專利名稱：一種富集自體干細(xì)胞的脂肪組織隆胸材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種富集自體干細(xì)胞的脂肪組織隆胸材料的制備方法。背景技術(shù)：
隆乳術(shù)或豐乳術(shù)(mammary augumentation)是整形外科最常見的一項美容手術(shù)，于20 世紀(jì)初誕生以來，填充材料就成為了焦點問題，先后嘗試過許多隆乳材料，例如石臘、硅凝膠、鹽水、自體真皮脂肪瓣等等，然而，長期的醫(yī)療實踐證明，所有類型的組織替代品多多少少有一些不適感及并發(fā)癥(包括攣縮，變形、變硬、滲漏)，這給求醫(yī)者和醫(yī)生們帶來很大的困惑。所以，在70年代末有人開始嘗試在真皮脂肪瓣移植隆胸的基礎(chǔ)上利用自體脂肪組織隆胸，自體脂肪隆胸是將身體腰、腹、臀、腿等脂肪較豐厚的部位的脂肪顆粒移植到胸部的一種隆胸術(shù)。手術(shù)將隆胸者本身的多余脂肪用細(xì)針吸出，活化處理成純凈脂肪顆粒，通過微型管針分條理均勻注入隆乳區(qū)使之成活；不開刀、不出血，豐胸成效真實自然，同時又達(dá)到了減肥塑身，具有減肥豐胸的效果。尤其是近幾年，隨著脂肪抽吸術(shù)的日益成熟，利用自體脂肪顆粒注射隆胸迅速發(fā)展起來，成為目前最熱門的豐胸方法之一。但是目前脂肪填充后液化吸收率太高，可以達(dá)70%以上，成活率較低(低于40%)，要想達(dá)到持久豐滿的效果必須選用“少量多次”的辦法，給求醫(yī)者和醫(yī)生們帶來了極大地麻煩。脂肪組織的主要組成部分有脂肪細(xì)胞，脂肪基質(zhì)細(xì)胞(ASC)，血管內(nèi)皮細(xì)胞，外膜細(xì)胞。脂肪基質(zhì)細(xì)胞(ASC)被看作是脂肪組織專屬祖細(xì)胞，即生脂祖細(xì)胞和血管源祖細(xì)胞， 有些脂肪基質(zhì)細(xì)胞能夠分化成多種細(xì)胞，而被稱為脂肪源干細(xì)胞。脂肪基質(zhì)細(xì)胞對于脂肪組織運(yùn)轉(zhuǎn)發(fā)揮重要作用，(脂肪組織大約每2-10年循環(huán)一次)，并為下一代提供細(xì)胞。但是抽脂得到的主要是脂肪組織的零散成分，研究表明，抽脂術(shù)獲得脂肪組織含有的脂肪基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量僅是完整脂肪組織含量的一半，比起完整脂肪組織，吸脂所得脂肪組織是一種干細(xì)胞源性差的脂肪組織，而脂肪移植后，從微觀環(huán)境看，在組織修復(fù)的急性期，損傷有關(guān)的增長因素和炎癥有關(guān)細(xì)胞活素和化學(xué)增活素會影響脂肪基質(zhì)細(xì)胞(ASC)的表現(xiàn)。脂肪移植將經(jīng)歷脂肪細(xì)胞和毛細(xì)血管重組。脂肪基質(zhì)細(xì)胞(ASC)是修復(fù)脂肪組織中的主要作用力量。如果吸入脂肪組織中脂肪基質(zhì)細(xì)胞(ASC)相對不足，會影響替換過程，導(dǎo)致術(shù)后植入脂肪萎縮。這也是目前單純脂肪顆粒移植隆胸效果不能持久的原因所在，因此要想獲得持久的隆胸效果，必須向祖細(xì)胞不足的吸入脂肪組織增補(bǔ)脂肪基質(zhì)細(xì)胞(ASC)或脂肪干細(xì)胞的數(shù)量，以提高移植脂肪的存活率。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種持久性強(qiáng)、隆胸效果好的富集自體干細(xì)胞的脂肪組織隆胸材料的制備方法。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種富集自體干細(xì)胞的脂肪組織隆胸材料的制備方法，主要包括如下步驟 (1)從病患身上微創(chuàng)抽取脂肪組織，GMP實驗室內(nèi)經(jīng)過分離提取、純化、檢測、擴(kuò)增等步驟，獲得高數(shù)量的干細(xì)胞；(2)全麻，用插管和負(fù)壓抽脂機(jī)抽取脂肪組織；
(3)取一半脂肪組織離心，分離脂肪吸入物，得到移植脂肪組織，并置于無菌容器內(nèi)冰浴保存；
(4)取另一半脂肪組織離心分離脂肪部分和液體部分，然后分別用酶消化法和梯度離心法分離其中的SVF，并計數(shù)測活度；
(5)將擴(kuò)增好的脂肪干細(xì)胞添加到新制備好的SVF中，按107100ml脂肪的比例添加， 最后將SVF和移植脂肪組織混勻。所述病患為體重指數(shù)大于15的十幾歲到七十多歲的健康人群，其中，身上少脂肪的運(yùn)動員除外。本發(fā)明的填充材料主要由自體脂肪組織和脂肪來源的基質(zhì)血管成分SVF (stroma vascular fraction)組成，該技術(shù)簡稱細(xì)胞輔助式脂肪移植CELL-ASSISTED LIP0TRANSFER (CAL)。SVF是一個細(xì)胞混合體，也包括了基質(zhì)細(xì)胞，高濃度的脂肪干細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞、 白細(xì)胞和紅細(xì)胞等血細(xì)胞。該技術(shù)的關(guān)鍵在于加入了含有高濃度的脂肪干細(xì)胞的SVF成分 。隆胸時抽的脂肪分兩部分，一部分經(jīng)過無菌處理后低溫保存用于移植，另一部分在GMP實驗室通過特異的SVF分離技術(shù)制備SVF細(xì)胞群并與制備好的脂肪混勻用于移植。SVF能保持脂肪組織細(xì)胞的豐富，其中的各種細(xì)胞能夠促進(jìn)周圍環(huán)境的的生長因子如PDGF，EGF, FGF, VEGF, IGF等分泌，從而進(jìn)一步促進(jìn)血管新生作用，在短時間內(nèi)為移植的脂肪提供血液和養(yǎng)分，提高了祖細(xì)胞和脂肪組織的存活率；另一方面，SVF具有免疫調(diào)節(jié)的作用，能夠降低炎癥反應(yīng)，為移植的脂肪存活提供了一個適宜的環(huán)境。為了提高脂肪干細(xì)胞的濃度，我們首先從病號僅抽取5ml組織，經(jīng)過分離、純化、 及體外培養(yǎng)擴(kuò)增得到高數(shù)量的脂肪干細(xì)胞，最后添加到新制備的SVF成分中，與脂肪組織混勻用于隆胸移植。本發(fā)明的更優(yōu)方案為
步驟(1)中，微創(chuàng)抽取脂肪組織的量為5ml。步驟(3)中，脂肪組織以500G的速度離心5min。步驟(4)中，脂肪組織以300G的速度離心5min。本發(fā)明通過預(yù)先抽取微量的脂肪組織并獲得大量的脂肪干細(xì)胞，這樣就可以減少脂肪移植時用于制備SVF脂肪組織的用量，以彌補(bǔ)大量女性因體重指數(shù)偏低(目前小于17 的無法自體脂肪隆胸)而無法獲得大量的脂肪組織來制備SVF而不能進(jìn)行自體脂肪隆胸的弊端。
具體實施方式
實施例
1.病號的選擇體重指數(shù)大于15的從十幾歲到七十多歲的健康人群(身上少脂肪的運(yùn)動員除外)，抽脂前一個月內(nèi)必須做全面體檢，包括心、肺、肝及腎功能，血常規(guī)，凝血四項等。同時，那些想一次大量增大(達(dá)到200至400毫升)的人不宜入選，因為一次療程的注射限定在100至200毫升。2.脂肪干細(xì)胞的體外擴(kuò)增
(1)微創(chuàng)抽脂，注射利多卡因小面積的局部麻醉，利用微型吸引針無菌抽取患者5ml脂肪組織；
(2)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的提取采用磷酸鹽緩沖液浸泡，1500r/min離心洗滌脂肪至， 用0. 1% I型膠原酶37°C水浴消化約30min，加磷酸緩沖液稀釋膠原酶并離心，懸浮下層沉淀，100目濾網(wǎng)過濾，1500r/m離心lOmin，以去除懸浮的脂肪細(xì)胞及脂滴，棄上清液，隨后進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)體系為STEMPRO MSC SFM無血清培養(yǎng)基，含有2mM/ml的谷氨酰胺和 100U/ml的青-鏈霉素。2周可獲得IO8 — IO9細(xì)胞。3.抽脂
用配有0. 001%腎上腺素的鹽水溶液進(jìn)行全身麻醉，等藥滲透到取脂部位，用內(nèi)徑為 2. 5毫米的插管和負(fù)壓吸脂機(jī)吸取脂肪組織。共抽取800到1000毫升脂肪組織。4.移植材料的制備
(1)移植脂肪組織的制備取一半抽取物以300G的速度離心5min分離抽脂組織，分別獲得上層分離脂肪部分(PLA)和液體部分(LAF)，分離后的脂肪組織(PLA)放到無菌容器內(nèi)冰浴保存；液體部分(LAF)分離其中SVF.
(2)SVF的制備取一半(約500ML左右)脂肪組織，以500G的速度離心5mim，分離脂肪部分(PLA)和液體部分(LAF)，然后分別采用不同的方法步驟分離其中的SVF。PLA 部分
①用I-型膠原酶37攝氏度水浴消化30分鐘，并不斷搖晃。吉村的文章用的膠原酶濃度為0. 075%的膠原酶
②800g離心10分鐘，未消化的組織碎片和成熟的脂肪細(xì)胞會處于離心管的上層，SVF 處于離心管的底部。③以上離心后的底部細(xì)胞團(tuán)用紅細(xì)胞裂解液重懸，室溫作用5min;
④用100μ m的一次性細(xì)胞篩網(wǎng)過濾以去除其中的組織碎片和雜質(zhì)獲取單細(xì)胞
⑤用DMEM重懸細(xì)胞，以300G離心5分鐘，重復(fù)3次。LAF 部分
①400g離心10分鐘，SVF處于離心管的底部；
②以上離心后的底部細(xì)胞團(tuán)用紅細(xì)胞裂解液重懸，室溫作用5min；
③用100μ m的一次性細(xì)胞篩網(wǎng)過濾以去除其中的組織碎片和雜質(zhì)獲取單細(xì)胞
④用DMEM重懸細(xì)胞，以300G離心5分鐘，重復(fù)3次。(3)完整CAL移植物的準(zhǔn)備首先將擴(kuò)增好的脂肪干細(xì)胞添加到新制備好的SVF 中，按107100ml脂肪的比例添加，最后將SVF和移植的脂肪組織混勻。
權(quán)利要求
1.一種富集自體干細(xì)胞的脂肪組織隆胸材料的制備方法，其特征為，主要包括如下步驟(1)從病患身上微創(chuàng)抽取脂肪組織，GMP實驗室內(nèi)經(jīng)過分離提取、純化、檢測、擴(kuò)增等步驟，獲得高數(shù)量的干細(xì)胞；(2)全麻，用插管和負(fù)壓抽脂機(jī)抽取脂肪組織；(3)取一半脂肪組織離心，分離脂肪吸入物，得到移植脂肪組織，并置于無菌容器內(nèi)冰浴保存；(4)取另一半脂肪組織離心分離脂肪部分和液體部分，然后分別用酶消化法和梯度離心法分離其中的SVF，并計數(shù)測活度；(5)將擴(kuò)增好的脂肪干細(xì)胞添加到新制備好的SVF中，按107100ml脂肪的比例添加， 最后將SVF和移植脂肪組織混勻。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富集自體干細(xì)胞的脂肪組織隆胸材料的制備方法，其特征在于所述病患為體重指數(shù)大于15的十幾歲到七十多歲的健康人群，其中，身上少脂肪的運(yùn)動員除外。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的富集自體干細(xì)胞的脂肪組織隆胸材料的制備方法，其特征在于步驟(1)中，微創(chuàng)抽取脂肪組織的量為5ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的富集自體干細(xì)胞的脂肪組織隆胸材料的制備方法，其特征在于步驟(3)中，脂肪組織以500G的速度離心5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的富集自體干細(xì)胞的脂肪組織隆胸材料的制備方法，其特征在于步驟(4)中，脂肪組織以300G的速度離心5min。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別公開了一種富集自體干細(xì)胞的脂肪組織隆胸材料的制備方法。本發(fā)明首先從病號僅抽取5ml組織，經(jīng)過分離、純化、及體外培養(yǎng)擴(kuò)增得到高數(shù)量的脂肪干細(xì)胞，最后添加到新制備的SVF成分中，與脂肪組織混勻用于隆胸移植。本發(fā)明可以減少脂肪移植時用于制備SVF脂肪組織的用量，以彌補(bǔ)大量女性因體重指數(shù)偏低而無法獲得大量的脂肪組織來制備SVF而不能進(jìn)行自體脂肪隆胸的弊端。
文檔編號A61L27/38GK102258810SQ201110203210
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者孫理蘭, 張慧慧, 李榮榮, 王泰華 申請人:王泰華