專利名稱：一種納米紅花黃色素注射制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種納米紅花黃色素注射制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
納米中藥主要是指運(yùn)用納米技術(shù)制造的，粒徑小于100納米的中藥有效成分、有效部位、原藥及復(fù)方制劑。生物機(jī)體對(duì)藥物的吸收、代謝是一個(gè)復(fù)雜的過程，中藥制劑產(chǎn)生的藥理效應(yīng)不能僅僅歸之于藥物特有的化學(xué)組成還與該制劑的物理狀態(tài)密切相關(guān)。因此，改變藥物制劑的物理狀態(tài)是新藥研制的一種有效方法。在改變物理狀態(tài)方面，改變藥物的單元尺寸是十分有效的。當(dāng)顆粒尺寸進(jìn)入納米量級(jí)時(shí)由于量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，納米粒子呈現(xiàn)出新奇的物理化學(xué)和生物學(xué)特性。這就是應(yīng)用納米技術(shù)于中藥研究可能使藥物活性和生物利用度提高乃至產(chǎn)生新的特性依據(jù)所在。
同傳統(tǒng)中藥相比，納米中藥具有以下特點(diǎn)①提高了藥物的利用度，減少用藥量。②增強(qiáng)藥物的靶向性。③具有緩釋功能，將中藥納米粒進(jìn)行一定的表面修飾后，可能使中藥具有緩釋作用。④呈現(xiàn)新的藥效，拓寬原藥適應(yīng)癥，中藥加工至納米尺寸時(shí)，由于其量子尺寸等效應(yīng)導(dǎo)致其物理、化學(xué)特性的改變，從而可使中藥呈現(xiàn)出新功能。⑤豐富中藥的劑型選擇，提升傳統(tǒng)給藥途徑。
目前納米技術(shù)在中藥研究中存在以下的問題。第一，納米中藥的制備困難我國(guó)雖已制備一些納米級(jí)的中藥，可是由于中藥品種繁多，成分復(fù)雜，不同的成分由于其作用部位、作用機(jī)制及作用緩急的不同而要求其粒徑大小、載體成分及給藥劑量均有可能不同。同時(shí)納米中藥應(yīng)該有它自己的一套質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使其生產(chǎn)規(guī)范化。第二，納米中藥的毒副作用藥物制成納米微粒，其物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)均發(fā)生了顯著的變化，這些變化對(duì)人體是否有毒副反應(yīng)均未有有關(guān)的研究報(bào)道。但由于納米材料的特殊性，除了可穿透皮膚，還會(huì)進(jìn)入細(xì)胞器內(nèi)，是否會(huì)直接參與或作為催化劑擾亂機(jī)體正常的化學(xué)反應(yīng)，均未見有關(guān)報(bào)道。此外，納米中藥還可以通過機(jī)體的屏障系統(tǒng)，那它是否會(huì)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，精子的生成及其活力、胎兒的發(fā)育等，這些問題均無(wú)法回避。第三，中藥在納米級(jí)粉碎后，納米微粒表面積變大，由于納米微粒表面的活性使他們很容易團(tuán)聚在一起，這給納米微粒的收集及其藥效的穩(wěn)定性帶來(lái)很大的困難。第四，成本提高由于現(xiàn)有技術(shù)水平及設(shè)備的限制，造成納米中藥在制備中的花費(fèi)比傳統(tǒng)中藥的制備要高出不少。
目前納米中藥的研究主要集中于利用納米技術(shù)對(duì)少數(shù)成分比較明確的單體有效成分進(jìn)行納米處理制成納米制劑，或?qū)⒃纤幹苯臃鬯槌杉{米級(jí)，對(duì)大部分中藥的納米制劑研究還很少，主要是因?yàn)橹兴幱行С煞趾陀行Р课惶貏e是中藥復(fù)方中有效部位本身就是一個(gè)“黑匣子”，中藥中真正起藥理作用的有效成分或有效部位研究本身就是一個(gè)難題，而且由于中藥成分比較復(fù)雜，所以將其制備成納米制劑需要克服的困難較多，因此，中藥納米制劑及技術(shù)是醫(yī)藥科研工作者的重要研究課題。
紅花黃色素(safflor yellow)是由中藥紅花中提取分離得到的有效部位，紅花黃色素有效部位中紅花黃色素含量≥80％，其中主要有效單體——羥基紅花黃色素A含量≥70％，紅花黃色素由浙江永寧制藥廠生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字Z20050145，紅花黃色素具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈血流量、鈣離子拮抗、抗凝、溶解血栓、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、降血脂及抗脂質(zhì)過氧化等藥理作用，紅花黃色素在治療心腦血管疾病時(shí)，表現(xiàn)出非常良好的臨床療效。
中風(fēng)對(duì)大腦機(jī)能有嚴(yán)重的損害，會(huì)有大量流質(zhì)物從效動(dòng)脈及微血管滲入腦組織的空隙，引起腦水腫，是腦中風(fēng)的并發(fā)癥，腦水腫增大腦壓而減少血液和其他體液的流量，甚至移動(dòng)腦半球或整個(gè)腦部與頭骨的位置，腦壓增大使得腦半球下垂，妨害腦下部的呼吸及心跳功能，損害知覺視覺，抑制中樞神經(jīng)的功能，造成意識(shí)障礙，病人會(huì)變成癡呆人。但文獻(xiàn)報(bào)道[劉月慶等，紅花黃色素A在小鼠體內(nèi)的分布，藥學(xué)學(xué)報(bào).2004，39(3)217-219)]紅花黃色素A極難進(jìn)入腦脊液，，這不利于紅花黃色素對(duì)的腦部疾病及中風(fēng)引起的腦水腫等的治療，限制了其療效的發(fā)揮。同時(shí)紅花黃色素中的主要成分紅花黃色素A穩(wěn)定性尤其是熱穩(wěn)定性差也限制了其制劑的應(yīng)用。
專利檢索中未發(fā)現(xiàn)納米紅花黃色素制劑的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述原因，本發(fā)明研究人員經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)研究，將紅花黃色素與適宜脂質(zhì)、乳化劑等輔料結(jié)合用本發(fā)明方法制備成本發(fā)明納米注射制劑，本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，易于大生產(chǎn)，采用本發(fā)明方法制備的納米制劑載藥量大，制劑穩(wěn)定性好，本發(fā)明制劑能顯著提高紅花黃色素通過血腦屏障的能力，使納米紅花黃色素制劑不但對(duì)心血管疾病療效顯著，而且對(duì)腦血管疾病的急性發(fā)作也有顯著療效，而將紅花黃色素制備成了納米制劑后，制劑具有了很好的緩釋功能，能使有效成分緩慢釋放，長(zhǎng)時(shí)間保持對(duì)用藥部位的作用，從而對(duì)腦梗塞、中風(fēng)后癱瘓引起的腦水腫等慢性心腦血管疾病有良好療效，有助于中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)，而且減少了用藥頻率，本發(fā)明制劑安全性更好、刺激性小，藥理實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明制劑藥理作用顯著提高。
本發(fā)明旨在提供一種穩(wěn)定好、副作用小、療效好且具緩釋作用的納米紅花黃色素注射制劑。
本發(fā)明還提供了上述納米紅花黃色素注射制劑的制備方法。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一、工藝制法(1)制劑處方重量份組成為紅花黃色素1-5份，乳化劑10-50份，脂質(zhì)15-75份，助乳化劑7-21份。
(2)主藥混懸液的制備取處方量的紅花黃色素、乳化劑、脂質(zhì)，加熱至50-70℃，在攪拌條件下加入適量相同溫度助乳化劑的水溶液，制成粗乳，在50-70℃條件下用高壓乳勻機(jī)載50MPa壓力下乳勻5次，迅速冷卻至室溫形成主藥混懸液。
(3)制劑的制備水針制劑的制備.取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米紅花黃色素水針制劑；輸液制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，加入氯化鈉或葡萄糖調(diào)等滲，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米紅花黃色素輸液制劑；粉針制劑的制備取上述混懸液，加入賦形劑，加注射用水調(diào)整濃度，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，冷凍干燥，制備成本發(fā)明紅花黃色素A粉針制劑。
本發(fā)明所用乳化劑為磷脂(包括大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂及磷脂酰膽堿等)，優(yōu)選為大豆卵磷脂。
本發(fā)明所用的脂質(zhì)為三硬脂酸甘油酯、三棕櫚酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三窬酸甘油酯，優(yōu)選為三肉豆蔻酸甘油酯和三窬酸甘油酯。
本發(fā)明助乳化劑為泊洛沙姆、吐溫-80、甘油，優(yōu)選為泊洛沙姆∶甘油為1∶0.4。
本發(fā)明納米注射制劑可以為納米水針劑、納米粉針劑、納米輸液制劑。
本發(fā)明納米水針劑、納米輸液劑加入少量PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，可以提高制劑的穩(wěn)定性，防止納米粒聚集。
本發(fā)明納米粉針制劑的賦形劑為甘露醇、葡萄糖、乳糖、右旋糖酐、葡聚糖中的一種或兩種。
雖然將主藥制備成納米藥物均可以增加透過血腦屏障的藥物的量，但是透過血腦屏障的藥物量要達(dá)到具有治療作用的血藥濃度，載體的選擇在其中起著至關(guān)重要的作用。本發(fā)明研究人員對(duì)制備方法中常用的脂質(zhì)、乳化劑、助乳化劑進(jìn)行了優(yōu)選。上述制備方法中所用的脂質(zhì)、乳化劑、助乳化劑的用量和種類就是本發(fā)明研究人員優(yōu)選得到的，最終使得本發(fā)明納米紅花黃色素注射制劑不僅具有很好的透過血腦屏障作用，而且具有很好緩釋作用。
二、優(yōu)選試驗(yàn)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)驗(yàn)以藥物在腦脊液中的濃度和緩釋作用為指標(biāo)。
實(shí)驗(yàn)方法為取新西蘭家兔，體重約2.5kg，雌雄不限。靜脈注射給藥，于給藥后20分鐘和12小時(shí)分別抽取0.5ml腦脊液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取腦脊液0.25ml加溶劑混懸15min后，靜置15min，以10000r/min離心1min，取上清液用甲醇稀釋至適量，參照文獻(xiàn)方法[郭美麗等，UV，HPLC測(cè)定紅花黃色素、多糖和腺苷含量.中國(guó)藥學(xué)雜志，1999，34(8)，550]用分光光度法在403nm處測(cè)定吸光度并計(jì)算紅花黃色素的含量。
1.不同脂質(zhì)的影響制備一系列藥物，其中主藥、乳化劑(大豆卵磷脂)、助乳化劑(泊洛沙姆)的種類和用量相同，脂質(zhì)按下表的設(shè)計(jì)進(jìn)行安排。測(cè)定腦脊液中的藥物濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
為了比較方便，將20分鐘測(cè)定的兔腦脊液中的最大濃度計(jì)為100％。
表1不同脂質(zhì)對(duì)主藥透過血腦屏障的影響

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同脂質(zhì)對(duì)主藥通過血腦屏障和在腦脊液中的維持時(shí)間都有影響，其中三硬脂酸甘油酯、三棕櫚酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三窬酸甘油酯不僅增加主藥對(duì)于血腦屏障的通透性且具緩釋作用，其中三肉豆蔻酸甘油酯和三窬酸甘油酯的作用效果最好。
2.不同乳化劑的影響制備一系列藥物，其中主藥、脂質(zhì)(三肉豆蔻酸甘油酯)、助乳化劑(泊洛沙姆)的種類和用量相同，乳化劑按下表的設(shè)計(jì)進(jìn)行安排。測(cè)定腦脊液中的藥物濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。
為了比較方便，將20分鐘測(cè)定的兔腦脊液中的最大濃度計(jì)為100％。
表2不同乳化劑對(duì)主藥透過血腦屏障的影響

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同乳化劑對(duì)主藥通過血腦屏障以及緩釋作用都有影響，其中大豆卵磷脂的作用效果最好。
3.不同助乳化劑的影響制備一系列藥物，其中主藥、脂質(zhì)(三肉豆蔻酸甘油酯)、乳化劑(大豆卵磷脂)的種類和用量相同，助乳化劑按下表的設(shè)計(jì)進(jìn)行安排。測(cè)定腦脊液中的藥物濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。
為了比較方便，將20分鐘測(cè)定的兔腦脊液中的最大濃度計(jì)為100％。
表3不同助乳化劑對(duì)主藥透過血腦屏障的影響

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同助乳化劑對(duì)主藥通過血腦屏障和緩釋作用都有影響，其中泊洛沙姆和甘油為1∶0.4時(shí)作用效果最好。
4.溫度的選擇制備一系列藥物，主藥、脂質(zhì)、乳化劑、助乳化劑的種類和用量相同，在不同溫度下制備藥物，以包封率為指標(biāo)。結(jié)果見表4。
表4溫度的選擇

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)溫度在50-70℃時(shí)，包封率都較好，其中50-60℃之間最好。
三、質(zhì)量檢測(cè)儀器H-7000型透射電鏡儀(日本Hitachi公司)；Zetamaster光子相關(guān)光譜儀(英國(guó)Malvern公司)；LC-10A高效液相色譜儀(日本島津)；TGL-18G型臺(tái)式高速離心機(jī)。
檢測(cè)依據(jù)參照《中華人民共和國(guó)藥典》2005版二部附錄XIX E指導(dǎo)原則項(xiàng)下的方法。
1.形態(tài)觀察及粒徑將本發(fā)明納米藥物在透射電鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察，可見呈圓球體，大小較均勻，表面光滑，無(wú)粘連。根據(jù)納米藥物的顯微照片測(cè)定了500個(gè)，平均粒徑為52.0nm，最大粒徑為72.1nm，最小粒徑為20.8nm，且粒徑分布符合正態(tài)分布規(guī)律。
2.包封率和載藥量測(cè)定進(jìn)行含量測(cè)定，并用下述公式計(jì)算包封率和載藥量包封率(％)＝(投藥量-游離藥物量)/投藥量×100％；載藥量(％)＝(投藥量-游離藥物量)/納米藥物的重量×100％。結(jié)果平均包封率為90.7％，載藥量為3％-5％。
3.穩(wěn)定性考察將本發(fā)明納米藥物分別置于小瓶?jī)?nèi)，密封。于冰箱(3-5℃)、室溫(20-25℃)和37℃(RH75％)的環(huán)境中放置，于0、1、2和3月觀測(cè)納米藥物的外觀、大小、再分散性等。結(jié)果均未見明顯變化，3種條件下的納米藥物再分散性保持良好，無(wú)聚合現(xiàn)象的發(fā)生。結(jié)果見表5。
表5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.加速實(shí)驗(yàn)含量測(cè)定注射用紅花黃色素(浙江永寧制藥廠)；本發(fā)明納米紅花黃色素注射制劑(按本發(fā)明制備工藝制備，由廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)室制備)；將以上制劑分別置40℃，RH75％條件下放置6個(gè)月，分別測(cè)定制劑中的紅花黃色素含量，考察加速條件下紅花黃色素含量的變化(以0月含量為100％計(jì)算)。結(jié)果見表6。
表6加速實(shí)驗(yàn)含量測(cè)定

含量測(cè)定結(jié)果表明本發(fā)明納米紅花黃色素注射制劑與注射用紅花黃色素比較穩(wěn)定性更好。
四、藥理實(shí)驗(yàn)試藥與動(dòng)物注射用紅花黃色素(浙江永寧制藥廠)；本發(fā)明納米紅花黃色素注射制劑(按本發(fā)明制備工藝制備，由廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)室制備)；新西蘭家兔，體重約2.5kg；Wistar大鼠，體重180-220g；小鼠，體重18-22g。
1.血腦屏障透過實(shí)驗(yàn)和緩釋作用試驗(yàn)取新西蘭家兔24只，體重約2.5kg，雌雄不限，分為4組，注射用紅花黃色素組、本發(fā)明納米紅花黃色素水針劑組、本發(fā)明納米紅花黃色素粉針劑組、本發(fā)明納米紅花黃色素輸液劑組，動(dòng)物靜脈注射上述制劑，給藥劑量為2mg/kg，給藥后在不同時(shí)間抽取0.5ml左右腦脊液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取樣時(shí)間分別為注射藥物后的5、10、20、30、60min、90min、120min。取腦脊液0.25ml加適量溶劑混懸15min后，靜置15min，以10000r/min離心1min，取上清液20μl進(jìn)樣，含量測(cè)定方法參照前述文獻(xiàn)紅花黃色素的含量測(cè)定方法。結(jié)果見表7。
表7不同時(shí)間腦脊液中藥物濃度的測(cè)定(μg/ml)

上述結(jié)果表明注射用紅花黃色素很難透過血腦屏障，且消除迅速，5min后即難以檢測(cè)到有效成分，而本發(fā)明納米紅花黃色素注射制劑通過血腦屏障的量顯著提高，且藥物維持時(shí)間更長(zhǎng)，18小時(shí)后有效成分依然保持了較高的值，24小時(shí)后還可以檢測(cè)到有效成分。
2.腦組織中藥物濃度測(cè)定取大鼠40只，體重180-220g，雌雄不限，分為4組，注射用紅花黃色素組、本發(fā)明納米紅花黃色素制劑組(包括納米水針劑、納米粉針劑、納米輸液劑)，動(dòng)物尾靜脈注射本發(fā)明制劑3mg/kg，給藥30min后立即斷頭處死取出腦組織，取出的腦組織用生理鹽水輕輕沖洗，用濾紙吸干，腦膜血管剝離干凈后取兩側(cè)大腦皮層處組織(約0.5g)，稱重。然后按組織∶生理鹽水＝1∶1.5(W/V)的比例勻漿，離心10min(2000rpm)，取上清液分析測(cè)定紅花黃色素含量。結(jié)果見表8。
表8腦組織中藥物濃度的測(cè)定(μg/ml)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明納米注射制劑在腦組織中的藥物濃度顯著高于注射用紅花黃色素。
3.對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠急性腦缺血的影響取健康雄性Wistar大鼠60只，隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為對(duì)照組，腦缺血模型組、注射用紅花黃色素組和本發(fā)明納米紅花黃色素注射制劑組(包括水針劑組、粉針劑組和輸液組)，給藥劑量為5mg/kg，動(dòng)物每日尾靜脈注射給藥一次，連續(xù)給藥6d，對(duì)照組和模型組給予等容量生理鹽水，末次給藥后10min，以烏拉坦1g/kg劑量腹腔注射麻醉，背位固定，手術(shù)分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，于給藥后30min股靜脈注射伊文思藍(lán)50mg/kg，對(duì)照組不結(jié)扎雙側(cè)頸動(dòng)脈，其它各組均于注射伊文思藍(lán)5min后立即結(jié)扎雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎3h后斷頭取腦稱重計(jì)算腦指數(shù)(mg/g)，另取部分腦稱重后，置4ml甲酰胺溶液中，置于45℃恒溫箱中72h，離心，取上層液于620nm處測(cè)定OD值，計(jì)算出腦內(nèi)伊文思藍(lán)含量(μg/g腦濕重)。將離心后腦組織置110℃烘箱中至恒重，計(jì)算腦含水量[％＝(濕重-干重)/濕重×100％]。結(jié)果見表9。
表9對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠急性腦缺血的影響


與對(duì)照組比較**p＜0.01，與模型組比較△p＜0.05△△p＜0.01實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紅花黃色素制劑對(duì)急性腦缺血?jiǎng)游锬X指數(shù)、腦含水量和伊文思藍(lán)含量均有改善作用，而本發(fā)明納米紅花黃色素注射制劑作用更為顯著，說明本發(fā)明納米制劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠急性腦缺血的保護(hù)作用更強(qiáng)。
4.對(duì)大鼠血液血栓形成的影響取健康大鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分5組，每組10只，分別為生理鹽水組，注射用紅花黃色素組和本發(fā)明納米紅花黃色素注射制劑組(包括水針劑組、粉針劑組和輸液組)，給藥劑量和方法同2，生理鹽水組給予等容量生理鹽水，于末次給藥后10min，以烏拉坦1g/kg劑量腹腔注射麻醉，固定，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈及左側(cè)頸外靜脈，按旁路法進(jìn)行血栓形成測(cè)定，使右側(cè)動(dòng)脈插管血液流經(jīng)置有棉線(6cm)的聚乙烯管進(jìn)入左側(cè)頸外靜脈，循環(huán)15min后，立即取出棉線稱重，計(jì)算血栓濕重及抑制率。結(jié)果見表10。
表10大鼠血液血栓形成的影響

與對(duì)照組比較**p＜0.01，與注射用紅花黃色素A比較△p＜0.05以上結(jié)果表明紅花黃色素制劑均能顯著減輕大鼠血栓濕重，而本發(fā)明納米紅花黃色素制劑與注射用紅花黃色素比較有顯著性意義，表明本發(fā)明納米注射制劑具有更強(qiáng)的抑制血栓形成的作用。
5.對(duì)小鼠耐缺氧的影響按常壓耐缺氧試驗(yàn)，取小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，給藥方法同3，給藥劑量為8mg/kg，給藥后60min，分別將小鼠置入含有10g鈉石灰的150ml廣口瓶中，密封瓶口，觀察動(dòng)物死亡時(shí)間，結(jié)果見表11。
表11對(duì)小鼠耐缺氧的影響

注與生理鹽水組比較*P＜0.05，**P＜0.01結(jié)果顯示，紅花黃色素制劑均能明顯延長(zhǎng)小鼠耐缺氧時(shí)間，其中本發(fā)明納米紅花黃色素注射制劑與注射用紅花黃色素比較作用更加明顯。
6.對(duì)腦血腫的影響模型建立實(shí)驗(yàn)兔均在術(shù)前1日耳動(dòng)脈采血約1ml，凝固，置冰箱4℃保存，手術(shù)當(dāng)日統(tǒng)一用硫酸紙?jiān)陔娮犹炱缴戏Q取150mg自體血凝塊，裝入20號(hào)穿刺針內(nèi)，行右側(cè)腦內(nèi)血腫埋藏術(shù)。所有動(dòng)物均用戊巴比妥鈉30mg/kg耳靜脈麻醉。手術(shù)部位為顱骨矢狀縫旁開0.6cm，冠狀縫前0.1cm，骨鉆鉆通顱骨，穿刺針垂直進(jìn)針深1.4cm，慢慢插入針芯，血塊即被推出。
實(shí)驗(yàn)分組120只新西蘭家兔隨機(jī)分為6組(1)正常對(duì)照組不造模，每日耳靜脈注射生理鹽水2ml/kg；(2)病理組，造模，并于造模前1天開始每日耳緣靜脈注射生理鹽水2ml/kg；(3)注射用紅花黃色素組，造模，并于造模前1天開始給予注射用紅花黃色素，每日1次，每次3mg/kg耳靜脈緩慢注射；(4)本發(fā)明納米紅花黃色素制劑組(包括納米水針劑、納米份針劑、納米輸液劑)，造模，并于造模前1天開始給予本發(fā)明納米紅花黃色素制劑，每日1次，每次3mg/kg耳靜脈緩慢注射。
樣品處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別在術(shù)后第3、7、14天分批殺檢取腦。3、7天腦經(jīng)縱裂均勻切為左、右兩半球，再經(jīng)血腫正中冠狀切開，分為左右前后四部分，前部作組織學(xué)檢查，后部作水含量、腦血管通透性。第14天腦，整個(gè)血腫區(qū)作連續(xù)切片，作組織學(xué)檢查。
觀察項(xiàng)目及檢測(cè)指標(biāo)(1)腦血管通透性測(cè)定造模后第3、7天進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于殺檢前24h，耳靜脈緩注2.5％EB生理鹽水1.5ml/kg，在給EB后24h，空氣栓塞動(dòng)物致死，迅速取腦，稱重，浸泡至5ml甲酰胺溶液中，于45℃放置72h，721型分光光度計(jì)620nm進(jìn)行比色，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得腦組織的EB含量，以此值表示血管通透性的變化。(2).腦指數(shù)及腦組織含水量測(cè)定腦指數(shù)＝腦重/體重×100％；腦組織含水量測(cè)定(濕重-干重)/濕重×100％。(3)組織學(xué)觀察。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)腦血管通透性的變化腦血腫形成后，腦血管通透性增強(qiáng)，腦內(nèi)EB含量明顯增加，病理組顯著高于正常組，以右側(cè)為甚(p＜0.01)，手術(shù)側(cè)(右側(cè))明顯高于非手術(shù)側(cè)(左側(cè))(p＜0.01)；紅花黃色素制劑可降低腦組織中EB的含量，與病理組相比有明顯差異，而本發(fā)明納米紅花黃色素注射制劑與注射用紅花黃色素比較作用更顯著(p＜0.05)，見表12。
表12對(duì)腦組織EB含量的影響

與左腦比較**p＜0.01，與病理組比較△△p＜0.01，與注射用紅花黃色素A比較#p＜0.05(2)腦指數(shù)及腦組織含水量的變化造模后第3、7天，病理組腦指數(shù)及右腦組織含水量明顯高于生理鹽水組(p＜0.05～0.01)，本發(fā)明納米紅花黃色素注射制劑組與注射用紅花黃色素組比較作用更加顯著，見表13。
表13對(duì)腦指數(shù)及腦組織含水量的影響

與生理鹽水組比較*p＜0.05**p＜0.01，與病理組比較△p＜0.05△△p＜0.01(3)組織學(xué)變化腦血腫形成3天時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞高度腫脹呈空網(wǎng)狀。7天時(shí)，水腫減輕，見有單核細(xì)胞浸潤(rùn)。14天時(shí)，水腫消失，膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，并有較多肉芽組織出現(xiàn)，Masson’s染色見病灶及其周圍有較多纖維成分；用本發(fā)明納米紅花黃色素制劑治療后，上述水腫現(xiàn)象減輕，并促使膠質(zhì)細(xì)胞、肉芽組織及膠原成分大量出現(xiàn)，對(duì)病灶的修復(fù)起到一定的積極作用，而注射用紅花黃色素作用相對(duì)較弱。
7.血管刺激性考察取健康大耳家兔3只，將動(dòng)物固定于兔箱內(nèi)，用酒精將皮膚消毒后，于右側(cè)耳緣靜脈處注射本發(fā)明納米藥物溶液，于另一側(cè)對(duì)應(yīng)部位注射同一體積的生理鹽水作為對(duì)照。每日注射1次，連續(xù)3次，觀察兔耳緣靜脈反應(yīng)。于末次給藥24h后將兔放血處死，取下兩耳，用10％甲醛溶液浸泡，距注射部位1-4cm處，解剖取出靜脈，做組織切片檢查，觀察注射部位的反應(yīng)。
結(jié)果試驗(yàn)過程中，肉眼觀察兩耳靜脈注射部位處，未見紅腫、熱等刺激表現(xiàn)。表明給藥組切片部位組織形態(tài)無(wú)明顯差異，未見本品毒性所致的病理形態(tài)學(xué)改變(血管結(jié)構(gòu)正常，無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，無(wú)血栓形成及具他病理性變化)。
8.溶血毒性考察
2％紅細(xì)胞混懸液的制備取兔耳緣靜脈取血10-20ml，放入盛有玻璃珠的錐形瓶中，振搖10分鐘，除去纖維蛋白原，使成脫纖血。加10倍量的生理鹽水溶液，搖勻，離心，除去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再用生理鹽水溶液洗滌2-3次，至上清液不呈紅色時(shí)為止。將所得的紅細(xì)胞用用生理鹽水配成濃度為2％的混懸液，即得。
試驗(yàn)方法取試管6支，按表中的配比量依次加入2％紅細(xì)胞混懸液和生理鹽水溶液，混勻，于37℃恒溫箱中放置30分鐘，分別加入不同量的藥液(以第6管為空白對(duì)照)，搖勻后，置37℃恒溫箱中，開始每隔15分鐘觀察1次，1小時(shí)后，每隔1小時(shí)觀察1次，共觀察2小時(shí)。結(jié)果見表14。
表14溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果以第3試管為準(zhǔn)，各管均未染有紅色，顯微鏡下觀察未見有紅細(xì)胞破裂，說明本品不溶血，安全性好。
9.急性毒性實(shí)驗(yàn)取小鼠80只，雌雄各半。禁食24h，隨機(jī)分4組，每組20只。稀釋成相同的生藥濃度，各組分別尾靜脈注射紅花黃色素200mg/kg，每天給藥1次，連續(xù)7天，觀察小鼠死亡情況，記錄數(shù)據(jù)，按改良寇氏法計(jì)算各組的LD50，結(jié)果見表15。
表15各實(shí)驗(yàn)組LD50比較


以上急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明納米紅花黃色素注射制劑與注射用紅花黃色素相比LD50相當(dāng)，說明本發(fā)明將紅花黃色素制成納米注射制劑后安全性基本沒有變化。
結(jié)論以上全部實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明納米紅花黃色素制劑安全性較好、藥理作用顯著提高，藥物血腦屏障通過率明顯增加且維持時(shí)間延長(zhǎng)，具有緩釋作用。
五、制備實(shí)施例實(shí)施例1(1)取紅花黃色素25g、大豆卵磷脂250g、三肉豆蔻酸甘油酯200g，加熱至50-60℃，在攪拌條件下加入相同溫度泊洛沙姆100g和甘油40g形成的水溶液，制成粗乳，在50-60℃條件下用高壓乳勻機(jī)載50MPa壓力下乳勻5次，迅速冷卻形成主藥混懸液。
(2)制劑的制備水針制劑的制備.取上述混懸液，加PVP 2g，加注射用水至2000ml，攪勻，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米紅花黃色素水針制劑；輸液制劑的制備取上述混懸液，加PVP 4g，加注射用水至50000ml，攪勻，加入氯化鈉調(diào)等滲，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米紅花黃色素輸液制劑；粉針制劑的制備取上述混懸液，加入甘露醇，加注射用水調(diào)整濃度，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，冷凍干燥，制備成本發(fā)明紅花黃色素粉針制劑500瓶。
實(shí)施例2(1)取紅花黃色素25g、大豆卵磷脂200g、三窬酸甘油酯200g，加熱至50-70℃，在攪拌條件下加入相同溫度泊洛沙姆100g和甘油40g形成的水溶液，制成粗乳，在50-70℃條件下用高壓乳勻機(jī)載50MPa壓力下乳勻5次，迅速冷卻形成主藥混懸液。
(2)制劑的制備水針制劑的制備.取上述混懸液，加PVP 2g，加注射用水至2000ml，攪勻，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米紅花黃色素水針制劑；輸液制劑的制備取上述混懸液，加PVP 3g，加注射用水至50000ml，攪勻，加入葡萄糖調(diào)等滲，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米紅花黃色素輸液制劑；粉針制劑的制備取上述混懸液，加入乳糖，加注射用水調(diào)整濃度，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，冷凍干燥，制備成本發(fā)明紅花黃色素粉針制劑500瓶。
實(shí)施例3(1)取紅花黃色素10g、大豆卵磷脂100g、三棕櫚酸甘油酯150g，加熱至50-60℃，在攪拌條件下加入適量相同溫度泊洛沙姆50g和甘油20g形成的水溶液，制成粗乳，在50-60℃條件下用高壓乳勻機(jī)載50MPa壓力下乳勻5次，迅速冷卻形成主藥混懸液。
(2)制劑的制備水針制劑的制備.取上述混懸液，加PVP 2g，加注射用水至2000ml，攪勻，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米紅花黃色素水針制劑；輸液制劑的制備取上述混懸液，加PVP 4g，加注射用水至50000ml，攪勻，加入氯化鈉調(diào)等滲，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米紅花黃色素輸液制劑；粉針制劑的制備取上述混懸液，加入葡萄糖，加注射用水調(diào)整濃度，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，冷凍干燥，制備成本發(fā)明紅花黃色素粉針制劑500瓶。
實(shí)施例4(1)取紅花黃色素50g、大豆卵磷脂500g、三硬脂酸甘油酯750g，加熱至50-70℃，在攪拌條件下加入適量相同溫度泊洛沙姆150g和甘油60g形成的水溶液，制成粗乳，在50-70℃條件下用高壓乳勻機(jī)載50MPa壓力下乳勻5次，迅速冷卻形成主藥混懸液。
(2)制劑的制備水針制劑的制備.取上述混懸液，加PVP 2g，加注射用水至2000ml，攪勻，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米紅花黃色素水針制劑；輸液制劑的制備取上述混懸液，加PVP 4g，加注射用水至50000ml，攪勻，加入葡萄糖調(diào)等滲，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米紅花黃色素輸液制劑；粉針制劑的制備取上述混懸液，加入右旋糖酐，加注射用水調(diào)整濃度，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，冷凍干燥，制備成本發(fā)明紅花黃色素粉針制劑500瓶。
實(shí)施例5(1)取紅花黃色素25g、蛋黃卵磷脂250g、三月桂酸甘油酯200g，加熱至50-70℃，在攪拌條件下加入適量相同溫度泊洛沙姆140g形成的水溶液，制成粗乳，在50-70℃條件下用高壓乳勻機(jī)載50MPa壓力下乳勻5次，迅速冷卻形成主藥混懸液。
(2)制劑的制備水針制劑的制備.取上述混懸液，加PVP 2g，加注射用水至2000ml，攪勻，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米紅花黃色素水針制劑；輸液制劑的制備取上述混懸液，加PVP 4g，加注射用水至50000ml，攪勻，加入氯化鈉調(diào)等滲，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米紅花黃色素輸液制劑；粉針制劑的制備取上述混懸液，加入右旋糖酐，加注射用水調(diào)整濃度，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，冷凍干燥，制備成本發(fā)明紅花黃色素粉針制劑500瓶。
權(quán)利要求
1.一種納米紅花黃色素注射制劑，其特征在于該藥物包括下述重量份的組成成分紅花黃色素1-5份，乳化劑10-50份，脂質(zhì)15-75份，助乳化劑7-21份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米紅花黃色素注射制劑，其制備方法為(1)主藥混懸液的制備取處方量的紅花黃色素、乳化劑、脂質(zhì)，加熱至50-70℃，在攪拌條件下加入適量相同溫度助乳化劑的水溶液，制成粗乳，在50-70℃條件下用高壓乳勻機(jī)載50MPa壓力下乳勻5次，迅速冷卻至室溫形成主藥混懸液。(2)制劑的制備水針制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米紅花黃色素水針制劑；輸液制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，加入氯化鈉或葡萄糖調(diào)等滲，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米紅花黃色素輸液制劑；粉針制劑的制備取上述混懸液，加入賦形劑，加注射用水調(diào)整濃度，調(diào)pH值為6.0-7.0，用0.22μm微孔濾膜過濾，冷凍干燥，制備成本發(fā)明紅花黃色素A粉針制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的一種納米紅花黃色素注射制劑的制備方法，其特征在于所述的乳化劑為大豆卵磷脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的一種納米紅花黃色素注射制劑的制備方法，其特征在于所述的脂質(zhì)為三肉豆蔻酸甘油酯和三窬酸甘油酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的一種納米紅花黃色素注射制劑的制備方法，其特征在于所述的助乳化劑為泊洛沙姆∶甘油為1∶0.4。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種納米紅花黃色素注射制劑及其制備方法，將紅花黃色素與適宜量的乳化劑、脂質(zhì)、助乳化劑采用本發(fā)明工藝方法制成納米載體，并制備成水針劑、粉針劑和輸液劑，本發(fā)明制劑穩(wěn)定性好，易通過血腦屏障，且具有緩釋作用，藥理作用表明本發(fā)明納米注射制劑安全性好具有更好的療效。
文檔編號(hào)A61P7/02GK1947712SQ200510112699
公開日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2005年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日
發(fā)明者張晴龍 申請(qǐng)人:張晴龍