(nèi)，免疫次數(shù)為一次。
[0027] B、ELISA檢測血清抗一 HAV IgG水平 在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾靜脈血，分離血清，ELISA檢測血清抗一 HAV IgG水平，按KPL公司生產(chǎn)的小鼠 IgG ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測操作。
[0028] C、數(shù)據(jù)分析 對所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P < 0.05為差異 的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0029] 表1為使用實(shí)施例1提供的佐劑后，16周內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清抗-HAV IgG水平 (抗體效價(jià)值)。
[0030] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 硫酸軟骨素 B作為佐劑在疫苗中的應(yīng)用。
2. -種含有硫酸軟骨素 B的疫苗劑，其特征在于：每單份疫苗劑中含有5?105 y g的 硫酸軟骨素 B。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗劑，其特征在于：所述硫酸軟骨素 B為市購產(chǎn)品，分子式 為（C14H21N014S)n，分子量約為 41KDa。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗劑，其特征在于：所述每單份疫苗劑為臨床使用的常規(guī) 單次注射參考量。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗劑，其特征在于：所述硫酸軟骨素 B的含量為65 y g。
6. -種含有硫酸軟骨素 B疫苗劑的制備方法，其特征在于經(jīng)過下列步驟：按每單份疫 苗劑加入5?105 y g硫酸軟骨素 B的量，在抗原劑中加入硫酸軟骨素 B，再加生理鹽水至注 射所需量，按常規(guī)混合均勻，即得含有硫酸軟骨素 B的疫苗劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：所述抗原劑為常規(guī)甲肝抗原、乙肝抗 原或狂犬病毒抗原中的一種。
【文檔編號】A61K39/29GK104491859SQ201510008740
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月8日
【發(fā)明者】王陳蕓, 王海漩, 孫靜, 李彥涵, 烏美妮, 李建芳, 胡凝珠, 胡云章, 施建東 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所