專利名稱：通過泡沫形成來保存的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及敏感的生物活性溶質(zhì)(例如酶、蛋白質(zhì)、病毒、血清、疫苗、脂質(zhì)體和細胞懸液)以及其懸液、乳液和分散液的保存方法。
背景技術(shù)：
生物活性物質(zhì)的長期保存對我們來說是一種獨特的挑戰(zhàn)，因為生物活性物質(zhì)是我們這個星球上最脆弱的、最易受環(huán)境影響的結(jié)構(gòu)(這是它的本質(zhì)特點)。當然，也有極少數(shù)水合物是穩(wěn)定的，它們能被分離純化并儲藏在室溫溶液中較長時間。
從商業(yè)和實踐的角度來看，以干形式儲藏生物活性物質(zhì)具有許多優(yōu)點。成功干燥的試劑、物質(zhì)和組織的重量減少，保存所需的空間減少，但是它們的保存期限卻增加。干物質(zhì)的室溫保存比低溫保存方案及其費用更經(jīng)濟。
目前生產(chǎn)干的生物活性物質(zhì)的方法主要包括噴霧干燥(參見美國專利No.5,563,318，該專利涉及噴霧干燥的一種變化方案)和流化床干燥，因為簡單的干燥方法實際上不能放大成類似工業(yè)上有用的規(guī)模。降溫保存方法可能有脫水作用，它包括冷凍干燥和/或深低溫冷凍。冷凍干燥不大適用于保存敏感的生物活性物質(zhì)，因為形成的冰晶會產(chǎn)生冷凍誘導的低溫損傷，而且成本非常高。
在生物活性物質(zhì)經(jīng)蛻變(transmute)干燥但仍可恢復生物活性形式的許多過程中，特別存在的問題始終是簡單的空氣干燥或真空干燥步驟很難放大。干燥是擴散限制型過程，因此對于超過10微升的水分含量來說，水分的除去就變得更加復雜，這是一點；而且待干燥的底物越大，其中心部份的有效干燥就越困難。干燥時間與水的擴散系數(shù)成反比，與樣品大小的平方成正比。我們總不能老是求助于噴霧干燥技術(shù)，因為該技術(shù)中的一些具有典型的高溫對柔弱的生物活性物質(zhì)有破壞作用。而且，用已知的干燥方法來制備干燥的物質(zhì)有時會產(chǎn)生稠密的、難溶的團塊，這些團塊在大規(guī)模(full-scale)商業(yè)性生物和藥物應用中不能很好地作進一步處理。
因此，需要有一種通過干燥來保存敏感生物活性物質(zhì)的可放大的方法。
發(fā)明概述為了滿足這一需求，本發(fā)明涉及一種通過從待干燥流體物質(zhì)形成穩(wěn)定泡沫來保存敏感的生物懸液和溶液的方法，這種方法既有助于流體中一種或多種生物活性底物的干燥，又有助于制得適用于進一步商業(yè)用途的易溶的干燥產(chǎn)物。穩(wěn)定的泡沫是這樣形成的除去生物活性樣品中的部分水，形成粘稠的液體，然后對濃縮的液體抽真空，使其在進一步在遠低于100℃的溫度下進行干燥的過程中引起“沸騰”。換句話說，使粘稠的生物活性物溶液或懸液受減壓作用，使溶液或懸液在沸騰過程中產(chǎn)生泡沫，在起泡過程中進一步除去水分，最終產(chǎn)生穩(wěn)定的開腔或閉腔泡沫。這些泡沫很容易通過切割、研磨或其它分隔方法來細分，而且起泡作用本身通過使液體蒸發(fā)面積或其它溶劑放散(evolutin)面積最大化而增強了水分的除去。
發(fā)明詳述本發(fā)明是一種通過從待干燥流體物質(zhì)形成穩(wěn)定泡沫來保存敏感的生物分散液、懸液和溶液的方法，這種方法既有助于干燥流體中一種或多種生物活性底物，又有助于制得適用于進一步商業(yè)用途的容易細分的干燥產(chǎn)物。穩(wěn)定的泡沫是這樣形成的除去部分水，形成粘稠液體，進一步對濃縮的液體抽真空，使其在進一步在遠低于100℃的溫度下進行干燥的過程中引起粘稠液體“沸騰”。換句話說，使粘稠的生物活性物溶液或懸液受減壓作用，使溶液或懸液在沸騰過程中產(chǎn)生泡沫，在起泡過程中進一步除去水分，最終產(chǎn)生穩(wěn)定的開腔或閉腔泡沫。這些泡沫很容易通過切割、研磨或其它分隔方法來細分，而且起泡作用本身通過使液體蒸發(fā)面積最大化而增強了水分的除去。(通常，待干燥物質(zhì)的溶劑部分是水性的，然而，應當理解本發(fā)明適用于各種類型的溶液和懸液，包括那些含有非水性溶劑或這些溶劑的混合物的溶液和懸液)。
一旦理解了本發(fā)明中干燥過程與減壓沸騰的結(jié)合，就可以看出在最簡單的實例中本發(fā)明的裝置是一種真空泵和溫度控制干燥器的新組合裝置。這一組合的其它任選特征包括測定溫度和熱流控制的傳感器，根據(jù)從這些及其它傳感器收集的數(shù)據(jù)來計算其它過程參數(shù)的微處理器等。這種裝置能夠?qū)崿F(xiàn)新的用于干燥的二維的真空和溫度的設置方案。
適用于該真空-沸騰-泡沫-形成革新方法的生物液體實際上是無限的。確實何溶液或懸液均可用本發(fā)明的真空沸騰方法來脫水，但是該方法在保存敏感的生物物質(zhì)方面有明顯的優(yōu)點(即，由于較低的干燥溫度而避免了破壞)。對于摻入了玻璃化增強劑、其它保護劑以及基本上任何類型溶劑的溶液，當它受低于大氣壓作用并在沸騰過程中產(chǎn)生泡沫時，它受的干燥作用會增強。保護劑可以包括(沒有限制)糖(包括蔗糖)、碳水化合物、多糖、水溶性聚合物、肽或蛋白質(zhì)等，只要保護劑能增強生物活性物質(zhì)經(jīng)受干燥和保存的能力，而且不干擾特定的生物活性。
在本發(fā)明的一個重要實例中，泡沫的形成包括兩個步驟(a)通過真空下沸騰使含有生物活性劑的溶液或分散液充分脫水，形成穩(wěn)定的不會被破壞的泡沫，和(b)隨后將泡沫二次干燥至泡沫穩(wěn)定并且不會在保存時被破壞。
如上所述，本發(fā)明提供了一種可改變規(guī)模的保存敏感的生物活性物質(zhì)(蛋白質(zhì)、酶、血清、疫苗、病毒、脂質(zhì)體和細胞懸液)方法，該方法采用了獨特的工程化干燥方法。采用這種方法，就可以用水或水性溶液使樣品重新水合，以使該過程逆轉(zhuǎn)并恢復成原始的生物活性。該方法適用于保存藥物、流體或?qū)嶋H上其它任何生物活性產(chǎn)物或溶質(zhì)。
在本發(fā)明的方法中，相當大量的生物活性液體(溶液或懸液)通過真空下沸騰而脫水形成了穩(wěn)定的泡沫。泡沫的形成是一個動態(tài)的過程，它取決于形成泡沫過程中溫度和真空度的改變速度，以及含有生物活性物質(zhì)的溶液或懸液的初始濃度和組成。通過加入表面活性劑或其它合成或生物聚合物，可進一步增強泡沫的穩(wěn)定性，只要那些添加劑不干擾打算轉(zhuǎn)化成干形式的溶質(zhì)的生物活性?？刹捎枚胃稍?，并任選地冷卻形成的與初始的干泡沫，以確保保存時的泡沫穩(wěn)定性。冷卻可用來將起泡物質(zhì)轉(zhuǎn)變成玻璃態(tài)。根據(jù)本發(fā)明制得的泡沫可以不經(jīng)分割而整個保存或進行細分或研磨，當要使用它們時，只需使它們重新水合以恢復它們的原始生物活性即可。
下列實施例用來描述。
實施例1使含有59.4單位活性/毫升的50％異檸檬酸甘油酯脫氫酶水溶液(購自SigmaChemical Co.)在0.1M Tris HCl緩沖液(pH=7.4)中透析5小時。在透析后，0.1MTris HCl溶液中異檸檬酸酯脫氫酶的活性為26+1.8單位/毫升。活性隨著透析時稀釋而引起的酶濃度的降低而降低。
將100微升的混合物放在1.5毫升塑料管中并在室溫下干燥進行保存，該混合物含有50微升50％(重量)的蔗糖溶液和50微升在0.1M Tris HCl緩沖液(pH7.4)中的異檸檬酸酯脫氫酶懸液。首先，使樣品在低真空度(流體靜壓P=0.2大氣壓)下干燥4小時。第二，使樣品在高真空度(P＜0.01大氣壓)下沸騰4小時。在這一步中，試管內(nèi)形成了穩(wěn)定的干泡沫。第三，使樣品在真空、室溫下，在DRIERITE上保存8天。
在保存規(guī)定天數(shù)后，用500微升水使樣品重新水合。含有干泡沫的樣品的重新水合是容易的，它可在幾秒種內(nèi)完成。通過在340nm用分光光度計測定還原NADP的能力來測定重建樣品的活性。反應混合物包括2毫升0.1M Tris HCl緩沖液，pH=7.4；10微升0.5％(重量)NADP+；10微升10mM MnSO4溶液；10微升50mM 1-異檸檬酸酯；以及10微升異檸檬酸酯脫氫酶溶液。活性為2.6±0.2單位/毫升，這意味著在室溫下干燥和隨后的保存中活性沒有損失。
實施例2將100微升的混合物放在1.5毫升塑料管中并在室溫下干燥進行保存，該混合物含有50微升50％(重量)的蔗糖溶液和50微升冰晶核細菌懸液(由GenencorInternational,Inc.提供)。首先，使樣品在低真空度(流體靜壓P=0.2大氣壓)下干燥4小時。第二，使樣品在高真空度(P＜0.01大氣壓)下沸騰4小時。在真空下沸騰后，試管內(nèi)形成了穩(wěn)定的干泡沫。第三，使樣品在真空、室溫下在DRIERITE上保存8天。在保存8天后，用500微升水使樣品重新水合。含有干泡沫的樣品的重新水合是容易的，它可在幾秒鐘內(nèi)完成。然后測定樣品的冰成核活性與對照樣品比較。我們發(fā)現(xiàn)用本發(fā)明方法保存的樣品每1000個細菌的冰成核活性與對照樣品沒有顯著區(qū)別。
盡管本發(fā)明已參照上述特定實施例和細節(jié)進行了描述，但是本發(fā)明的范圍只能取決于在附加的權(quán)利要求中所提出的陳述。
1．一種通過干燥來保存生物活性物質(zhì)的方法，方法包括下列步驟使含有生物活性劑的溶液、分散液或懸液受相應于殘余流體靜壓低于24托的真空作用，該真空度足以使所述溶液、分散液或懸液引起沸騰，從而使得所述沸騰的溶液、分散液或懸液在沸騰期間干燥產(chǎn)生物理上穩(wěn)定的泡沫。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述流體靜壓在0到7.6托之間。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在使所述溶液、分散液或懸液受高真空度作用步驟之前，通過在殘余流體靜壓高于7.6托的低真空度下從液體狀態(tài)蒸發(fā)，或從部分冷凍狀態(tài)蒸發(fā)，或用反向滲透或其它膜技術(shù)來對所述溶液、分散液或懸液脫水或濃縮，以減少施加所述高真空度必需的時間，并增加所述溶液、分散液或懸液在高真空度下沸騰之前的粘度。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過在升高溫度下對所述穩(wěn)定泡沫施加真空或干空氣中的一種來進行二次干燥。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中在二次干燥步驟后將樣品冷卻到溫度低于干泡沫的玻璃化溫度。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在施加所述高真空度之前先在所述溶液、分散液或懸液中加入表面活性劑，使在二次干燥時增加泡沫穩(wěn)定性。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述溶液、分散液或懸液含有選自糖、碳水化合物、多糖、聚合物、肽、蛋白質(zhì)及其混合物的保護劑，其中所述保護劑增強了生物活性物質(zhì)經(jīng)受干燥和保存的能力。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法還包括通過所述泡沫與合適溶劑接觸來使所述穩(wěn)定泡沫重新水合。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述重新水合是在高于重新水合前泡沫保存溫度的溫度下進行。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中重新水合前的泡沫保存溫度至少和環(huán)境溫度一樣高。
11．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述重新水合在等于或低于重新水合前泡沫保存溫度的溫度下進行。
12．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中重新水合前的泡沫保存溫度低于或等于環(huán)境溫度。
13．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述溶劑是包括低溫保護劑的水性溶液。
14．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述糖是蔗糖。
權(quán)利要求
1．一種通過干燥來保存生物活性物質(zhì)的方法，方法包括下列步驟a)對至少一種生物活性劑的溶液、分散液或懸液進行抽真空；和b)在所述抽真空期間干燥所述溶液、分散液或懸液，其中抽真空和干燥步驟的組合產(chǎn)生了含有所述生物活性劑的穩(wěn)定的泡沫。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述真空度在0到25℃飽和水蒸氣壓24托之間。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟a)之前先使含至少一種生物活性劑的所述溶液或懸液蒸發(fā)，以增加其粘度，減少抽真空時間。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟b)后還要在真空下進行二次干燥。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中在二次干燥步驟之后將樣品冷卻到溫度低于干樣品的玻璃化溫度。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述溶液或懸液中加入了至少一種表面活性劑，使在抽真空時增強泡沫形成。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述溶液或分散液含有至少一種選自糖、碳水化合物、多糖、聚合物、肽或蛋白質(zhì)的保護劑，其中所述保護劑增強了生物活性物質(zhì)經(jīng)受干燥和保存的能力。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述方法還包括步驟d)，使這樣形成的所述泡沫重新水合。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述重新水合是在高于重新水合前泡沫保存溫度的溫度下進行。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中重新水合前的泡沫保存溫度至少和環(huán)境溫度一樣高。
11．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述重新水合是在等于或低于重新水合前泡沫保存溫度的溫度下進行。
12．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中重新水合的前泡沫保存溫度低于或等于環(huán)境溫度。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中重新水合通過泡沫與濃縮的低溫保護劑組合物水溶液接觸來實現(xiàn)。
14．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述糖是蔗糖。
全文摘要
一種通過在待脫水流體物質(zhì)中形成穩(wěn)定泡沫來保存敏感的生物分散液、懸液、乳液和溶液的方法,該方法既有助于干燥流體中一種或多種生物活性底物,又有助于制備易分開的、適用于進一步商業(yè)用途的干燥產(chǎn)物。穩(wěn)定泡沫是這樣形成的:除去部分水形成粘稠液體,然后進一步對濃縮的液體抽真空使其在進一步遠低于100℃的溫度下干燥期間,并引起“沸騰”。換句話說。將減小的壓力施用于粘稠的生物活性物溶液或懸液,使溶液或懸液在沸騰時起泡,在起泡過程中進一步除去溶劑,最終產(chǎn)生穩(wěn)定的開腔或閉腔泡沫。
文檔編號A61K35/76GK1226842SQ97196422
公開日1999年8月25日 申請日期1997年7月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月15日
發(fā)明者V·布龍施泰因 申請人:環(huán)球保藏技術(shù)股份有限公司