專利名稱：用免疫調(diào)節(jié)性非內(nèi)源性促孕激素化合物預(yù)防流產(chǎn)的制作方法
在所有可臨床鑒別的妊娠中，15％會發(fā)生自發(fā)性流產(chǎn)(流產(chǎn))。世界衛(wèi)生組織(WHO，1977)對自發(fā)性流產(chǎn)的定義為“從母體娩出或取出重量等于或小于500g的胚胎或胎兒”。自發(fā)性流產(chǎn)是妊娠最常見的并發(fā)癥。50-60％的自發(fā)妊娠失敗可以用胎兒染色體異常、感染性病因或母體內(nèi)分泌學(xué)或解剖學(xué)共發(fā)病來解釋。但仍有40-50％的自發(fā)妊娠失敗“原因不明”。
在原因不明的妊娠失敗的病例中，最實用且最有療效的治療干預(yù)方法是施用去氫孕酮(Duphaston)。去氫孕酮是口服的活性孕酮(＝非內(nèi)源性促孕激素化合物)。近年來，一些臨床實驗顯示了去氫孕酮在治療習(xí)慣性和先兆流產(chǎn)上的功效。目前已經(jīng)在超過90個國家中使用Duphaston，并且已有超過2千6百萬名患者年的累積暴露該藥物。大約7百萬經(jīng)去氫孕酮治療的患者很可能或已被證實在子宮內(nèi)具有藥物。
直至近年來，“原因不明的病例”的復(fù)發(fā)性妊娠失敗仍被認為是一種由于非接受性、不協(xié)調(diào)性子宮內(nèi)膜所致的植入失敗。由于黃體生成孕酮的不足所導(dǎo)致的黃體期缺陷原先被認為是對其它原因不明的不孕病例的病因解釋。去氫孕酮對自發(fā)或習(xí)慣性流產(chǎn)高風(fēng)險女性的有益影響因此被認為是對內(nèi)源性孕酮缺乏的簡單代償。因此，現(xiàn)在通常僅在妊娠得到醫(yī)學(xué)鑒別后施用去氫孕酮和其它孕酮，即所述藥物的施用通常僅開始于受精后三或四周。
近年來，不斷積累的證據(jù)已經(jīng)表明內(nèi)源性孕酮可能在成功妊娠早期對建立有效免疫應(yīng)答發(fā)揮重要作用。由于親本遺傳的因素，胎兒-胎盤部分相當于半同種異體移植物。妊娠的免疫識別和隨后母體免疫系統(tǒng)的活化是成功妊娠所必需的。在足量孕酮作用下，例如胎盤細胞和脫落的CD56+細胞中的活化淋巴細胞能合成孕酮誘導(dǎo)的封閉因子(PIBF)，該因子是具有實質(zhì)性抗流產(chǎn)活性的遞質(zhì)。PIBF改變了經(jīng)活化的淋巴細胞的細胞因子分泌模式。非炎性、非細胞毒性白細胞介素(例如，IL-3，IL-4，IL-10)的生成增加，而前炎性、細胞毒性細胞因子(例如，IFN-γ、TNFα、IL-2)降低。PIBF能通過阻斷自然殺傷細胞(natural killer(NK)cell)的脫粒和穿孔素釋放而抑制自然殺傷細胞的細胞毒性。其還能抑制由IFN-γ、TNFα和IL-2介導(dǎo)的NK細胞轉(zhuǎn)化為毒性淋巴因子激活的殺傷(LAK)細胞。
已知T輔助細胞(Thelper cells)(＝Th細胞)作為人類細胞免疫系統(tǒng)的基本組成，還在免疫疾病狀態(tài)中發(fā)揮極其重要作用。Th細胞可分化為兩種誘導(dǎo)不同效應(yīng)物應(yīng)答類型的不同的極化形式，即Th1細胞和Th2細胞。Th細胞能生成并釋放(分泌)細胞因子。免疫系統(tǒng)內(nèi)的信息處理很大程度上要依賴于細胞因子的生成并釋放。
細胞因子可根據(jù)其對免疫應(yīng)答的影響而被分為兩類。由Th1細胞分泌的Th1細胞因子(例如腫瘤壞死因子(＝TNF)α，干擾素-(＝IFN)γ，白細胞介素(＝IL)-2，IL-12，IL-18)，該因子誘導(dǎo)某些細胞介導(dǎo)的細胞毒性和炎性反應(yīng)。因此細胞因子釋放所構(gòu)成的細胞毒性和炎性模式在Th1免疫應(yīng)答模式中占主導(dǎo)地位。由Th2細胞分泌的Th2細胞因子(例如，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-13)，與B細胞抗體的生成有關(guān)。Th2細胞因子下調(diào)Th1型反應(yīng)。因此細胞因子抗炎模式在Th2主導(dǎo)的免疫應(yīng)答模式中占主導(dǎo)地位。
已知特定的免疫疾病狀態(tài)與特定的病理免疫應(yīng)答模式(一般指“Th1免疫應(yīng)答模式”)相關(guān)。所述免疫疾病狀態(tài)為，例如自身免疫病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化癥或組織和/或骨髓移植后的急性排斥反應(yīng)狀態(tài)。已知，胎盤中的活化淋巴細胞和外周血中的外周血單核細胞(＝PBMC)以免疫調(diào)節(jié)的，即抗流產(chǎn)的方式進行反應(yīng)。非炎性、非細胞毒性白細胞介素(例如，IL-3，IL-4，IL-10；“Th2模式”)的生成增加，而前炎性、細胞毒性細胞因子(例如，IFN-γ，TNFα，IL-2，“Th1模式”)降低。例如，在成功的妊娠中，正常的模式為Th2-型免疫，而移向Th1-主導(dǎo)被認為與原因不明的習(xí)慣性流產(chǎn)有關(guān)。
已知孕酮能抑制復(fù)發(fā)性妊娠失敗的女性滋養(yǎng)細胞的體外胚毒性Th1細胞因子的生成(參見B.C.Choi，K.Polgar，L.Xiao，J.A.Hill，Human Reproduction15/1(2000)46-59)。因此孕酮量可能在體外誘導(dǎo)了從Th1免疫應(yīng)答模式向Th2免疫應(yīng)答模式的轉(zhuǎn)移。
但是，孕酮并非高選擇性內(nèi)源性遞質(zhì)。例如孕酮，除結(jié)合人類孕酮受體外，還已知與糖皮質(zhì)激素競爭糖皮質(zhì)激素受體。此外，孕酮目前的代謝物(例如12α-羥基孕酮、雄甾烯二酮、睪酮、脫氧皮質(zhì)酮、11-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、皮質(zhì)醇、18-羥基皮質(zhì)酮和醛甾酮)具有多種十分不同的活性。特別是，皮質(zhì)類固醇代謝物對免疫系統(tǒng)具有很強的影響。這些皮質(zhì)激素是一類能夠影響糖類代謝(糖異生、肝糖原積累、血糖升高)的類固醇，其抑制促腎上腺皮質(zhì)激素分泌且甚至具有可觀的抗炎性活性。其還在脂肪和蛋白質(zhì)代謝、保持動脈血壓、結(jié)締組織的改造以應(yīng)答損傷、降低循環(huán)淋巴細胞數(shù)量、以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能中發(fā)揮作用。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，去氫孕酮能夠通過以下方式影響Th1主導(dǎo)的免疫應(yīng)答模式，所述方式為Th2免疫應(yīng)答以更強的影響而占優(yōu)，并由此去氫孕酮顯示出對于特征為Th1主導(dǎo)的免疫應(yīng)答模式的免疫疾病狀態(tài)具有有益的影響。
去氫孕酮是一種口服活性孕酮，其分子結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性孕酮相似，但與孕酮不同的是，其可作為高選擇性孕酮受體激動劑。此外，已知去氫孕酮的代謝物或者也是人類孕酮受體的選擇性激動劑，或者不具備活性。因此可推出任何被去氫孕酮觸發(fā)的生理效應(yīng)通常借助孕酮受體介導(dǎo)。因此，去氫孕酮以其對于特征為Th1主導(dǎo)的免疫應(yīng)答模式的免疫疾病狀態(tài)具有有益效應(yīng)作為人類孕酮受體激動劑的所有非內(nèi)源性促孕激素化合物類的實例。由于根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)鑒定了所述非內(nèi)源性促孕激素化合物在妊娠中所起的免疫作用，就非常需要不僅從醫(yī)學(xué)鑒別出妊娠或甚至更遲的時日開始，還應(yīng)早至從排卵時就開始將所述非內(nèi)源促孕激素化合物施用給女性患者。對高風(fēng)險地面臨自發(fā)或習(xí)慣性流產(chǎn)的女性患者早期施用根據(jù)本發(fā)明的所述非內(nèi)源性促孕激素化合物具有特別的好處。
因此本發(fā)明的目的是提供治療或預(yù)防自發(fā)或習(xí)慣性流產(chǎn)的方法，所述方法包括從排卵時起，對需要所述治療的女性患者施以有效量的至少一種非內(nèi)源性促孕激素化合物。
在本發(fā)明的一個特定方面，還提供了通過鑒別以病理性Th1主導(dǎo)的免疫應(yīng)答模式應(yīng)答適宜刺激的女性個體而預(yù)選擇合適的高風(fēng)險地面臨自發(fā)或習(xí)慣性流產(chǎn)的女性患者。所述適宜刺激優(yōu)選為有絲分裂原誘導(dǎo)的刺激。
在本發(fā)明的另一個特定方面，鑒別所述女性個體的方法包括如下步驟a)從所述女性個體中獲取外周血單核細胞(＝PBMC)，b)用提取自滋養(yǎng)層的蛋白質(zhì)培養(yǎng)所述PBMC，c)測定所得PBMC培養(yǎng)物的上清液中Th1和Th2細胞因子的濃度和d)計算各女性個體的Th1/Th2細胞因子比率。
適用的能作為人類孕酮受體激動劑的非內(nèi)源性促孕激素化合物優(yōu)選為非雄性激素的、非內(nèi)源性促孕激素化合物，其典型實例選自如下化合物去氧孕烯、二甲炔睪酮、去氫孕酮、炔諾醇或雙醋炔諾醇、依托孕烯、孕二烯酮、羥基孕酮或己酸羥基孕酮、地索高諾酮、利奈孕酮、美屈孕酮、甲羥孕酮或醋酸甲羥孕酮、甲地孕酮或醋酸甲地孕酮、nestorone、諾美孕酮或醋酸諾美孕酮、諾孕酯、異炔諾酮、諾孕烯酮、普美孕酮、奎孕醇或醋酸奎孕醇和三甲孕酮。
去氫孕酮是針對人類孕酮受體的高選擇性激動劑，而某些其它所引用的孕酮中表現(xiàn)至少部分副反應(yīng)如雄激素/抗雄激素效應(yīng)、雌激素/抗雌激素效應(yīng)、糖皮質(zhì)激素/抗糖皮質(zhì)激素效應(yīng)和/或鹽皮質(zhì)激素/抗鹽皮質(zhì)激素效應(yīng)。另外，與大量其它合成孕酮不同，去氫孕酮在母體內(nèi)的不會產(chǎn)生雄激素效應(yīng)(例如，多毛、聲音改變、痤瘡等)，且不會產(chǎn)生使女性胎兒發(fā)生雄性化的效應(yīng)。因此去氫孕酮優(yōu)選作為非內(nèi)源性促孕激素化合物。
女性根據(jù)已知方法可以確定其排卵期。從受精時起即按醫(yī)囑開始治療也能產(chǎn)生良好的效果，但優(yōu)選從排卵時即開始治療。
下述藥理學(xué)實驗中顯示了根據(jù)本發(fā)明的非內(nèi)源性促孕激素化合物，特別是去氫孕酮，作用于Th1主導(dǎo)的免疫應(yīng)答的效果。
藥理學(xué)實驗方法建立起去氫孕酮作用于有絲分裂原刺激的外周血單核細胞(＝PBMC)所產(chǎn)生的Th1和Th2細胞因子模式的效果。在來自原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)的女性的外周血淋巴細胞中檢測去氫孕酮作用于Th1和Th2細胞因子生成的效果。于存在以及不存在去氫孕酮的情況下，用有絲分裂原(植物血凝素)體外刺激外周血單核細胞。培養(yǎng)96小時后測定分泌的細胞因子水平。去氫孕酮強烈抑制了Th1細胞因子IFN-γ的生成，而提高了IL-4和IL-6的水平。
針對妊娠期間女性中細胞因子模式的偏向已經(jīng)進行了一些實驗。通過在外周T細胞中的改變、通過由外周淋巴細胞生成的細胞因子和由細胞因子在母嬰界面的改變表明妊娠與移向Th2的偏向相關(guān)。原因不明的復(fù)發(fā)性自發(fā)妊娠流產(chǎn)(URSA)看上去與向Th1細胞因子的強偏向有關(guān)。前期診斷為URSA的女性因此可被認為是預(yù)選擇患者組，其通過顯示Th1主導(dǎo)模式的免疫應(yīng)答而典型地應(yīng)答免疫刺激。因此采用合適的URSA組實施藥理學(xué)實驗，所述合適的URSA組包括被確認自發(fā)妊娠流產(chǎn)的女性(i)測試前至少發(fā)生2次不明原因流產(chǎn)的女性，(ii)正處在至少第三次流產(chǎn)中的女性和(iii)已經(jīng)做過完整檢查的女性。
測試了54名正常妊娠女性(之前至少3次正常妊娠)和23名原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)史的女性(URSA組)中習(xí)慣性流產(chǎn)和細胞因子生成應(yīng)答之間的關(guān)系。
外周血單核細胞(PBMC)的有絲分裂原誘導(dǎo)的刺激于流產(chǎn)日從流產(chǎn)組中采用靜脈穿刺獲得外周血。通過Ficoll-paque(Pharmacia Biotech，Sweden)密度梯度離心分離PBMC，在包含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基(＝″Roswell Park Memorial Institute″-培養(yǎng)基；獲自GIBCO/BRL，USA)中形成懸液，等分加于96孔組織培養(yǎng)板上，細胞密度為100000細胞每孔，然后用濃度為5mg/ml的有絲分裂原-植物血凝素(＝PHA，Sigma Chemicals，USA)刺激96小時，和用自體同源胎盤抗原或用滋養(yǎng)細胞抗原。按下述不同的組合加入孕酮、去氫孕酮(Duphaston)和RU486(＝米非司酮)。以10-3ml/L、10-5ml/L和10-7ml/L的濃度測定孕酮。以等當量濃度測定RU486。于96小時收集培養(yǎng)基上清液，用以檢測PBMC向上清液中分泌的細胞因子的水平。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(＝ELISA)測定上清液中的細胞因子水平。
實驗樣品的記錄每一樣品均按下述方法進行實驗PBMC+有絲分裂原PBMC+有絲分裂原+孕酮PBMC+有絲分裂原+孕酮+RU486PBMC+有絲分裂原+去氫孕酮PBMC+有絲分裂原+去氫孕酮+RU486PBMC+有絲分裂原+載體PBMC+有絲分裂原+載體+RU486采用ELISA測定細胞因子水平使用獲自Immunotech SA，F(xiàn)rance的試劑盒實施ELISA來測定這些樣品中的Th1細胞因子TNF-α和IFN-γ，以及Th2細胞因子IL-4、IL-6和IL-10。這包括“夾心ELISA(sandwich ELISA)”簡而言之，第一個步驟導(dǎo)致通過結(jié)合在微量滴定板的孔上的單克隆抗細胞因子抗體捕捉相關(guān)細胞因子。在第二個步驟中，加入第二種生物素化的單克隆抗體與鏈霉抗生物素-酶(過氧化物酶或堿性磷酸酶)綴合物。生物素化抗體與固相抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合，并依次，結(jié)合綴合物。在誘導(dǎo)后，沖洗孔，并借助生物素結(jié)合鏈霉抗生物素-酶，然后加入顯色底物。所產(chǎn)生的著色強度與樣品中的細胞因子的濃度成正比。使用重組細胞因子作為參照，繪制每一細胞因子的標準曲線，然后從這些曲線中讀取結(jié)果。每個實驗的敏感性均為5pg/ml TNF-a，0.08IU/ml IFN-γ，5pg/ml IL-4和5pg/ml IL-10。通過各個樣品的T-檢驗分析結(jié)果。
細胞因子水平在正常妊娠妊娠女性和習(xí)慣性流產(chǎn)的女性之間具有顯著性差異。正常妊娠女性顯示出較高Th2偏向，而有習(xí)慣性流產(chǎn)史的女性顯示出向Th1反應(yīng)活性的偏向。根據(jù)上述藥理學(xué)測試報道的離體實驗的結(jié)果顯示了對自發(fā)妊娠流產(chǎn)女性和習(xí)慣性流產(chǎn)的女性施用去氫孕酮(Duphaston)降低了淋巴細胞活性，導(dǎo)致Th1向Th2的偏向(IFN-γ的降低和白細胞介素4和6的顯著增加可作為證據(jù))，并且孕酮釋放的增加誘導(dǎo)了阻遏因子(PIBF)(一種34kDA的蛋白質(zhì))。PIBF是隨后的免疫應(yīng)答中的分子遞質(zhì)。
上述藥理學(xué)測試方法的結(jié)果也能在使用妊娠小鼠的體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ椭械靡宰C實。在鼠緊張誘發(fā)流產(chǎn)模型中，顯示了Th1向Th2細胞因子生成的遷移。對5日孕齡的妊娠小鼠施加超聲。該緊張將這些小鼠的流產(chǎn)率從約12％增加至44％。用脫氫孕治療后，以劑量相關(guān)性模式將流產(chǎn)降低至5％。所述治療導(dǎo)致了IL-4水平的增加。
根據(jù)本發(fā)明的非內(nèi)源性促孕激素化合物可以常規(guī)藥物制劑進行施用。使用劑量可按個體而改變，并通常根據(jù)欲治療的疾病類型以及所使用的活性物質(zhì)的性質(zhì)而改變。但是大體上，用于施用于人類和大型哺乳動物時的適用藥物劑型為2，5～100mg/每個體每日，特別是在當由于去氫孕酮良好的耐受性和安全性而用作非內(nèi)源性促孕激素化合物時。通常每日個體劑量含有非內(nèi)源性促孕激素化合物5～60mg。
優(yōu)選口服所述化合物，但也可以借助其它通常用于激素替代療法中的傳統(tǒng)途徑進行給藥，例如，陰道內(nèi)的或經(jīng)皮的途徑?；衔锟陕?lián)合常規(guī)藥物輔助劑和/或載體而被制成固體或液體的藥物制劑。固體制劑的實例為能口服給藥的制劑，如片劑、包衣片劑、膠囊、粉劑或粒劑、或可選擇的栓劑。這些制劑可包含常規(guī)藥物無機和/或有機載體，如滑石粉、乳糖或淀粉，還包含常規(guī)藥物輔助劑，例如潤滑劑或片劑崩解劑。液體制劑如所述活性物質(zhì)的懸液或乳劑可包含常用的稀釋劑，如水、油和/或懸濁劑如聚乙二醇等。也可以加入其它輔助劑，如防腐劑、調(diào)味劑等。
可按照已知的方法將所述活性物質(zhì)與藥物輔助劑和/或載體混合并進行配制。為制備固體藥物劑型，例如可將所述活性物質(zhì)與輔助劑和/或載體按常規(guī)方法混合，并可進行濕性或干燥顆粒化。顆粒或粉末可按照常規(guī)方法直接注入膠囊或壓制入片劑核。如有需要，可按照已知方法對其包衣。
適用的藥物制劑的其它實例為用于局部和/或經(jīng)皮的遞送藥劑如凝膠劑、軟膏或皮膚貼片劑和/或用于陰道內(nèi)給藥的制劑、用于鼻內(nèi)給藥的制劑如噴霧劑或適用于注射給藥的制劑如長效注射劑或植入物。
權(quán)利要求
1.一種治療或預(yù)防自發(fā)或習(xí)慣性流產(chǎn)的方法，包括給需要進行所述治療的女性患者，從排卵開始起施用有效量的至少一種非內(nèi)源性促孕激素化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中非內(nèi)源性促孕激素化合物為非雄性激素。
3.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求中的方法，其中非內(nèi)源性促孕激素化合物選自由下列組成的組去氧孕烯、二甲炔睪酮、去氫孕酮、炔諾醇或雙醋炔諾醇、依托孕烯、孕二烯酮、羥基孕酮或己酸羥基孕酮、地索高諾酮、利奈孕酮、美屈孕酮、甲羥孕酮或醋酸甲羥孕酮、甲地孕酮或醋酸甲地孕酮、nestorone、諾美孕酮、或醋酸諾美孕酮、異炔諾酮、諾孕酯、諾孕烯酮、普美孕酮、奎孕醇或醋酸奎孕醇和三甲孕酮。
4.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求中的方法，其中非內(nèi)源性促孕激素化合物為去氫孕酮。
5.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求中的方法，包括在排卵和醫(yī)學(xué)鑒別出妊娠之間的時期內(nèi)施用至少一種非內(nèi)源性促孕激素化合物。
6.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求中的方法，還包括通過鑒別對適宜刺激以病理性Th1主導(dǎo)的免疫應(yīng)答模式應(yīng)答的女性個體而預(yù)選擇合適的高風(fēng)險地面臨自發(fā)或習(xí)慣性流產(chǎn)的女性患者。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中的方法，其中通過包括如下步驟的方法對女性個體進行鑒別a)從所述女性個體中獲取外周血單核細胞(＝PBMC)，b)用提取自滋養(yǎng)層的蛋白質(zhì)培養(yǎng)所述PBMC，c)測定所得PBMC培養(yǎng)物的上清液中Th1和Th2細胞因子的濃度以及d)計算各女性個體的Th1/Th2細胞因子比率。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7中的方法，其中適宜的刺激為有絲分裂原誘導(dǎo)的刺激。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫活性非內(nèi)源性促孕激素化合物在治療和/或預(yù)防自發(fā)或習(xí)慣性流產(chǎn)中的新用途。
文檔編號A61K31/56GK1596107SQ02823743
公開日2005年3月16日 申請日期2002年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月30日
發(fā)明者J·奧特, B·艾瑟勒 申請人:索爾瓦藥物有限公司