專利名稱：溶藻弧菌hsp70重組dna核酸疫苗的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)，涉及溶藻弧菌HSP70重組DNA核酸疫苗的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
病原體來源的HSP是一種非常重要的保護(hù)性抗原，免疫系統(tǒng)對這些高度保守的分子產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此，細(xì)菌HSP70可以直接作為人工免疫用抗原，也可以和其他抗原多肽偶聯(lián)或融合構(gòu)建疫苗。溶藻弧菌是海水養(yǎng)殖動物的常見致病菌。國內(nèi)尚未見有關(guān)溶藻弧菌HSP70 引起免疫反應(yīng)的研究報(bào)道，本發(fā)明運(yùn)用PCR技術(shù)克隆了溶藻弧菌HSP70基因序列，并將其正確插入到真核表達(dá)載體pcDNA3. 1中，構(gòu)建了重組DNA核酸疫苗，為進(jìn)一步研究該基因的免疫原性及免疫保護(hù)性打下了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種構(gòu)建溶藻弧菌HSP70重組DNA核酸疫苗的方法，利用其他弧菌已知序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增HSP70的ORF部分序列，再進(jìn)行TA克隆和序列測定，然后進(jìn)行 pcDNA3. 1重組DNA核酸疫苗的構(gòu)建并鑒定了構(gòu)建的成功；其步驟如下
(1)Primer Premier 5. 0 軟件設(shè)計(jì)引物
Pl 5' CCGGAATTCGTAAACCCTGACGAAGC 3'； P2 5' CCGCTCGAGCCATCCGCATCAAGGTCAAA 3'；
PCR擴(kuò)增至溶藻弧菌HSP70 ORF部分序列；反應(yīng)體系Q5 μ 1) =IOXPCR Buffer 2.5 μ 1, dNTP (2. 5 mmol/μ 1)2 μ 1，Taq 酶 0· 2 μ 1，引物 PI、Ρ2 各 0· 25 μ 1，DNA template 1 μ 1，加滅菌三蒸水至總體積25 μ 1 ;PCR反應(yīng)參數(shù)94 °C預(yù)變性3 min ；94 V 30 s，52 V 30 s, 72 V 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 °C延伸10 min ；用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產(chǎn)物，按照Omega公司Agarose Gel DNApurification Kit Ver. 2. 0介紹的方法回收純化 PCR產(chǎn)物；
(2)回收目的基因片段并與PMD18-Tfesy載體以3:1的體積比連接。連接體系Ligation Mix 5.0 μ 1，目的片段 4· 5 μ 1，PMD18-T Vec-tor 0.5 μ 1,16 °C 反應(yīng)30分鐘，需要時(shí)放入4°C冰箱保存。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)五coli DH5a，堿裂解法少量制備質(zhì)粒DNA。PCR及EcoR I和Biol I雙酶切鑒定；反應(yīng)體系ddH20 8μ L; 10Xbuffer2y L;EcoR I (15U/y L) 1 μ L; Xhol I IyL;質(zhì)粒 DNA 8yL。37°C7jC 浴 2小時(shí)。1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切結(jié)果。(3)分別用EcoR I和Xhol I雙酶切真核表達(dá)載體pcDNA3. 1和TA克隆質(zhì)粒，均在酶切體系中進(jìn)行。37°C水浴3小時(shí)后凝膠電泳回收。將酶切的質(zhì)粒用一個(gè)柱子回收，如果膠太大無法裝入一個(gè)離心管，可以分兩個(gè)管化膠，但是離心時(shí)一定要將兩管的膠加到一個(gè)柱子上。回收時(shí)一定要將酒精揮發(fā)干凈，否則影響連接效率。最后用30 40ul的Elution Buffer溶解，然后取Iul定量。跑完電泳后與MAKER比較以確定Iul中有多少ng的產(chǎn)物。 回收后的產(chǎn)物應(yīng)迅速放入_20°C保存。酶切體系為40ul質(zhì)粒加入6ul的10 X H Buffer, 4ulEC0Rl，4ulXhol，再加入 6ul 的水。(4) 1%瓊脂糖凝膠上電泳，利用大質(zhì)粒提取試劑盒切膠回收酶切后的pcDNA3. 1片段和HSP70片段，按照摩爾比1 :6的比例建立一個(gè)20ul的連接體系，體系中包含2ul m T4Ligase Buffer, 2ul T4LigaSe，然后是各1 ul目的片段和載體，用水補(bǔ)齊20ul，15°C 過夜連接。轉(zhuǎn)化DH5ci大腸埃希菌，挑單個(gè)菌落。(5) PCR初步篩選陽性克隆，堿裂解法提取質(zhì)粒，按照上述方法用EcoR I和 Xhol I酶切、測序鑒定，目的DNA片段連接、轉(zhuǎn)化正確，表明pcDNA3. 1重組DNA核酸疫苗的構(gòu)建成功。應(yīng)用實(shí)例
以本發(fā)明所構(gòu)建的溶藻弧菌HSP70重組質(zhì)粒利用陽性脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞 18-48小時(shí)后，對抗原蛋白表達(dá)情況進(jìn)行免疫熒光檢測，結(jié)果溶藻弧菌HSP70重組質(zhì)粒在寄主細(xì)胞中檢測到靶抗原的表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)該方法為HSP70免疫原性研究及相關(guān)融合疫苗的構(gòu)建提供依據(jù)， 相對容易，而成熟的DNA核酸疫苗構(gòu)建方法能夠加快和簡化發(fā)展相關(guān)HSP70新疫苗的進(jìn)展， 并可提供廣譜的DNA核酸疫苗。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明是一種構(gòu)建溶藻弧菌HSP70重組DNA核酸疫苗的方法，利用其他弧菌已知序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增HSP70的ORF部分序列，再進(jìn)行TA克隆和序列測定，然后進(jìn)行pcDNA3. 1 重組DNA核酸疫苗的構(gòu)建并鑒定構(gòu)建的成功；其步驟如下
(1)Primer Premier 5. O 軟件設(shè)計(jì)引物
Pl 5' CCGGAATTCGTAAACCCTGACGAAGC 3'； P2 5' CCGCTCGAGCCATCCGCATCAAGGTCAAA 3'；
PCR擴(kuò)增至溶藻弧菌HSP70 ORF部分序列；反應(yīng)體系Q5 μ 1) =IOXPCR Buffer 2.5 μ 1, dNTP (2. 5 mmol/μ 1)2 μ 1，Taq 酶 0· 2 μ 1，引物 PI、Ρ2 各 0· 25 μ 1，DNA template 1 μ 1，加滅菌三蒸水至總體積25 μ 1 ;PCR反應(yīng)參數(shù)94 °C預(yù)變性3 min ；94 V 30 s，52 V 30 s, 72 V 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 °C延伸10 min ；用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產(chǎn)物，按照Omega公司Agarose Gel DNApurification Kit Ver. 2. 0介紹的方法回收純化 PCR產(chǎn)物；
(2)回收目的基因片段并與PMD18-Tfesy載體以3:1的體積比連接。連接體系Ligation Mix 5.0 μ 1，目的片段 4· 5 μ 1，PMD18-T Vec-tor 0.5 μ 1,16 °C 反應(yīng)30分鐘，需要時(shí)放入4°C冰箱保存。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)五coli DH5a，堿裂解法少量制備質(zhì)粒DNA。PCR及EcoR I和Biol I雙酶切鑒定；反應(yīng)體系ddH20 8μ L; 10Xbuffer2y L;EcoR I (15U/y L) 1 μ L; Xhol I IyL;質(zhì)粒 DNA 8yL。37°C7jC 浴 2小時(shí)。1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切結(jié)果。(3)分別用EcoR I和Xhol I雙酶切真核表達(dá)載體pcDNA3. 1和TA克隆質(zhì)粒，均在酶切體系中進(jìn)行。37°C水浴3小時(shí)后凝膠電泳回收。將酶切的質(zhì)粒用一個(gè)柱子回收，如果膠太大無法裝入一個(gè)離心管，可以分兩個(gè)管化膠，但是離心時(shí)一定要將兩管的膠加到一個(gè)柱子上。回收時(shí)一定要將酒精揮發(fā)干凈，否則影響連接效率。最后用30 40ul的Elution Buffer溶解，然后取Iul定量。跑完電泳后與MAKER比較以確定Iul中有多少ng的產(chǎn)物。 回收后的產(chǎn)物應(yīng)迅速放入_20°C保存。酶切體系為40ul質(zhì)粒加入6ul的10 X H Buffer, 4ulEC0Rl，4ulXhol，再加入 6ul 的水。CN 102406948 A
說明書
3/3頁(4) 1%瓊脂糖凝膠上電泳，利用大質(zhì)粒提取試劑盒切膠回收酶切后的PCDNA3. 1 片段和HSP70片段，按照摩爾比1 :6的比例建立一個(gè)20ul的連接體系，體系中包含2ul m T4Ligase Buffer, 2ul T4LigaSe，然后是各1 ul目的片段和載體，用水補(bǔ)齊20ul，15°C 過夜連接。轉(zhuǎn)化DH5ci大腸埃希菌，挑單個(gè)菌落。(5) PCR初步篩選陽性克隆，堿裂解法提取質(zhì)粒，按照上述方法用EcoR I和 Xhol I酶切、測序鑒定，目的DNA片段連接、轉(zhuǎn)化正確，表明pcDNA3. 1重組DNA核酸疫苗的構(gòu)建成功。應(yīng)用實(shí)例
以本發(fā)明所構(gòu)建的溶藻弧菌HSP70重組質(zhì)粒利用陽性脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞 18-48小時(shí)后，對抗原蛋白表達(dá)情況進(jìn)行免疫熒光檢測，結(jié)果溶藻弧菌HSP70重組質(zhì)粒在寄主細(xì)胞中檢測到靶抗原的表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)該方法為HSP70免疫原性研究及相關(guān)融合疫苗的構(gòu)建提供依據(jù)， 相對容易，而成熟的DNA核酸疫苗構(gòu)建方法能夠加快和簡化發(fā)展相關(guān)HSP70新疫苗的進(jìn)展， 并可提供廣譜的DNA核酸疫苗。
權(quán)利要求
1. 一種溶藻弧菌HSP70重組DNA核酸疫苗的構(gòu)建方法，其特征是利用其他弧菌已知序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增HSP70的ORF部分序列，再進(jìn)行TA克隆和序列測定，然后進(jìn)行 pcDNA3. 1重組DNA核酸疫苗的構(gòu)建并鑒定構(gòu)建的成功；其步驟如下(1)PrimerPremier 5. 0 軟件設(shè)計(jì)引物Pl 5' CCGGAATTCGTAAACCCTGACGAAGC 3'；P2 5' CCGCTCGAGCCATCCGCATCAAGGTCAAA 3'；PCR擴(kuò)增至溶藻弧菌HSP70 ORF部分序列；反應(yīng)體系Q5 μ 1) =IOXPCR Buffer 2.5 μ 1, dNTP (2. 5 mmol/μ 1)2 μ 1，Taq 酶 0· 2 μ 1，引物 PI、Ρ2 各 0· 25 μ 1，DNA template 1 μ 1，加滅菌三蒸水至總體積25 μ 1 ;PCR反應(yīng)參數(shù)94 °C預(yù)變性3 min ；94 V 30 s，52 V 30 s, 72 V 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 °C延伸10 min ；用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產(chǎn)物，按照Omega公司Agarose Gel DNApurification Kit Ver. 2. 0介紹的方法回收純化 PCR產(chǎn)物；(2)回收目的基因片段并與PMD18-Tfesy載體以3 1的體積比連接；連接體系Ligation Mix 5.0 μ 1，目的片段 4· 5 μ 1，PMD18-T Vec-tor 0.5 μ 1,16 °C 反應(yīng)30分鐘，需要時(shí)放入4 °C冰箱保存；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)五coli DH5a，堿裂解法少量制備質(zhì)粒DNA ；PCR及EcoR I和Biol I雙酶切鑒定；反應(yīng)體系ddH20 8μ L; 10Xbuffer2y L;EcoR I (15U/y L) 1 μ L; Xhol I 1 μ L;質(zhì)粒 DNA 8 μ L ;37°C7jC浴 2 小時(shí)；1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切結(jié)果；(3)分別用EcoRI和Biol I雙酶切真核表達(dá)載體pcDNA3. 1和TA克隆質(zhì)粒，均在酶切體系中進(jìn)行；37°C水浴3小時(shí)后凝膠電泳回收；將酶切的質(zhì)粒用一個(gè)柱子回收；最后用 30 40ul的Elution Buffer溶解，然后取Iul定量；跑完電泳后與MAKER比較以確定Iul 中有多少ng的產(chǎn)物；回收后的產(chǎn)物應(yīng)迅速放入_20°C保存；酶切體系為在40ul質(zhì)粒加入 6ul 的 10 X H Buffer，4ulEC0Rl, 4ulXhol，再加入 6ul 的水；(4)1%瓊脂糖凝膠上電泳，利用大質(zhì)粒提取試劑盒切膠回收酶切后的pcDNA3. 1片段和HSP70片段，按照摩爾比1 :6的比例建立一個(gè)20ul的連接體系，體系中包含2ul的 T4Ligase Buffer, 2ul T4LigaSe，然后是各1 ul目的片段和載體，用水補(bǔ)齊20ul，15°C過夜連接；轉(zhuǎn)化DH5 α大腸埃希菌，挑單個(gè)菌落；(5)PCR初步篩選陽性克隆，堿裂解法提取質(zhì)粒，按照上述方法用EcoR I和B10I I 酶切、測序鑒定，目的DNA片段連接、轉(zhuǎn)化正確，表明pcDNA3. 1重組DNA核酸疫苗的構(gòu)建成功。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種構(gòu)建溶藻弧菌HSP70重組DNA核酸疫苗的方法。利用其他弧菌已知序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增了溶藻弧菌HSP70ORF部分序列，首先進(jìn)行TA克隆和序列測定，然后進(jìn)行pcDNA3.1重組DNA核酸疫苗的構(gòu)建，通過PCR、酶切及序列分析鑒定構(gòu)建的成功。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):該方法為HSP70免疫原性研究及相關(guān)融合疫苗的構(gòu)建提供依據(jù)，相對容易，而成熟的DNA核酸疫苗構(gòu)建方法能夠加快和簡化發(fā)展相關(guān)HSP70新疫苗的進(jìn)展，并可提供廣譜的DNA核酸疫苗。
文檔編號A61K39/106GK102406948SQ20111039845
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月5日
發(fā)明者萬文菊, 于愛蓮, 張忠, 楊春貴, 王紀(jì)亭, 高紅莉 申請人:泰山醫(yī)學(xué)院