專利名稱：紅藤活性部位、在制備抗炎免疫和抗衰老藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從中藥材紅藤中制備具有抗炎免疫活性和抗衰老活性的部位，及在制備抗炎免疫藥物和抗衰老藥物方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紅藤為大血藤科植物大血藤Sargentodoxa cuneata(Oliv. )Rehd. et ffils.的藤莖。具有解毒消癰、活血止痛、祛風(fēng)除濕等功效，臨床上單獨(dú)或組方用以治療跌打損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等病癥。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，紅藤主要含有酚類、有機(jī)酸、木脂素、三萜皂苷、黃酮、蒽醌等化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明紅藤提取物或化合物具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗病毒、抗 腫瘤、抗菌、抗氧化等生物活性。紅藤水煎劑在小鼠模型中表現(xiàn)出免疫抑制作用，能夠降低小鼠的吞噬指數(shù)、IgM生成量、外周血T淋巴細(xì)胞數(shù)目和T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，對(duì)小鼠的T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫均具有抑制作用(李莉，等.中國(guó)免疫學(xué)雜志.2009, 25(3)，223-224)。紅藤水煎液明顯降低大鼠滑膜基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)(付鈺，等.貴州醫(yī)藥.2009，33 (12)，1097-1099)。紅藤中的兩種酚性糖苷有明顯抑制綿羊生殖腺前列腺素合成酶的活性，并且具有明顯的抗炎活性(Sakakibara I, etal.，JP 06199885.)。紅藤作為一種常用中藥，無(wú)明顯毒副作用，臨床使用安全，適于做進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)。目前該藥材在抗炎免疫方面的研究以藥材水煎劑和個(gè)別化合物為主，尚無(wú)紅藤提取物進(jìn)一步精制至活性部位并用于制備抗炎免疫藥物的報(bào)道。紅藤提取物和活性部位在抗衰老方面的研究和應(yīng)用也未見(jiàn)報(bào)道。為了測(cè)試和評(píng)估本發(fā)明紅藤活性部位的抗炎免疫活性和抗衰老方面的應(yīng)用潛力，已使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法測(cè)試藥材各部位的生物活性。這些已知的測(cè)試方法包括二甲苯致小鼠耳腫脹測(cè)試法、角叉菜膠致大鼠足腫脹測(cè)試法，以及體內(nèi)外抗氧化模型等，結(jié)果表明選定的紅藤活性部位具有較好的抗炎免疫活性，在體內(nèi)外抗氧化模型中都有較好活性，表現(xiàn)出良好的抗衰老應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供紅藤具有抗炎免疫活性和抗衰老應(yīng)用潛力的有效部位。紅藤提取物的各部位經(jīng)過(guò)廣泛的抗炎活性篩選，確認(rèn)紅藤多糖、水溶性部位W1和紅藤50%-80%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位和水溶性部位W2具有顯著抑制二甲苯致小鼠耳腫脹和角叉菜膠致大鼠足腫脹作用，顯示出良好的抗炎免疫活性，并且在清除DPPH 自由基和還原力實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性，能夠顯著降低血清和肝臟組織中丙二醛(MDA)含量，并且增加超氧化物歧化酶(SOD)活性，表明紅藤的提取物具有良好的體內(nèi)外抗氧化作用，具有抗衰老的潛力。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及提供紅藤四種活性部位及其制備方法
紅藤多糖(HTps)及水溶性部位W1 (HTffl)的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行干燥紅藤藥材，粉碎至20目粗粉，粉末在100°C下用水回流提取兩次，每次3小時(shí)，提取液減壓濃縮后，加無(wú)水乙醇，4°C -20°C下過(guò)夜沉淀，優(yōu)選5-15°C ;3000r/min離心10_30min，優(yōu)選15-20min ;干燥沉淀部分得紅藤多糖(HTps);濃縮上清液至原體積的1/30-1/5，優(yōu)選濃縮至原體積的1/20-1/10 ;過(guò)即-20大孔吸附樹脂，先用水洗至近無(wú)色，再用2BV-10BV 80%(v/v)乙醇洗脫，優(yōu)選4BV-6BV ;流速為10-60mL/min，優(yōu)選20_30mL/min ;收集80%乙醇(v/v)洗脫液，濃縮，冷凍干燥得水溶性部位W1 (HTffl)。紅藤乙酸 乙酯部位(HTae)和水溶性部位W2(HTw2)的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行紅藤藥材粉末中加入8-12倍的50%-80%乙醇回流提取，并過(guò)濾回收乙醇。紅藤乙醇提取物用水分散，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯分級(jí)萃取，減壓濃縮回收溶劑，分別得到石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位(HTAE)、水部位。水部位濃縮至原體積的1/30-1/10，優(yōu)選濃縮至原體積的1/20-1/15 ;過(guò)即-20大孔吸附樹脂，先用水洗至近無(wú)色，再用 2BV-10BV 95%(v/v)乙醇洗脫，優(yōu)選 4BV-6BV ;流速為 10_60mL/min，優(yōu)選 20_30mL/min ;收集95%乙醇洗脫液，濃縮得水溶性部位W2 (HTff2)。本發(fā)明第二個(gè)方面涉及對(duì)所述四個(gè)部位用于制備抗炎免疫和抗衰老藥物的用途。分別觀察樣品在不同劑量下對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹、角叉菜膠致大鼠足腫脹度、角叉菜膠致大鼠足跖炎性組織中前列腺素(PGE2)和丙二醛(MDA)含量的影響。結(jié)果表明紅藤的四個(gè)活性部位均具有顯著的抗炎免疫活性，可用于制備治療炎性病癥如風(fēng)濕或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的藥物。同時(shí)在體外模型中具有顯著的抗氧化活性，并能夠顯著降低血清和肝臟組織中MDA含量，并且增加SOD活性，表明紅藤活性部位在制備抗衰老藥物方面具有良好的潛力。本發(fā)明第三個(gè)方面涉及提供紅藤活性部位與藥學(xué)上可接受的輔料組成的藥物組合物。紅藤活性部位可單獨(dú)或幾種部位組合，再進(jìn)一步與輔料組合，劑型包括片劑、膠囊、膏劑、貼劑、注射劑等。本發(fā)明所述的載體或賦形劑包括藥劑學(xué)常規(guī)應(yīng)用的載體和賦形劑，例如填充劑、粘合劑、防腐劑、矯味劑、稀釋劑、著色劑等。下面的實(shí)施例和生物活性實(shí)驗(yàn)是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，以下所列舉的實(shí)施例不以任何方式構(gòu)成限制。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I紅藤多糖(HTps)及水溶性部位W1 (HTffl)的制備取70g粉碎成20目左右的干燥紅藤莖，100°C下用8倍量純凈水回流提取兩次，每次3小時(shí)，合并提取液減壓濃縮至200mL，加無(wú)水乙醇至IOOOmL,置4°C冰箱中過(guò)夜沉淀，離心，干燥沉淀得HTPS2. Sg ;濃縮上清液，過(guò)HP-20大孔吸附樹脂，先用水洗至無(wú)糖類物質(zhì)，再用80%乙醇洗至澄清，收集80%乙醇洗脫液濃縮，冷凍干燥得HTW13. 4g。實(shí)施例2乙酸乙酯部位(HTae)和水溶性部位W2 (HI12)的制備
取80g粉碎成20目左右的干燥紅藤莖，10倍量80%乙醇在85°C下水浴回流提取兩次，每次2h，合并提取液，減壓回收乙醇。紅藤乙醇提取物用水分散，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，減壓濃縮回收溶劑，分別得到石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、水部位。水部位濃縮后經(jīng)HP-20大孔吸附樹脂，先用水洗脫至無(wú)色，再用95%乙醇洗脫至無(wú)色，收集95%乙醇洗脫液濃縮得水溶性部位W2,冷凍干燥得HTae 2. 62g，HTW25. 96g。實(shí)施例3HTPS、HTffl, HTae和HTw2對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹反應(yīng)的影響選取20±2g昆明種小鼠80只，隨機(jī)分為10組，雌雄各半，每組8只。第I組1%吐溫-80，空白對(duì)照組；第2組25mg/kg吲哚美辛，陽(yáng)性對(duì)照組 ’第3、4組HTPS高低劑量組(200mg/kg, 100mg/kg);第5、6 組HTW1 高低劑量組(200mg/kg, 100mg/kg);第7、8 組HTAE 1 低劑量組(200mg/kg, 100mg/kg);第 9、10 組HTW2 高低劑量組(200mg/kg, 100mg/kg)。各組小鼠以20mL/kg灌胃給藥Ih后，將小鼠右耳涂50 u L 二甲苯致炎，半小時(shí)后將小鼠頸椎脫 臼處死，用直徑為7_的打孔器在左右耳同一部位打下圓耳片，分析天平稱重，右耳與左耳重量之差即為腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率，腫脹度(mg) =致炎后右耳重量-左耳重量。腫脹抑制率=(對(duì)照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/對(duì)照組平均腫脹度X 100%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表I。數(shù)據(jù)表明，HTw2部位抑制小鼠耳腫脹活性最強(qiáng)。表I 二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(x±s, n = 8)
權(quán)利要求
1.紅藤多糖及水溶性部位的制備方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行干燥紅藤藥材，粉碎至20目粗粉，粉末在100°C下用水回流提取兩次，每次3小時(shí)，提取液減壓濃縮后，加無(wú)水乙醇，4°C-20°C下過(guò)夜沉淀，3000 r/min離心10-30 min,干燥沉淀部分得紅藤多糖；濃縮上清液至原體積的1/30-1/5 ;過(guò)即-20大孔吸附樹脂，先用水洗至近無(wú)色，再用2BV-10BV體積比80%的乙醇洗脫，流速為10-60 mL/min，收集體積比80%乙醇洗脫液，濃縮，冷凍干燥得水溶性部位。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅藤多糖及水溶性部位的制備方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行干燥紅藤藥材，粉碎至20目粗粉，粉末在100°C下用水回流提取兩次，每次3小時(shí)，提取液減壓濃縮后，加無(wú)水乙醇，5-15°C下過(guò)夜沉淀；3000 r/min離心15-20 min ;干燥沉淀部分得紅藤多糖；濃縮上清液至原體積的1/20-1/10 ;過(guò)即-20大孔吸附樹脂，先用水洗至近無(wú)色，再用4BV-6BV體積比80%乙醇洗脫，流速為20-30 mL/min ;收集體積比80%乙醇洗脫液，濃縮，冷凍干燥得水溶性部位。
3.紅藤乙酸乙酯部位和水溶性部位的制備方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行紅藤藥材粉末中加入8-12倍的體積比50%-80%乙醇回流提取，并過(guò)濾回收乙醇；紅藤乙醇提取物用水分散，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯分級(jí)萃取，減壓濃縮回收溶劑，分別得到石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、水部位；水部位濃縮至原體積的1/30-1/10 ;過(guò)HP-20大孔吸附樹脂，先用水洗至近無(wú)色，再用2BV-10BV體積比95%乙醇洗脫，流速為10-60mL/min ;收集95%乙醇洗脫液，濃縮得水溶性部位。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的紅藤乙酸乙酯部位和水溶性部位的制備方法，其特征在于水部位濃縮至原體積的1/20-1/15 ;過(guò)即-20大孔吸附樹脂，用4BV-6BV體積比95%乙醇洗脫，流速為 20-30 mL/min。
5.權(quán)利要求1、2、3或4所述四個(gè)部位用于制備抗炎免疫和抗衰老藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明紅藤活性部位、在制備抗炎免疫和抗衰老藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明中紅藤用水回流提取，經(jīng)乙醇沉淀得紅藤多糖和水溶性部位。紅藤50%-80%乙醇回流提取液依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯分級(jí)萃取，制得石油醚部位、二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位，剩余水相經(jīng)大孔吸附樹脂HP-20處理，得水溶性部位。經(jīng)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，四個(gè)部位對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹和角叉菜膠致大鼠足腫脹具有顯著的抑制作用，并且能夠降低足跖炎癥組織中MDA和PGE2含量。上述四種部位具有較好的體外抗氧化活性，能夠有效降低血清和肝臟組織中MDA含量，增強(qiáng)SOD活性。因此可以用于制備抗炎免疫藥物和抗衰老藥物。
文檔編號(hào)A61P39/06GK102697822SQ20121018078
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月4日
發(fā)明者于小鳳, 張蓉, 徐秀泉, 歐陽(yáng)臻, 湯建, 許輝, 趙神洲, 聞崇煒, 馬瑞麗 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)