專(zhuān)利名稱(chēng)：：血小板中微生物凈化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及適用于病人給藥的固定干燥血小板的制備方法，其中在制備過(guò)程中實(shí)現(xiàn)血小板的微生物凈化。本發(fā)明背景在過(guò)去的三十年中，輸血醫(yī)學(xué)中已很好地建立了血小板濃縮品的應(yīng)用。但是，血小板功能的快速損失和儲(chǔ)存過(guò)程中微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)使得保證血庫(kù)中血小板濃縮品的有效庫(kù)存變得十分復(fù)雜。在許多情況下，有限的保質(zhì)期嚴(yán)重地減少了血小板液縮品的使用。E.Klein等(J.Pediatrics49，517-522(1956))描述了凍干的血小板濃縮品的制備和應(yīng)用于急性白血病和再生障礙性貧血兒童。輸血位點(diǎn)的疼痛和venospasm被提及。這些材料的有限的效能如文中的表2所示。三十多年后，這些材料并未形成一種可用的治療方法。為了使得血庫(kù)更適應(yīng)于血小板輸血治療，已引起相當(dāng)?shù)呐d趣來(lái)設(shè)計(jì)降低或延緩在儲(chǔ)存過(guò)程中血小板功能損失的方法。一種方法為發(fā)展無(wú)血漿儲(chǔ)存介質(zhì)。見(jiàn)，例如S.Holme的美國(guó)專(zhuān)利4695460號(hào)。另一中方法為應(yīng)用生物化學(xué)技術(shù)以穩(wěn)定血小板。見(jiàn)，例如，A.Bode等的美國(guó)專(zhuān)利4994367號(hào)。雖然這些技術(shù)保證了保質(zhì)期的有效延長(zhǎng)，但并未保證保質(zhì)期延長(zhǎng)較長(zhǎng)的時(shí)間。最終，如F.Chao的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5185160中描述了從過(guò)期的血小板等制備血小板膜微泡。在Brinkhous等的美國(guó)專(zhuān)利4287087號(hào)中揭示了用于診斷分析的固定干燥血小板。雖然為了診斷的目的，這些固定干燥的血小板制品能延長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，但是它們迄今為止并未以一種人的藥物用途形式被提供。因此，仍需要新的制備具有延長(zhǎng)的保質(zhì)期并適用于病人給藥的血小板制品的方法。M.Read等(PCT申請(qǐng)WO93/23997(1993年12月9日公布))描述了固定干燥的血小板和其制備方法。本發(fā)明的概述本發(fā)明公開(kāi)了一種滅活人血小板制品中微生物污染的方法。該方法包括，首先提供懷疑被微生物(如細(xì)菌、病毒)污染的血小板，特別是人的血小板，然后將血小板與固定劑接觸一定的時(shí)間，以充分固定血小板，隨后(優(yōu)選地)洗滌和干燥，產(chǎn)生固定干燥血小板。為了殺死多數(shù)或全部污染的微生物，血小板和固定劑接觸過(guò)程應(yīng)進(jìn)行充分的時(shí)間。但是，完成接觸步驟所需的時(shí)間不足以引起血小板功能的喪失，在干燥及重配時(shí)(i)粘附于血栓組成表面；(ii)不粘附于非血栓形成表面；(iii)粘附于血栓形成表面時(shí)發(fā)生形變(擴(kuò)展)；(iv)粘附于血栓形成表面時(shí)相互粘著形成一止血栓；和(v)釋放其顆粒狀內(nèi)容物。換言之，血小板在固定后應(yīng)保持其活性。本發(fā)明的前述和其它對(duì)象及各個(gè)方面在本文下述第4部分詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的詳細(xì)描述在血液衍生的生物藥物的制備中，需要涉及可去除或滅活(例如，殺死)至少幾個(gè)log周期微生物感染的方法。不論是微生物的部分殺死(例如，殺菌或殺病毒方法)或全部殺死(例如，滅菌方法)，這一滅活可確保在最終的產(chǎn)品中不存在包括由初始材料所引入的污染在內(nèi)的外來(lái)物質(zhì)。本發(fā)明的方法可采用選自包括甲醛、多聚甲醛和戊二醛一組中的一種固定劑來(lái)進(jìn)行。使用這些固定劑需細(xì)心修改美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4287087的第4部分描述的步驟，以避免血小板活性的喪失。通常，洗滌后的血小板經(jīng)孵育加以固定，典型為室溫最多60分鐘(優(yōu)選至少30或45分鐘，短至30分鐘內(nèi)一些病毒可被滅活)，在最高為1.8％的多聚甲醛溶液(優(yōu)選為1％-2％的固定劑)中進(jìn)行。如下文更詳細(xì)的討論，必須注意充分固定血小板，否則在其干燥過(guò)程中將會(huì)發(fā)生過(guò)度裂解。另一技術(shù)為將血小板孵育于高錳酸鹽溶液(例如，高錳酸鈉，高錳酸鉀)。通常，洗滌的血小板可通過(guò)這一技術(shù)制備，在0.001到1g/dL的KMnO4或NaMnO4溶液中孵育血小板5至20分鐘，更優(yōu)選在0.005到0.5g/dL的KMnO4或NaMnO4溶液中孵育血小板5至15分鐘，最優(yōu)選在0.005到0.5g/dL的KMnO4或NaMnO4溶液中孵育血小板8至12分鐘。用于制備藥物制劑的血小板制品應(yīng)基本不含無(wú)關(guān)物質(zhì)，尤其是裂解的血小板，其將作為游離血栓形成劑呈遞給用過(guò)該制品的病人。因此，必須在干燥前小心地充分固定血小板(不破壞其活性，如上述第4部分中的特征所示)，否則在干燥步驟中將發(fā)生過(guò)度細(xì)胞裂解。例如，適用于制備人的藥物制劑的血小板制品最好為，重配為每毫升109血小板的溶液，微粒(裂解血小板所留下的碎片)少于每毫升10×106，優(yōu)選在重懸和沉淀后的上清內(nèi)少于每升150國(guó)際單位(IU)乳酸脫氫酶(每升2200IU表示1毫升中共有109個(gè)細(xì)胞裂解)。固定之后的血小板可采用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行干燥，但優(yōu)選冷凍干燥。干燥之前必須注意要穩(wěn)定血小板制品，因?yàn)榉駝t產(chǎn)生的血小板裂解水平無(wú)法接受。通過(guò)在含適當(dāng)?shù)乃〈肿?或“穩(wěn)定劑”)(如白蛋白或海藻糖)的溶液中懸浮血小板以進(jìn)行穩(wěn)定化作用，然后干燥該溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了0.1到20重量百分比的白蛋白，更優(yōu)選使用1到10重量百分比的白蛋白，更優(yōu)選使用1到5重量百分比的白蛋白。為了對(duì)一主體給藥，制品中白蛋白應(yīng)該與該主體種類(lèi)相同。另外，該制品可以與不同種類(lèi)的白蛋白干燥，重配時(shí)從血小板中分離出該白蛋白，并向重配的制品中加入相同種類(lèi)的白蛋白，以給主體給藥。但必須注意去除所有的非種美特異的白蛋白，因?yàn)樵谥委煹膶?duì)象中它們可成為抗原。本發(fā)明的藥物制劑可簡(jiǎn)單地包括在無(wú)菌包裝中的無(wú)熱源無(wú)菌的干燥(優(yōu)選冷凍干燥)血小板。如上所指明，其可含有白蛋白。藥物制劑還可包括重配于藥物學(xué)可用載體中的本發(fā)明的血小板制品?？墒褂萌魏文苤匦滤涎“?、使其具有上文所列出的特征并適于靜脈注射的水性載體(例如，滅菌的、無(wú)熱源、生理鹽水溶液)。在重配制劑中還可含有添加劑，如緩沖液、防腐劑、及其它治療活性試劑。見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4994367(其所揭示內(nèi)容作為參考被本文所引用)。本發(fā)明的重配藥物制劑可典型地經(jīng)靜脈注射對(duì)病人給藥。需要這種治療的病人包括患有血小板減少的病人(包括洗出性血小板減少)，患有出血性血小板功能異常的病人，和遭受?chē)?yán)重出血的外傷受害者。藥物制劑的使用劑量可根據(jù)病人的體重和狀況而改變，但典型的是體積從20到350毫升，濃度從每毫升1×109到3×109血小板(而更優(yōu)選從每毫升2×109到3×109血小板)變化。藥物配方可包裝在滅菌、無(wú)熱原的容器中，將這些體積和劑量作為一個(gè)單位劑量。在下列實(shí)施例中將更詳細(xì)解釋本發(fā)明。這些實(shí)施例僅以說(shuō)明為目的，并不能作為本發(fā)明的限制。實(shí)施例1固定干燥血小板的制備A凍干人血小板的制備(方法1)從加有酸性檸檬酸鹽右旋糖抗凝劑(0.085M檸檬酸三鈉，0.0702M檸檬酸，0.111M右旋糖苷，pH4.5)的血液中制備人的血小板，一份抗凝劑加5.66份血。經(jīng)差速離心分離血小板并用酸性檸檬酸鹽溶液(0.00544M檸檬酸三鈉，0.154MNaCl，用0.1NHCl調(diào)節(jié)pH為6.5)洗三次。洗滌后，經(jīng)在5.0ml1.8％多聚甲醛溶液(按9.0ml4％多聚甲醛溶液加上1.0mlACD加上10.0ml0.135MNaH2PO4制備)中室溫孵育洗過(guò)的來(lái)自100ml血的血小板45分鐘(固定時(shí)間可延長(zhǎng)至60分鐘)，來(lái)固定血小板?；蛘?，在1.0％多聚甲醛溶液中室溫孵育洗過(guò)的來(lái)自100ml血的血小板45分鐘(固定時(shí)間可延長(zhǎng)至60分鐘)。為了去除多聚甲醛，多聚甲醛孵育之后，在每個(gè)試管中加入等體積的咪唑緩沖鹽溶液(0.084M咪唑；0.146MNaCl，用0.1NHCl調(diào)節(jié)pH為6.8)，室溫1500g離心8分鐘沉淀血小板。倒掉上清并在5-10mlpH3.75的咪唑緩沖鹽溶液中重懸沉淀，以洗滌血小板。重復(fù)洗滌兩次以上，以去除多聚甲醛。第三次洗滌之后，血小板重懸于5％的血清白蛋白溶液(每100ml檸檬酸鹽溶液中5克白蛋白，0.00544M檸檬酸三鈉，0.154MNaCl，pH6.5)中。使用相差顯微鏡和美國(guó)光學(xué)Bright-Line血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)血小板計(jì)數(shù)。血小板濃度調(diào)節(jié)為每立方毫米(cmm)800,000個(gè)。一份(10ml)含在血清白蛋白溶液中濃度調(diào)節(jié)過(guò)的血小板置于20ml玻璃管中并-70℃冷凍。然后冷凍干燥血小板12小時(shí)，或直到出現(xiàn)明顯的碎的白色粉末。100到500ml的大量血小板產(chǎn)品還能進(jìn)行薄層冷凍，并于-40℃冷凍干燥4小時(shí)，然后在干燥時(shí)間里，溫度升高至-25℃。冷干制品可保存于-20℃至-70℃，直至使用。冷干的血小板用0.084M咪唑緩沖液(不加鹽)重新水合，用1.0MNaOH調(diào)節(jié)pH為7.35。加入咪唑緩沖液之后，溶液靜置幾分鐘，然后搖擺或旋轉(zhuǎn)管子輕輕混合，以產(chǎn)生一均勻的重新水合的血小板的懸液。B.凍干人血小板的制備(方法2)從健康志愿捐獻(xiàn)者得到的全血置于含標(biāo)準(zhǔn)抗凝劑(CPDA-1)組份的商業(yè)血液收集袋中。一個(gè)單位的檸檬酸鹽全血的終體積為500cc。每袋全血經(jīng)離心得到富含血小板的血漿(PRP)，其從袋中抽出并經(jīng)三次離心/在磷酸緩沖鹽溶液(與上文A中所述相同)重懸進(jìn)行洗滌。然后將洗過(guò)的血小板再離心，用含1.8％多聚甲醛的緩沖溶液(與上文A中所述相同)，于室溫處理沉淀45分鐘到1小時(shí)。經(jīng)去除穩(wěn)定化試劑及進(jìn)一步洗滌血小板去除多聚甲醛之后，血小板的產(chǎn)量為穩(wěn)定化之前的血小板懸液的60-80％。當(dāng)穩(wěn)定化之后，在洗滌緩沖液中不含有白蛋白，則血小板產(chǎn)量下降。冷凍干燥之前的最終血小板懸液的成分對(duì)于獲得適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)量是十分重要的，一般來(lái)說(shuō)，在緩沖鹽溶液中一種穩(wěn)定劑如白蛋白或海藻糖的有效劑量，對(duì)于通過(guò)冷凍干燥/重新水合步驟而得到85-100％的產(chǎn)量是必要的。應(yīng)含有的白蛋白的量從0.1到50g/dL，更優(yōu)選的量為1到25g/dL，最優(yōu)選的量為5到10g/dL。應(yīng)含有的海藻糖的量從0.1到10M，更優(yōu)選0.2到5M，最優(yōu)選0.5到1.0M。應(yīng)用多種類(lèi)型的重新水合溶液在參數(shù)結(jié)果上沒(méi)有明顯的差別磷酸緩沖鹽溶液pH＝7.3，tris-緩沖鹽溶液pH＝7.4，咪唑緩沖鹽溶液，或UNISOLTM生理平衡鹽溶液。實(shí)施例2血小板中細(xì)菌的凈化本研究的目的為證實(shí)在血小板保存過(guò)程中1.8％多聚甲醛的細(xì)菌滅活作用的動(dòng)力學(xué)。從美國(guó)紅十字會(huì)得到12袋血小板。向每個(gè)袋中注射蠟狀芽孢桿菌，以得到在所有單元中的終濃度為50克隆形成單位(CFU)/ml。來(lái)自6個(gè)袋的血小板如上實(shí)施例1方法1所述制成凍干血小板，并裝到一個(gè)血小板儲(chǔ)存袋中。其它六份樣品仍在原始的儲(chǔ)存袋中。在隨后的7天中，每天對(duì)所有的袋進(jìn)行定量細(xì)菌培養(yǎng)(兩份系列稀釋物0.1ml涂布在一血瓊脂平板上并37℃培養(yǎng)48小時(shí))，直到明顯污染。結(jié)果蠟狀芽孢桿菌在所有6份常規(guī)儲(chǔ)存單元中生長(zhǎng)，但在處理的血小板中沒(méi)有。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，6袋血小板接種了表皮葡萄球菌，濃度為50CPU/mL。每個(gè)血小板袋分成兩等份樣品。每個(gè)血小板袋的一份樣品進(jìn)行如實(shí)施例1方法1所述的固定和洗滌步驟，并裝到一個(gè)新的血小板儲(chǔ)存袋中。余下的樣品正常保存。結(jié)果未處理的樣品中，儲(chǔ)存3天可見(jiàn)表皮葡萄球菌生長(zhǎng)。以前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示以每個(gè)血小板單元50CPU/ml的終濃度接種表皮葡萄球菌將導(dǎo)致7天后在100％的單元中生長(zhǎng)。見(jiàn)，例如，M.Brecher等，輸血34，750-755(1994)。如實(shí)施例1所述的固定和洗滌步驟處理的血小板通過(guò)完整的7天觀察期后仍為無(wú)菌。實(shí)施例3血小板中病毒的凈化在本研究中，在5個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)了與1.8％多聚甲醛孵育對(duì)體現(xiàn)了廣泛的病毒特征的模型病毒的滅活作用，特別是如上實(shí)施例1所述。本研究選擇了下列病毒，它們體現(xiàn)了可反映在初始材料中潛在污染病毒的各種生物物理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1)牛腹瀉病毒(BDV，KY-22株)為40-70nm，有包膜的RNA病毒。近期對(duì)C型肝炎病毒(HCV，已知為非甲非乙型肝炎)的病毒基因組和物理特征的研究顯示，其為黃病毒家族的一員，與瘟病毒屬的關(guān)系最為緊密。因?yàn)镠CV不能體外繁殖，并且除了黑猩猩之外沒(méi)有可用于HCV感染的動(dòng)物模型，所以BDV已作為HCV的模型用于進(jìn)行驗(yàn)證研究。2)腦心肌炎病毒(EMC，EMC株)為28-30nm，無(wú)包膜，含RNA的小RNA病毒，其對(duì)多種標(biāo)準(zhǔn)的病毒滅活技術(shù)有很高的抗性。該病毒來(lái)自與甲型肝炎病毒相同的家族，并因此可用作甲型肝炎病毒的良好的模型。3)人免疫缺損病毒(HIV，HTLV-IIIB株)為80-100nm，有包膜的RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒，其為人血的潛在污染。通過(guò)體外的CEM-A合胞體分析可滴定HIV。HIV感染7-10天后，CEM-A細(xì)胞可形成易于檢測(cè)的多核細(xì)胞或合胞體。所以涉及到HIV的工作應(yīng)在QualityBiotech’sBSL-3設(shè)備中進(jìn)行。I.步驟A.材料如上所述準(zhǔn)備滅菌的初始材料(存在于檸檬酸/鹽水緩沖液的血小板)。檢測(cè)材料22℃-28℃保存。4％多聚甲醛，0.135M磷酸鈉緩沖液，ACD緩沖液，和咪唑/鹽水緩沖液室溫保存。B.毒性研究在預(yù)先的研究中，測(cè)試用于本研究的檢測(cè)材料對(duì)用于BDV滴定的指示細(xì)胞BT-1、用于EMC滴定的指示細(xì)胞VERO、用于HIV滴定的指示細(xì)胞CEM-A的毒性。對(duì)于每一種病毒下列測(cè)試樣品都進(jìn)行毒性測(cè)試1)多聚甲醛處理前的血小板溶液；2)1.8％多聚甲醛處理后的血小板溶液。在測(cè)試開(kāi)始時(shí)，1.8mL的“多聚甲醛處理前的血小板溶液”用0.2mL病毒懸浮緩沖液進(jìn)行“模擬處理”。這樣產(chǎn)生樣品PV-004、PV-006和PV-008。經(jīng)用0.7ml病毒懸浮緩沖液“模擬處理”3.3mL血小板溶液(PV-001)以制備第二份。這樣產(chǎn)生樣品PV-003、PV-005和PV-007。所有樣品經(jīng)適于各種病毒的標(biāo)準(zhǔn)滴定方法(見(jiàn)章節(jié)4.60)，以原濃度、10倍、和100倍稀釋(在EMEM-Eagle’s最低必需培養(yǎng)基中)重復(fù)測(cè)試對(duì)適當(dāng)?shù)闹甘炯?xì)胞的細(xì)胞學(xué)毒性。導(dǎo)致指示細(xì)胞的單細(xì)胞層低于50％豐度的樣品被認(rèn)為有細(xì)胞毒性。預(yù)先的毒性研究的結(jié)果表明含有多聚甲醛的樣品有明顯的毒性。因此，所提供的其它樣品含有經(jīng)多聚甲醛處理并通過(guò)離心和洗滌去除多聚甲醛后的血小板。這些樣品直接(沒(méi)有“模擬處理”)進(jìn)行如上所述的毒性測(cè)試。這樣產(chǎn)生樣品PV-032、PV-033、和PV-034。C.滅活作用研究對(duì)于每種待分析的病毒，產(chǎn)生下列測(cè)試樣品1)T起始2)T30分鐘3)T1小時(shí)4)T1.5小時(shí)5)T2小時(shí)初始材料(3.6mL含于檸檬酸/鹽水緩沖液的血小板)于25±3℃用0.4mL的高滴度病毒處理。調(diào)節(jié)這一樣品pH為6.8-7.6，并分成兩等份。一份立即于-70℃或更低冷凍，作為候補(bǔ)。剩余的一份立即應(yīng)用適當(dāng)?shù)娜缦抡鹿?jié)E中所述的病毒滴定方法進(jìn)行測(cè)試。這作為“T起始”樣品。21.6mL初始材料(含于檸檬酸/鹽水緩沖液的血小板)于25±3℃，800×g離心8分鐘，以沉淀血小板。將12.5mL4％的多聚甲醛溶液與11.5mL0.315M磷酸鈉緩沖液和1.0mLACD緩沖液混合，新鮮制備一2.0％多聚甲醛溶液。棄去檸檬酸/鹽溶液上清之后，沉淀的血小板重新懸浮于21.6mL的新鮮制備的2.0％多聚甲醛溶液。該血小板懸液用2.4mL高滴度病毒處理，使得多聚甲醛的濃度為1.8％。然后將含1.8％多聚甲醛的處理過(guò)的初始材料分成3份4mL和一份10mL，這些樣品在25±3℃的水浴中孵育。水浴的溫度(25±3℃)被監(jiān)示并記錄。在T30分鐘、T1小時(shí)和T1.5小時(shí)時(shí)間點(diǎn)(時(shí)間為±1分鐘)，取出4mL的樣品。向每個(gè)4mL份中加入4mL咪唑緩沖液。這些樣品顛倒三次，然后25±3℃，800×g離心8分鐘。倒出上清，血小板在4mL咪唑/鹽溶液緩沖液中重懸。樣品顛倒三次，然后25±3℃，800×g離心8分鐘。該洗滌步驟重復(fù)兩次以上。最后一次離心之后，用4mL咪唑/鹽溶液緩沖液重懸血小板。然后將樣品分成兩等份。一份立即于-70℃或更低冷凍，作為候補(bǔ)。剩余的一份立即應(yīng)用適當(dāng)?shù)娜缦抡鹿?jié)E中所述的病毒滴定方法進(jìn)行測(cè)試。對(duì)于BVD和EMC，0.5mL未稀釋的和稀釋的樣品加到3個(gè)孔的每一個(gè)，總量為1.5mL。對(duì)于HIV，0.2mL未稀釋的和稀釋的樣品加到4個(gè)孔的每一個(gè)(總量為0.8mL)。在T2小時(shí)時(shí)間點(diǎn)(時(shí)間為±1分鐘)，取出10mL的樣品。向每個(gè)10mL份中加入10mL咪唑緩沖液。這些樣品顛倒三次，然后25±3℃，800×g離心8分鐘。倒出上清，血小板在10mL咪唑/鹽溶液緩沖液中重懸。樣品顛倒三次，然后25±3℃，800×g離心8分鐘。該洗滌步驟重復(fù)兩次以上。最后一次離心之后，用10mL咪唑/鹽溶液緩沖液重懸血小板。然后將樣品分成兩等份。一份立即于-70℃或更低冷凍，作為候補(bǔ)。剩余的一份立即應(yīng)用適當(dāng)?shù)娜缦抡鹿?jié)E中所述的病毒滴定方法進(jìn)行測(cè)試。對(duì)于BVD和EMC，0.5mL未稀釋的和稀釋的樣品加到8個(gè)孔的每一個(gè)，總量為4mL。對(duì)于HIV，0.2mL未稀釋的和稀釋的樣品加到20個(gè)孔的每一個(gè)(總量為4mL)。如上所述所有稀釋樣品在前4個(gè)時(shí)間點(diǎn)鋪板。D.對(duì)照(1)儲(chǔ)存病毒對(duì)照對(duì)于每一種病毒，儲(chǔ)存病毒溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。(2)陰性對(duì)照每一病毒滴定所使用的細(xì)胞培養(yǎng)基作為每一個(gè)分析的陰性對(duì)照E.病毒滴定在病毒滴定的開(kāi)始，每一樣品的一份和對(duì)照用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋到終點(diǎn)(100、3倍、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8，適當(dāng))。每一稀釋度按如下所述的標(biāo)準(zhǔn)病毒滴定方法檢測(cè)每一種病毒的感染性病毒顆粒。BDV每一含BDV的樣品的稀釋度應(yīng)用牛鼻甲(BT)指示細(xì)胞按BVD空斑分析法分析感染性病毒顆粒。FMC每一含EMC的樣品的稀釋度應(yīng)用Vero指示細(xì)胞按EMC空斑分析法分析感染性病毒顆粒。HIV每一含HIV的樣品的稀釋度應(yīng)用CEM-A指示細(xì)胞按CEM-A合胞體分析法分析感染性病毒顆粒。II.結(jié)果和解釋A.有效性該實(shí)驗(yàn)是有效的。陽(yáng)性對(duì)照顯示了感染性病毒的證據(jù)，在陰性對(duì)照中沒(méi)有檢測(cè)到病毒。B.毒性研究對(duì)用于病毒滴定的BT、CEM-A和Vero指示細(xì)胞系毒性研究的結(jié)果如表1所示。洗滌多聚甲醛后能明顯降低毒性(PV-032、PV-033和PV-034)；所有的病毒研究都應(yīng)用這一洗滌步驟。表1-毒性研究結(jié)果C.滅活作用研究滅活作用研究中每一樣品和對(duì)照的病毒滴度顯示于表2至表4中。病毒滴度表示為每mL的空斑形成單位(PFU)或每mL的合胞體形成單位(SFU)。當(dāng)沒(méi)有檢測(cè)到病毒或小于每mL5PFU(SFU)時(shí)，滴度表示為≤5.0×100PFU(SFU)/mL。在CEM-A的HIV分析中，應(yīng)用了3倍稀釋度。當(dāng)在3倍稀釋度中沒(méi)有檢測(cè)到病毒或小于每mL5PFU(SFU)，并且未稀釋樣品有細(xì)胞毒性時(shí)，滴度表示為≤1.5×101PFU(SFU)/mL。從T起始樣品的Log10PFU(SFU)/mL中減去每一處理樣品的Log10PFU(SFU)/mL，計(jì)算Log10降低值。多聚甲醛病毒滅活方法可降低病毒的滴度，BDV為6.93Log10(病毒到了檢測(cè)不到的水平)，EMC為8.78Log10(病毒到了檢測(cè)不到的水平)，HIV為4.77Log10(病毒到了檢測(cè)不到的水平)。D.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)2小時(shí)的樣品進(jìn)行泊松統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以確定由使用附加孔而進(jìn)行的附加測(cè)試所導(dǎo)致的病毒滴度的改變。對(duì)于BVD和EMC，如果在使用附加孔的稀釋方案中未檢測(cè)到病毒，則滴度表示為0.58PFU/mL。對(duì)于HIV，如果在使用附加乳的稀釋方案中未檢測(cè)到病毒，則滴度表示為0.29SFU/mL。表2-牛腹瀉病毒滴度＝病毒為無(wú)法檢測(cè)水平PFU空斑形成單位NA不適用從T起始樣品(PV-009)的Log10PFU/mL中減去每一處理樣品的Log10PFU/mL，計(jì)算Log10降低值。表3-腦心肌炎病毒滴度＝病毒為無(wú)法檢測(cè)水平PFU空斑形成單位NA不適用從T起始樣品的Log10PFU/mL(PV-015)中減去每一處理樣品的Log10PFU/mL，計(jì)算Log10降低值。表4-人免疫缺陷病毒滴度</tables>＝病毒為無(wú)法檢測(cè)水平SFU合胞體形成單位NA不適用從T起始樣品的Log10SFU/mL(PV-021)中減去每一處理樣品的Log10SFU/mL，計(jì)算Log10降低值。前面的實(shí)施例為本發(fā)明的說(shuō)明，并不作為其限制。本發(fā)明由下列權(quán)利要求所限定，與權(quán)利要求相當(dāng)?shù)膬?nèi)容包括在其中。權(quán)利要求1.一種滅活人血小板制品中微生物污染的方法，該方法包括提供懷疑被微生物污染的血小板；將所述的人血小板與固定劑接觸一定的時(shí)間，以充分固定所述血小板；然后干燥所述血小板以產(chǎn)生固定干燥血小板；其中所述接觸步驟進(jìn)行充分的時(shí)間以殺死所述的微生物；并且其中所述接觸步驟所進(jìn)行的時(shí)間不足以引起所述的血小板功能的喪失，在重配時(shí)(i)粘附于血栓形成表面；(ii)不粘附于非血栓形成表面；(iii)粘附于血栓形成表面時(shí)發(fā)生形變(擴(kuò)展)；(iv)粘附于血栓形成表面時(shí)相互粘著形成一止血栓；和(v)釋放其顆粒狀內(nèi)容物。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述微生物選自細(xì)菌和病毒所組成的組。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的接觸步驟通過(guò)混合所述血小板和含所述固定劑的溶液來(lái)進(jìn)行。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的干燥步驟通過(guò)冷凍干燥來(lái)進(jìn)行。5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述固定劑選自甲醛、多聚甲醛和戊二醛所組成的組。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述固定劑為高錳酸鹽7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包括用白蛋白穩(wěn)定所述血小板的步驟。8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包括用海藻糖穩(wěn)定所述血小板的步驟。全文摘要公開(kāi)了一種滅活人血小板制品中微生物污染的方法。該方法包括,首先提供懷疑被微生物污染的血小板,特別是人的血小板,然后將血小板與固定劑(優(yōu)選將血小板和1.8%多聚甲醛溶液混合)接觸一定的時(shí)間,以充分固定血小板(優(yōu)選45分鐘到1小時(shí))。固定后,血小板被優(yōu)選地洗滌和干燥,產(chǎn)生固定干燥血小板。為了殺死多數(shù)或全部污染的微生物,血小板和固定劑接觸過(guò)程應(yīng)進(jìn)行充分的時(shí)間。文檔編號(hào)A61K35/14GK1185117SQ96194080公開(kāi)日1998年6月17日申請(qǐng)日期1996年4月9日優(yōu)先權(quán)日1995年4月19日發(fā)明者M(jìn)·S·瑞德,A·P·伯德,L·J·蘇瑪利亞申請(qǐng)人:查珀?duì)栂柋笨_來(lái)納大學(xué),東卡羅來(lái)納大學(xué),阿默爾藥物公司