專(zhuān)利名稱(chēng)：一種以殼聚糖為佐劑的類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型疫苗發(fā)明領(lǐng)域，具體地說(shuō)是殼聚糖為佐劑的類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
過(guò)敏性疾病(如過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎等)是臨床上的常見(jiàn)病和多發(fā)病，據(jù)2000年WHO/IAACI報(bào)告指出近年來(lái)哮喘的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)。全國(guó)部分城市對(duì)青少年哮喘流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)哮喘發(fā)病率為3.3％-5.1％，遠(yuǎn)較10年前的1％要高；目前我國(guó)至少有一千萬(wàn)以上兒童患哮喘。
過(guò)敏性疾病是由于各種接觸或吸入變應(yīng)原引起的，變應(yīng)原大部分為蛋白質(zhì)，也可為多肽或糖類(lèi)以及人工合成的物質(zhì)如藥物等。其中塵是強(qiáng)烈的變應(yīng)原，能引起全身性變態(tài)反應(yīng)包括變應(yīng)性哮喘、變應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性蕁麻疹等疾病。變應(yīng)疾病相應(yīng)約占各種變應(yīng)疾病的60％左右。自從Voorhorst和Spieksma(1964)首次證實(shí)塵螨及代謝產(chǎn)物是屋塵中的主要過(guò)敏原以來(lái)，世界各國(guó)(歐美國(guó)家、日本、中國(guó)等)變態(tài)反應(yīng)學(xué)工作者通過(guò)調(diào)查也一致證實(shí)塵螨是世界性的主要變應(yīng)原。其他較重要的變應(yīng)原有花粉變應(yīng)原、真菌變應(yīng)原和蟑螂變應(yīng)原等。與過(guò)敏性疾病有關(guān)的塵螨主要為屋塵螨(Derpmaatophagoidespteronyssinus，Der p)和粉塵螨(Dermatophagoides farinae，Derf)，其中屋塵螨在過(guò)敏性疾病患者特異性免疫診斷中陽(yáng)性率為第一位，次其為粉塵螨。粉塵螨和屋塵螨的主要變應(yīng)原序列具有極高的同源性，其中II類(lèi)變應(yīng)原序列同源性為87％，而且兩者之間有交叉反應(yīng)性。變應(yīng)原免疫治療又稱(chēng)特異性變態(tài)反應(yīng)疫苗治療(Specificallergy vaccination，SAV)，是目前唯一的病因性治療，它將使過(guò)敏性疾病(哮喘)個(gè)體內(nèi)的Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)優(yōu)勢(shì)發(fā)生偏離和逆轉(zhuǎn)，重建類(lèi)似非過(guò)敏性個(gè)體內(nèi)的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制，該治療方法已得到世界衛(wèi)生組織(WHO)的充分肯定。研制出粉塵螨變應(yīng)原疫苗用于治療是我國(guó)衛(wèi)生界工作者一項(xiàng)十分迫切的任務(wù)。
目前國(guó)內(nèi)臨床上使用的變應(yīng)原疫苗多為注射制劑，由于是水性制劑變應(yīng)原存在著降解快(影響免疫治療療效)、需長(zhǎng)期反復(fù)注射(1-3次/周，患者依從性較差)，并限于6歲以上兒童使用，以及有發(fā)生過(guò)敏性休克的危險(xiǎn)等不足之處，病人依從性差，大大防礙了特異性變應(yīng)原治療的實(shí)施。因此，探討新型佐劑、新型給藥方式和低變應(yīng)原性的變應(yīng)原是當(dāng)前的熱點(diǎn)。本疫苗結(jié)合了此三方面的優(yōu)勢(shì)，具有安全、高效和方便等特點(diǎn)。
類(lèi)變應(yīng)原是采用化學(xué)修飾方法對(duì)變應(yīng)原進(jìn)行處理，得到變應(yīng)原性減弱，而保留其抗原性的類(lèi)變應(yīng)原。一項(xiàng)關(guān)于類(lèi)變應(yīng)原和傳統(tǒng)變應(yīng)原的SIT比較研究顯示，前者有較高的抗原耐受劑量，而且1gG產(chǎn)生加快。這導(dǎo)致只注射7-8針的短期治療概念的產(chǎn)生。在隨后兩個(gè)多中心研究中，短期SIT治療被證明臨床效果非常令人滿意，副作用發(fā)生率降低，停止治療后臨床效果可持續(xù)3年。變態(tài)反應(yīng)供體經(jīng)變應(yīng)原刺激的T細(xì)胞體外研究表明，在類(lèi)變應(yīng)原刺激時(shí)的TH1/TH2轉(zhuǎn)移，比變應(yīng)原刺激時(shí)更明顯，有劑量依賴(lài)性。加大抗原劑量多次刺激，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞素的產(chǎn)生增加，其中IFN-γ的增加比IL-4明顯。
經(jīng)舌下含服給藥較皮下注射具有以下優(yōu)點(diǎn)①安全，無(wú)嚴(yán)重副反應(yīng)，尤其是過(guò)敏性休克；②無(wú)年齡限制，可用于早期防治變態(tài)反應(yīng)性疾病，對(duì)2-5歲兒童不適宜注射者亦可以使用；③使用方便。④舌下粘膜較薄且血管豐富，易于對(duì)變應(yīng)原的吸收。舌下含服經(jīng)多個(gè)臨床雙盲對(duì)照實(shí)驗(yàn)證實(shí)可有效的治療呼吸道過(guò)敏性疾病，如哮喘，過(guò)敏性鼻炎。其治療機(jī)理的研究尚處于起步階段，可能與免疫耐受相關(guān)。Bagnasco等人報(bào)道，舌下含服的變應(yīng)原可停留在舌下粘膜長(zhǎng)達(dá)2h，提示舌下含服途徑可促使變應(yīng)原與粘膜下的郎格罕細(xì)胞結(jié)合，啟動(dòng)免疫耐受免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。故研制出新型高效、安全方便的變應(yīng)原舌下含服疫苗并探討其作用機(jī)理是當(dāng)前該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
殼聚糖是一種從甲殼類(lèi)動(dòng)物提取制備的生物可降解性多糖，無(wú)生物毒性，具有良好的組織相容性。另外它作為生物粘附劑可延長(zhǎng)制劑在用藥部位的作用時(shí)間，促進(jìn)粘膜對(duì)變應(yīng)原的吸收；它還能打開(kāi)上皮細(xì)胞間的緊密連接，促進(jìn)大分子物質(zhì)通過(guò)上皮轉(zhuǎn)運(yùn)。作為黏膜佐劑可增強(qiáng)局部和系統(tǒng)抗體生成。Kumar等(2003)報(bào)道殼聚糖納米粒子作為佐劑它可選擇性激發(fā)Th1型CD4+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，分泌IFN-γ，并能刺激IgG2a的分泌，抑制IgE的產(chǎn)生，動(dòng)物模型也證實(shí)對(duì)過(guò)敏性疾病具有免疫保護(hù)和治療性作用。故殼聚糖是一種良好的變應(yīng)原舌下疫苗佐劑。
所以，以殼聚糖為佐劑的類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗具有新型、安全和高效的特點(diǎn)，是具有潛在廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是利用具有良好的生物組織相容性、無(wú)毒性、生物可降解性、促黏膜吸收的殼聚糖作為佐劑，制備新型、安全和有效的類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗。
本發(fā)明采用生化方法提取并精純獲得天然變應(yīng)原溶液，將其與甲醛溫和作用，制備變應(yīng)原性大大降低而保留具有T細(xì)胞決定簇和免疫原性的類(lèi)變應(yīng)原。通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)其生物學(xué)特性和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)IgE反應(yīng)性，免疫動(dòng)物觀察其抗體滴度。然后將殼聚糖與類(lèi)變應(yīng)原溶液混合，制備殼聚糖-類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗。該疫苗克服了傳統(tǒng)粉塵螨粗浸液疫苗質(zhì)量控制難、給藥周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)，具有控釋性和保護(hù)胃腸道酶降解等優(yōu)點(diǎn)，可減少超敏反應(yīng)的發(fā)生。該生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，具有經(jīng)濟(jì)性和實(shí)用性等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明包括可以通過(guò)以下方式實(shí)施具體實(shí)施方式
本發(fā)明的內(nèi)容，通過(guò)以下的實(shí)施例作具體說(shuō)明實(shí)施例1用生化提取技術(shù)精提粉塵螨變應(yīng)原①、樣品制備粉塵螨來(lái)自深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物和基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，取1克粉塵螨樣品，放于-70℃冰箱冷凍10分鐘，取出后用剪刀充分剪碎，并加入適量預(yù)冷乙醚-丙酮(1∶2)去脂。丙酮連續(xù)去脂48小時(shí)，期間換液5次(每8～10小時(shí)換液一次)，并放于通風(fēng)廚下讓其自然干燥。以上操作均在冰浴上進(jìn)行。
脫脂后，對(duì)樣品進(jìn)行稱(chēng)重，并以一定的比例用碳酸氫鹽-鹽水提取液(Coca’s)浸泡樣品。按1g樣品20ml Coca’s液(w/v)的比例加入提取液。同時(shí)用柱塞式勻漿機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行充分研磨破碎。將破碎好的樣品用Coca’s液提取48hr。期間將樣品充分?jǐn)嚢?，并放?℃冰箱。
離心樣品在4℃，15000轉(zhuǎn)離心20分鐘。離心后，吸取上清液，去沉淀。
②、透析4℃下，將上清對(duì)水透析兩天，每天換液2-3次。
③、冷凍干燥根據(jù)需要將透析好后的樣品進(jìn)行冷凍干燥，制成粉末，保存于4℃或-20℃，以備使用(也可跳過(guò)本步驟)。
④、采用不連續(xù)SDS-PAGE體系對(duì)粗提液中蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離及分子量測(cè)定⑤、采用Western-blotting方法對(duì)樣品的變應(yīng)原進(jìn)行免疫學(xué)特性鑒定。如鑒定證明提取液具有抗原活性。
⑥、凝膠過(guò)濾層析將樣品濃縮液濃度以0.02mol/L pH7.2的Tris緩沖液調(diào)整為10mg/ml，在FPLC控制系統(tǒng)下，上預(yù)先含0.15mol/L NaCl的0.02mol/L的Tris緩沖液充分平衡的Superdex-75柱，上樣后，以相同的緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min。獲得分子量為10,000到50,000Da的變應(yīng)原蛋白樣品。
⑦、層析組分的純度和分子量測(cè)定用垂直平板電泳槽，14.4kDa～116.0kDa分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白作對(duì)照，并進(jìn)行SDS-PAGE，再用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)出粉塵螨變應(yīng)原層析組分的純度和分子質(zhì)量。
⑧、收取樣品冷凍干燥保存。
用示意圖表示具體步驟如下(1)提取樣品冰凍↓破碎↓丙酮去脂↓風(fēng)干↓Coca’s液提取水溶性蛋白↓SDS-PAGE電泳檢測(cè)↓Western Blotting免疫學(xué)特性鑒定↓透析↓冷凍干燥保存
(2)純化蛋白對(duì)0.02mol/L pH7.2的Tris緩沖液透析↓凝膠過(guò)濾層析上樣↓↓收集流出液進(jìn)行SDS-PAGE↓Western Blotting免疫學(xué)特性鑒定↓收取純化樣品冷凍干燥保存實(shí)施例2粉塵螨類(lèi)變應(yīng)原的制備在4℃條件下，將1％甲醛水溶液與10％粉塵螨變應(yīng)原溶液以等體積混合，輕柔攪拌。制備粉塵螨類(lèi)變應(yīng)原溶液。
實(shí)施例3粉塵螨類(lèi)變應(yīng)原的鑒定通過(guò)SDS-PAGE鑒定其變應(yīng)原的分子量；通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)IgE反應(yīng)性(變應(yīng)原性)用粉塵螨變應(yīng)原溶液包被微孔板，4℃過(guò)夜，用磷酸鹽緩沖液(PBS；100mmol/L，pH7.4)洗板?？子?00μl含10g/L BSA的PBS(BSA/PBS)封閉過(guò)夜。五點(diǎn)定標(biāo)曲線用BSA/PBS對(duì)粉塵螨變應(yīng)原溶液系列稀釋后操作。加入用BSA/PBS 1∶1稀釋的免疫球蛋白(粉塵螨特異性IgE)和競(jìng)爭(zhēng)物(稀釋定標(biāo)物或粉塵螨類(lèi)變應(yīng)原)于試管中。每管取出100μl加入微孔板37℃溫育2小時(shí)，洗板3次，加入100μl辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合山羊抗鼠IgE的BSA/PBS液，37℃2h，洗板三次，用3、3、5、5、四甲基聯(lián)苯胺作基質(zhì)測(cè)定結(jié)合過(guò)氧化酶，顯色時(shí)間30min，加入50μl 1mol/L的HCl終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀450nm處讀板。結(jié)果計(jì)算為1Ac/Ao×100其中Ao為未加競(jìng)爭(zhēng)物的吸光度，Ac為加入競(jìng)爭(zhēng)物后的吸光度。
將類(lèi)變應(yīng)原溶液免疫小鼠，間隔三周，免疫兩次，觀察其產(chǎn)生的IgG和IgE抗體滴度(抗原性)。變應(yīng)原性大大降低而抗原性不變的類(lèi)變應(yīng)原為符合標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品。
實(shí)施例4殼聚糖與粉塵螨類(lèi)變應(yīng)原的結(jié)合將殼聚糖(SIGMA產(chǎn))(0 2％w/v)溶解于25mmol/L，pH5.0的醋酸鈉溶液中。將類(lèi)變應(yīng)原與殼聚糖混合，制備所得產(chǎn)品用SDS-PAGE鑒定。
實(shí)施例5殼聚糖-粉塵螨類(lèi)變應(yīng)原免疫治療過(guò)敏性哮喘動(dòng)物采用C57BL/6小鼠，6-8周齡，按隨機(jī)數(shù)字分組法分為5組，每組6只，分別為(1)正常組(2)模型組(3)空白殼聚糖治療組(4)粉塵螨類(lèi)變應(yīng)原治療組(5)殼聚糖-粉塵螨類(lèi)變應(yīng)原治療組。在0、7、14天，第2-5組用粉塵螨粗浸液(10ug/ml)+10mg/mlAl(OH)3腹腔內(nèi)致敏。在28、29、30天，第2-5組給予相應(yīng)的試劑治療。在44-46天，第2-5組連續(xù)給予50ug/50ul粉塵螨粗浸液滴鼻激發(fā)，激發(fā)后24小時(shí)，將所有動(dòng)物處死，進(jìn)行支氣管肺泡灌洗、肺組織病理檢查等實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)治療哮喘的效果。實(shí)驗(yàn)表明，殼聚糖-粉塵螨類(lèi)變應(yīng)原治療組免疫治療過(guò)敏性哮喘效果良好。
權(quán)利要求
1.一種以殼聚糖為佐劑的舌下含服類(lèi)變應(yīng)原疫苗的制備方法。具體地說(shuō)采用生化方法提取并精純獲得天然變應(yīng)原溶液，將其與甲醛/戊二醛溫和作用，制備變應(yīng)原性大大降低而保留具有T細(xì)胞決定簇和免疫原性的類(lèi)變應(yīng)原。通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)其生物學(xué)特性和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)IgE反應(yīng)性，免疫動(dòng)物觀察其抗體滴度。將殼聚糖與類(lèi)變應(yīng)原混合，制備殼聚糖-類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗。同時(shí)通過(guò)建立小鼠粉塵螨變應(yīng)原哮喘動(dòng)物模型，給予殼聚糖-類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗舌下含服干預(yù)治療，證實(shí)殼聚糖類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗對(duì)過(guò)敏性哮喘具有治療作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)將化學(xué)修飾的粉塵螨類(lèi)變應(yīng)原與殼聚糖混合制備以殼聚糖為佐劑的粉塵螨類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗的制備方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)將化學(xué)修飾的屋塵螨類(lèi)變應(yīng)原與殼聚糖混合制備以殼聚糖為佐劑的屋塵螨類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗的制備方法。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)將化學(xué)修飾的花粉類(lèi)變應(yīng)原與殼聚糖混合制備以殼聚糖為佐劑的花粉類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗的制備方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)將化學(xué)修飾的真菌類(lèi)變應(yīng)原與殼聚糖混合制備以殼聚糖為佐劑的真菌類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗的制備方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)將化學(xué)修飾的蟑螂類(lèi)變應(yīng)原與殼聚糖混合制備以殼聚糖為佐劑的蟑螂類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗的制備方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述殼聚糖-粉塵螨類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗用于過(guò)敏性哮喘的治療。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述殼聚糖-屋塵螨類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗用于過(guò)敏性哮喘的治療。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述殼聚糖-花粉類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗用于過(guò)敏性哮喘的治療。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述殼聚糖-真菌類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗用于過(guò)敏性哮喘的治療。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述殼聚糖-蟑螂類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗用于過(guò)敏性哮喘的治療。
12.根據(jù)權(quán)利要求1將上述類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗聯(lián)合用于過(guò)敏性哮喘的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以殼聚糖為佐劑的舌下含服類(lèi)變應(yīng)原疫苗的制備方法。本發(fā)明應(yīng)用甲醛與天然提取變應(yīng)原溶液溫和作用，制備類(lèi)變應(yīng)原，再以殼聚糖為佐劑制備舌下含服疫苗。具體地說(shuō)采用生化方法提取并精純獲得天然變應(yīng)原溶液，將其與甲醛溫和作用，制備變應(yīng)原性大大降低而保留具有T細(xì)胞決定簇和免疫原性的類(lèi)變應(yīng)原。通過(guò)SDS－PAGE檢測(cè)其生物學(xué)特性和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)IgE反應(yīng)性，免疫動(dòng)物觀察其抗體滴度。將殼聚糖與類(lèi)變應(yīng)原混合，制備殼聚糖－類(lèi)變應(yīng)原疫苗。同時(shí)通過(guò)建立小鼠變應(yīng)原哮喘動(dòng)物模型，給予殼聚糖類(lèi)變應(yīng)原舌下含服干預(yù)治療，證實(shí)殼聚糖－類(lèi)變應(yīng)原舌下含服疫苗對(duì)過(guò)敏性哮喘具有治療作用。
文檔編號(hào)A61P11/00GK1733299SQ20051003647
公開(kāi)日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2005年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月11日
發(fā)明者劉志剛, 冉丕鑫, 鐘南山, 喻海瓊, 吉坤美 申請(qǐng)人:深圳大學(xué), 廣州醫(yī)學(xué)院