專利名稱：雙歧桿菌細胞壁和雙歧桿菌細胞壁蛋白在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙歧桿菌細胞壁和雙歧桿菌細胞壁蛋白的用途，特別涉及在制藥領(lǐng)域中的用途。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌是發(fā)現(xiàn)最早的生理性細菌之一，現(xiàn)已在腸道疾病的防治、肝病的治療等方面獲得了臨床應(yīng)用(見《雙歧桿菌》P131-139，康白主編，大連海事大學出版社，1998年5月)。研究表明，其對機體免疫系統(tǒng)有著重要的影響，尤其是可激活機體免疫系統(tǒng)，例如，激活巨噬細胞、B淋巴細胞、NK細胞、……(見“雙歧桿菌的免疫激活作用及其生物學意義”，王立生綜述，潘令嘉周殿元審校，國外醫(yī)學生理、病理科學與臨床分冊，1998.18(4)，P320-322)，但尚未見關(guān)于雙歧桿菌細胞壁和細胞壁蛋白激活防御素(defensins)方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于證明雙歧桿菌細胞壁和細胞壁蛋白具有激活防御素基因表達的作用，以便開發(fā)出一類新的藥品。
防御素是一類富含半胱氨酸和精氨酸的低分子多肽，廣泛分布于動物、植物和昆蟲體內(nèi)。與其他抗微生物肽相比，防御素具有特殊的抗性機理，它主要作用于病原微生物的細胞膜，使病原微生物不易對其產(chǎn)生抗性。而其他抗微生物肽主要作用于微生物的酶，酶基因的突變就會使靶細胞對其產(chǎn)生抗性，因此防御素具有其他抗微生物肽無可比擬的優(yōu)勢。此外防御素還具有十分廣泛的抗菌譜，體外抑菌實驗表明防御素可以抗細菌、真菌、被膜病毒等多種微生物，尤其是哺乳動物防御素除了對細菌、真菌、被膜病毒有毒殺作用外，還對支原體、衣原體、螺旋體及一些惡性細胞(如腫瘤細胞)和愛滋病毒有殺傷作用，具有更為廣泛的抗菌譜。除了直接殺傷病原微生物外，對天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)的功能還有刺激作用，因此在醫(yī)藥上有著更廣泛的應(yīng)用前景和更高的應(yīng)用價值，但從宿主有機體中分離防御素成本極高，使得防御素的利用受到限制(見“哺乳動物防御素的研究進展及其應(yīng)用前景”陳穎、葛毅強等，生物化學與生物物理進展，2001；28(1)，P17-21)。新近的研究顯示，防御素(內(nèi)源性抗菌肽)具有誘導(dǎo)表達的特點，感染、創(chuàng)傷和炎癥信號可刺激皮膚和粘膜上皮細胞合成和分泌內(nèi)源性抗菌肽(見DiamandG，Bevins CL.β-defensinsEndogenous antilcuotics of the innate host defense response.Clin Immunol Immunopathol，1998，88221-225)，卡菌苗胞壁蛋白能增強人肺腺上皮細胞防御素hBD-1mRNA的表達及其抗菌活性(見“卡菌苗胞壁蛋白誘導(dǎo)人肺腺上皮細胞hBD-1mRNA表達及其抗菌活性的增強”，馮云等，中華微生物學和免疫學雜志2001年7月第21卷第4期，P400-403)?？梢?，通過活化因子刺激防御素表達是利用防御素的一條更現(xiàn)實的途徑。
本發(fā)明通過實驗證明了雙歧桿菌細胞壁和細胞壁蛋白對防御素基因是有效的活化因子，能使防御素的表達明顯增高。所激活的哺乳動物防御素為β-防御素-1、β-防御素-2、β-防御素-3、β-防御素-4、LL-37/CAP18。因此，可將雙歧桿菌細胞壁和細胞壁蛋白制備成激活哺乳動物防御素基因的藥品，用藥方法可以通過口服、靜脈內(nèi)的注射、吸入或者栓劑、灌腸、或者口腔沖洗。根據(jù)人體中防御素的特點，此類藥物主要用于消化道、呼吸道、泌尿生殖道等感染性疾病的免疫治療。
本發(fā)明中的雙歧桿菌細胞壁和細胞壁蛋白的制備方法如下1、雙歧桿菌細胞壁的制備將凍干的雙歧桿菌溶于裂解液(0.02mol/L磷酸緩沖液pH7.4，0.025％PMSF)中，冰浴下，20,000赫茲超聲間斷處理10～15次，每次處理時間為2分鐘，每次間隔時間為1～3分鐘，2000×g離心5分鐘，取上清，然后55,000×g離心30分鐘，取沉淀，溶于0.02mol/L的磷酸緩沖液中，獲得細胞壁組分。
2、雙歧桿菌細胞壁蛋白的制備將雙歧桿菌細胞壁溶于含1～2％SDS的磷酸緩沖液，室溫下孵育30～45分鐘，55,000～75,000×g離心30～45分鐘，取上清，透析3天，按沉淀法的操作程序除去SDS，然后在-70℃冷凍、在-112℃經(jīng)凍干機凍干濃縮，冷凍干燥后的雙歧桿菌細胞壁蛋白的保存溫度為-20℃。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點和積極效果1、雙歧桿菌細胞壁和雙歧桿菌細胞壁蛋白制備的藥品通過激活機體內(nèi)的防御素基因達到防治疾病的目的，開辟了一種新的免疫療法。
2、防御素可在哺乳動物的很多組織表達，例如大腦、腎臟、心臟、脾、頰黏膜、鼻黏膜、眼結(jié)膜、舌脈絡(luò)叢、氣管、支氣管、洗支氣管、輸卵管、子宮、子宮頸、陰道、睪丸、膀胱、尿道、食管、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、升結(jié)腸、乙壯結(jié)腸、盲腸、降結(jié)腸和直腸、耳朵、胰腺、肝臟、卵巢等，因而雙歧桿菌細胞壁和雙歧桿菌細胞壁蛋白制備的藥品可用來治療哺乳動物包括人類和動物多個組織所患的疾病。
3、雙歧桿菌對于宿主有益，它們之間處于共生狀態(tài)，因而雙歧桿菌細胞壁和雙歧桿菌細胞壁蛋白制備的藥品在誘導(dǎo)防御素的表達時只殺死包括病原體在內(nèi)的敏感的非益生菌，而對于益生菌沒有直接效應(yīng)，并可使益生菌獲得更多的營養(yǎng)，這對于益生菌在體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境提供很有效生長優(yōu)勢。
4、雙歧桿菌的來源廣，雙歧桿菌細胞壁和雙歧桿菌細胞壁蛋白的制備方法簡單，便于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
四

圖1是雙歧桿菌細胞壁蛋白的檢測圖，圖中，A為除去SDS前的雙歧桿菌細胞壁蛋白，B為除去SDS后的雙歧桿菌細胞壁蛋白，M為蛋白質(zhì)分子標記；圖2是各實驗組的人腸腺上皮細胞HT-29的總RNA檢測圖；圖3是利用RT-PCR檢測雙歧桿菌、雙歧桿菌細胞壁、雙歧桿菌細胞壁蛋白誘導(dǎo)人腸腺上皮細胞人β-防御素-1(hBD-1)基因表達的實驗結(jié)果圖，圖中，A為HT-29細胞本身hBD-1mRNA有低量的基礎(chǔ)表達，B為雙歧桿菌刺激后hBD-1mRNA的表達，C為雙歧桿菌細胞壁刺激后hBD-1mRNA的表達，D為雙歧桿菌細胞壁蛋白刺激后hBD-1mRNA的表達，M為DNA分子量標記；圖4是利用Northern技術(shù)檢測雙歧桿菌、雙歧桿菌細胞壁、雙歧桿菌細胞壁蛋白誘導(dǎo)人腸腺上皮細胞人β-防御素-1(hBD-1)mRNA表達的實驗結(jié)果圖，圖中，A為陰性對照HT-29細胞總RNA，B為雙歧桿菌刺激后的HT-29細胞總RNA，C為雙歧桿菌細胞壁刺激后的HT-29細胞總RNA，D為雙歧桿菌細胞壁蛋白刺激后的HT-29細胞總RNA；
圖5是利用RT-PCR檢測雙歧桿菌、雙歧桿菌細胞壁、雙歧桿菌細胞壁蛋白誘導(dǎo)人腸腺上皮細胞人β-防御素-2(hBD-2)基因表達的實驗結(jié)果圖，圖中，A為陰性對照hBD-2mRNA的表達，B為雙歧桿菌刺激后hBD-2mRNA的表達，C為雙歧桿菌細胞壁刺激后hBD-2mRNA的表達，D為雙歧桿菌細胞壁蛋白刺激后hBD-2mRNA的表達，E為陽性對照IL-1β刺激組誘導(dǎo)hBD-2mRNA的表達；圖6是是利用Northern技術(shù)檢測雙歧桿菌、雙歧桿菌細胞壁、雙歧桿菌細胞壁蛋白誘導(dǎo)人腸腺上皮細胞人β-防御素-2(hBD-2)mRNA的實驗結(jié)果圖，圖中，A為陰性對照HT-29細胞總RNA，B為雙歧桿菌刺激后的HT-29細胞總RNA，C為雙歧桿菌細胞壁刺激后的HT-29細胞總RNA，D為雙歧桿菌細胞壁蛋白刺激后的HT-29細胞總RNA，E為陽性對照IL-1β后的HT-29細胞總RNA；圖7是利用RT-PCR檢測雙歧桿菌、雙歧桿菌細胞壁、雙歧桿菌細胞壁蛋白誘導(dǎo)人腸腺上皮細胞LL-37/CAP18基因表達的實驗結(jié)果圖，圖中，A為陰性對照無LL-37/CAP18mRNA的表達，B為雙歧桿菌刺激后LL-37/CAP18mRNA的表達，C為雙歧桿菌細胞壁刺激后LL-37/CAP18mRNA的表達，D為雙歧桿菌細胞壁蛋白刺激后LL-37/CAP18AmRNA的表達。
五具體實施例方式
1、細胞株和菌株人腸腺上皮細胞株HT-29來源于ATCC，由申請人的感染免疫研究室保存，雙歧桿菌(長雙歧B.longum NQ-1501)由申請人在四川大學華西醫(yī)學中心口腔醫(yī)學院微生物室培養(yǎng)，并經(jīng)中國藥品生物制品鑒定所及中國預(yù)防科學院流行病學微生物學研究所鑒定。接種于MRS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48小時。
配制MRS培養(yǎng)基(1升)蛋白多胨10g、酵母粉5g、胰蛋白胨3g、葡萄糖10g、可溶性淀粉0.5g、硫酸亞鐵100mg、硫酸錳6.74mg、硫酸鎂200mg、半胱氨酸0.5g、磷酸二氫鉀1g、磷酸氫二鉀1g、氯化鈉100mg、乙酸鈉5g、檸檬酸三鈉2g、吐溫-801.0g，加蒸餾水至1升，調(diào)節(jié)pH為7.2，高溫、高壓、滅菌。
2.試劑瓊脂糖、二步法RT-PCR試劑盒、DNA分子量標準物為Takara公司產(chǎn)品。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、地高辛標記與檢測試劑盒等為Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品。RNA提取試劑(TRIZOL)為Invitrogen公司產(chǎn)品。SDS-OutTMSodium Dodecyl SulfatePrecipitation Kit Reagent和BCA Protein Assay Kit試劑盒為PIERCE公司，重組IL-1β購自PeproTech EC.Ltd.公司。其余為國產(chǎn)分析純。
3、引物根據(jù)基因庫人β-防御素-1cDNA序列設(shè)計特異引物，NM_005218.R1ACT TCCTAC CTT CTG CTG TT R2CTG CGT CAT TTC TTC TGG，擴增片段長度為230堿基。β-防御素-2cDNA序列設(shè)計特異引物，登錄號為(NM_004942.2)。R15’TGA TGCCTC TTC CAG GTG TT3’，R25’GAT GAG GGA GCC CTT TCT GA3’，擴增片段長度為205堿基。LL-37/CAP18cDNA序列(登錄號為X96735)設(shè)計特異引物，F(xiàn)1 5’-3’AAC GGA TCC TTT GCC CTG CTG；F2 5’-3’CCA GGA TCC GGC ACA CAC TAG。擴增片段長度為114堿基。同時設(shè)計人β-actin引物為內(nèi)參照，R15’GCG GGA AATCGT GCG TGA CAT T3’，R25’GAT GGA GTT GAA GGT AGT TTC GTG3’，擴增片段長度為231堿基。
4、雙歧桿菌有效成分的制備(1)細菌刺激物的制備培養(yǎng)雙歧桿菌，8000×g，10分鐘離心沉淀收集，0.02mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)洗滌3次。凍干后稱取10mg，懸浮于1ml磷酸緩沖液中，達到109個/ml菌數(shù)，沸水煮浴5分鐘。
(2)雙歧桿菌細胞壁組分的制備稱取凍干的雙歧桿菌500mg，溶于5ml裂解液(0.02mol/L磷酸緩沖液pH7.4，0.025％PMSF)中，20,000赫茲超聲處理2分鐘，15次，每次間隔1分鐘。2000×g離心5分鐘，取上清，然后55,000×g離心30分鐘，取沉淀，溶于0.02mol/L的磷酸緩沖液中，獲得細胞壁組分。
(3)雙歧桿菌細胞壁蛋白組分的制備將細胞壁組分溶于含2％SDS的PBS緩沖液，室溫下孵育30分鐘，55,000×g離心30分鐘，取上清，透析3天，按SDS-OutTMSodium Dodecyl Sulfate Precipitation Kit的操作程序除去SDS，把除去SDS前后的細胞壁蛋白質(zhì)進行變性(SDS)不連續(xù)凝膠電泳，檢測蛋白條帶，表明細胞壁蛋白為分子量約15kDa～100kDa的混合蛋白質(zhì)分子，同時用BCA Protein Assay Kit試劑盒進行蛋白定量測定，并把可溶性蛋白經(jīng)真空冷凍干燥后，-200℃保存。從圖1可以看出，除去SDS前的細胞壁蛋白質(zhì)(A)與除去SDS后的細胞壁蛋白質(zhì)(B)無明顯差別，表明蛋白質(zhì)提取方法可行。
5、人腸腺上皮細胞HT-29細胞培養(yǎng)刺激實驗參照Ming Zhang等方法做貼壁培養(yǎng)細胞的刺激實驗。取3×105HT-29細胞接種于六孔板，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2-3天，當細胞長到106，用于刺激實驗。棄培養(yǎng)液，用RPMI1640洗去未貼壁細胞，加入冷的PBS，4℃孵育20min洗滌后，加入2ml無血清RPMI1640培養(yǎng)基以及雙歧桿菌、雙歧桿菌細胞壁、雙歧桿菌細胞壁蛋白進行刺激實驗。雙歧桿菌為106個/ml，雙歧桿菌細胞壁為100μg/ml，雙歧桿菌胞壁蛋白質(zhì)刺激濃度為50μg/ml。設(shè)20ng/ml的IL-1β為陽性對照，未受刺激的細胞為陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)8個小時。刺激實驗重復(fù)3次。
6、培養(yǎng)細胞的總RNA提取及RT-PCR貼壁細胞總RNA的提取按TRIZOL RNA純化試劑盒操作說明進行。經(jīng)紫外分光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量及定量，各組間無明顯差異(見圖2)。RT-PCR條件是第一步反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，1μl細胞總RAN，反應(yīng)終體積20μl，55℃ 30min，95℃5min使mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。第二步PCR反應(yīng)，50μl反應(yīng)體積，各反應(yīng)物終濃度為MgCl22.5mM，TaqTM酶2units，引物0.2μM，5μl反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物，1×的緩沖液和水，94℃預(yù)變性3min，然后進行30個PCR循環(huán)94℃ 30s，58℃ 35s，72℃ 45s，72℃繼續(xù)延伸8min。
7、Northern雜交按Boehringer Mannheim公司的“Dig DNA labeling and Detecting Kit”說明書操作，分別標記hBD-1、hBD-2和β-actin cDNA探針。以未刺激組為陰性對照，與雙歧桿菌、雙歧桿菌細胞壁、雙歧桿菌細胞壁蛋白刺激組和陽性對照IL-1β刺激組RNA同時進行甲醛-瓊脂糖電泳，轉(zhuǎn)膜，固定，預(yù)雜交，雜交，最后經(jīng)NBT/BCIP顯色。
8、實驗結(jié)果(1)關(guān)于誘導(dǎo)人腸腺上皮細胞人β-防御素-1(hBD-1)mRNA增強表達的實驗結(jié)果人的β-防御素-1(hBD-1)對革蘭陰性細菌有強的殺菌活性，在組織中一般有低量的固有表達，在受到外源性刺激時可以表達增強，其廣泛表達于腎臟、女性生殖道、口腔粘膜、氣管、支氣管、腸道、唾液腺胰腺、肺粘膜下腺等上皮細胞以及肺泡細胞。上述RT-PCR和Northern雜交技術(shù)實驗表明雙歧桿菌可以誘導(dǎo)β-防御素-1基因表達稍微增高，而雙歧桿菌細胞壁、雙歧桿菌細胞壁蛋白誘導(dǎo)β-防御素-1表達量明顯增高，見圖3、圖4。
(2)關(guān)于誘導(dǎo)人腸腺上皮細胞人β-防御素-2(hBD-2)mRNA表達的實驗結(jié)果人的β-防御素-2(hBD-2)具有誘導(dǎo)表達的特征，主要表達于皮膚、肺、腎、肝、小腸、唾液腺、氣管、子宮等組織的表皮，能有效地殺滅革蘭陰性細菌、革蘭陽性細菌、真菌。上述RT-PCR和Northern雜交技術(shù)實驗表明雙歧桿菌可以誘導(dǎo)hBD-2基因的表達，但是誘導(dǎo)表達的量相對比較少；雙歧桿菌細胞壁可以明顯誘導(dǎo)hBD-2的表達，誘導(dǎo)的表達增高明顯；雙歧桿菌細胞壁蛋白能夠明顯誘導(dǎo)hBD-2的表達，見圖5、圖6。
(3)關(guān)于雙歧桿菌誘導(dǎo)人腸腺上皮細胞人LL-37/CAP18的實驗結(jié)果LL-37/CAP18是Cathelicidine家族中唯一存在人體內(nèi)的抗菌肽，具有廣譜抗菌活性和細胞毒性，為一線性肽，在粘膜免疫中具有重要的作用，對天然免疫與獲得性免疫均發(fā)揮作用，因此在抗生素肽開發(fā)領(lǐng)域日益受到重視。LL-37/CAP18表達方式為固有表達和誘導(dǎo)表達，在骨髓和附睪上皮為固有表達，而在人皮膚的角質(zhì)細胞和腸上皮細胞則表現(xiàn)為誘導(dǎo)表達。上述RT-PCR實驗表明雙歧桿菌本身可以誘導(dǎo)LL-37/CAP18的表達，但是誘導(dǎo)表達的量相對比較少；雙歧桿菌細胞壁可以明顯誘導(dǎo)LL-37/CAP18的表達，誘導(dǎo)的表達增高明顯；雙歧桿菌細胞壁蛋白成分，能夠明顯誘導(dǎo)LL-37/CAP18的表達，見圖7。
hBD-1、hBD-2、LL-37/CAP18編碼基因的序列鑒定本發(fā)明中的特異引物用人腸腺上皮細胞(HT-29)細胞總的RNA為模板所得到的hBD-1、hBD-2、LL-37/CAP18 RT-PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢查分別得到1條約230bp、200bp、110bp的條帶，與預(yù)計擴增片段大小相符，測序結(jié)果與Genbank登錄的hBD-2、hBD-1、LL-37/CAP18基因cDNA序列相符。
權(quán)利要求
1.雙歧桿菌細胞壁和雙歧桿菌細胞壁蛋白在制備激活哺乳動物防御素基因的藥品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所激活的哺乳動物防御素為β-防御素-1、β-防御素-2、β-防御素-3、β-防御素-4、LL-37/CAP18。
3.一種權(quán)利要求1、2所述的雙歧桿菌細胞壁蛋白的制備方法，其特征在于以雙歧桿菌細胞壁為原料，通過下述方法獲得將雙歧桿菌細胞壁溶于含1～2％SDS的磷酸緩沖液，室溫下孵育30～45分鐘，55,000～75,000×g離心30～45分鐘，取上清，透析3天，按沉淀法的操作程序除去SDS，然后在-70℃冷凍、在-112℃經(jīng)凍干機凍干濃縮。
全文摘要
本發(fā)明通過實驗證明了雙歧桿菌細胞壁和細胞壁蛋白對防御素基因是有效的活化因子，能使防御素的表達明顯增高，因此，可將雙歧桿菌細胞壁和細胞壁蛋白用于制備激活哺乳動物防御素基因的藥品，用藥方法可以通過口服、靜脈內(nèi)的注射、吸入或者栓劑、灌腸、或者口腔沖洗。根據(jù)人體中防御素的特點，此類藥物主要用于消化道、呼吸道、泌尿生殖道等感染性疾病的免疫治療。
文檔編號A61P31/00GK1433811SQ0311735
公開日2003年8月6日 申請日期2003年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月27日
發(fā)明者王伯瑤, 王國興, 黃寧, 吳琦, 汪宇輝, 馮云 申請人:四川大學