專利名稱：ErbB受體激動(dòng)劑在制備治療缺血性腦血管病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ErbB受體激動(dòng)劑在制備治療缺血性腦血管病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腦血管病是我國人群的第三位致死因素，其中缺血性腦卒中約占75%，發(fā)病率和死亡率不斷攀升，是嚴(yán)重影響我國人民健康和國民經(jīng)濟(jì)的重大疾病。腦血管病的發(fā)病率與年齡成正相關(guān)，隨著我國人口老齡化程度加重。其發(fā)病呈上升趨勢。以腦卒中為例，我國每年發(fā)病率為150/10萬人，死亡率為120/10萬人，存活中約有75%致殘，5年復(fù)發(fā)率高達(dá) 41%，由此造成了社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)日趨加重。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，我國腦卒中的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)高居世界首位。腦缺血患者不僅要渡過急性期的各種并發(fā)癥，還有可能要面對(duì)未來長期病殘所帶來的巨大物質(zhì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，尋找有效和安全的治療藥物是生物醫(yī)學(xué)重要的目標(biāo)之一。ErbB4在大腦有豐富表達(dá)，并且有研究顯示ErbB4參與調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育和突觸可塑性。一旦與NRGl結(jié)合，ErbB4即被激活，其羧基末端的絡(luò)氨酸殘基發(fā)生磷酸化并聚集連接蛋白如Shc和GA2等，進(jìn)而激活Ras-Raf-Erk信號(hào)通路。ErbB4的胞內(nèi)區(qū)域還可以結(jié)合并激活PI3激酶和Akt。與許多受體激酶不同的是，NRGl/ErbB4信號(hào)通路還受RNA剪接的調(diào)節(jié)。 第一對(duì)被發(fā)現(xiàn)的ErbB4異構(gòu)體主要區(qū)別就是其胞內(nèi)段含或不含有一段由外顯子沈編碼的 16個(gè)氨基酸組成的片斷(分別被稱為CYT-I和CYT-2)。該片斷含有絡(luò)氨酸-X-X-甲硫氨酸構(gòu)成的一致序列，是PI3激酶結(jié)合區(qū)域。因此，CYT-I能夠激活PI3kinaSe/Akt通路，CYT-2 則不具此功能，但CYT-1/2均能激活Erk通路。有意思的是，CYT-I異構(gòu)體最近被發(fā)現(xiàn)在缺血性腦損傷大腦呈過表達(dá)。相反，CYT-2異構(gòu)體與正常對(duì)照呈現(xiàn)相似的表達(dá)水平?？紤]到 NRGl和ErbB4均是缺血性腦損傷的易感基因，這些發(fā)現(xiàn)為缺血性腦損傷病人異常的NRGl/ ErbB4信號(hào)通路和GABA活性之間的關(guān)聯(lián)提供一種解釋。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(Neuregulin-1，NRG)是一類多肽因子，由nrg21基因的編碼產(chǎn)物選擇性剪接體所組成。NRG是一種被證明具有神經(jīng)保護(hù)作用的生長因子家族成員之一。NRGs 可以與ErbB家族的ErbB3、ErbB4酪氨酸酶結(jié)合，從而形成ErbB同二聚體和雜二聚體，通常包括ErbB^，繼而激活細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)通路，產(chǎn)生一系列細(xì)胞反應(yīng)，包括增生、凋亡、遷移、 分化和黏附的活躍或抑制。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的功能受體由ErbB酪氨酸激酶受體組成，ErbB蛋白為表皮生長因子受體，包括ErbB2、ErbB3、ErbB4。在缺血性腦血管病中，以ErbB為靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在缺血性腦損傷病理情況下的保護(hù)藥物尚未見報(bào)道和專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明研究了 ErbB4激動(dòng)劑NRGl對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用，為探索缺血性腦損傷保護(hù)藥物的新型有效“靶標(biāo)”分子提供研究方向，為治療以腦神經(jīng)元病變?yōu)榛A(chǔ)的腦系疾病提供候選治療藥物。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是ErbB受體激動(dòng)劑在制備治療缺血性腦血管病的藥物中的應(yīng)用。所謂ErbB4受體激動(dòng)劑，是指神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-I (Neuregulin-I)。所述Neuregulin-I分為內(nèi)源性和外源性激動(dòng)劑兩種。外源性Neuregulin-I為人重組蛋白Neuregulin-Ibeta 2 (NRGl)，它是由61個(gè)氨基酸組成的多肽鏈。內(nèi)源性Neuregulin-I是由神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，這里所用ErbB4胞外段(aal-659, ecto_ErbB4)中和掉的部分。優(yōu)選的，所述ErbB受體激動(dòng)劑為ErbB4受體激動(dòng)劑。具體的，所述ErbB受體激動(dòng)劑用于制備治療缺血性腦損傷或缺血性腦卒中的藥物。所述ErbB受體激動(dòng)劑為人重組蛋白NRGl，其氨基酸序列如下uhlvkcaekektfcvn ggecfmvkdlsnpsrylckcpneftgdr cqnyvmasfykaeel yq，分子量為 7055 道爾頓。本發(fā)明以體內(nèi)、體外腦神經(jīng)元損傷模型為研究平臺(tái)，探索NRGl對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞損傷和實(shí)驗(yàn)性腦缺血的保護(hù)作用，同時(shí)深入研究其可能作用分子機(jī)制，充分論證了通過對(duì)缺血性腦損傷后NRGl-ErbB4關(guān)聯(lián)信號(hào)途徑的調(diào)控具有腦保護(hù)作用。因此NRGl及關(guān)聯(lián)ErbB4激動(dòng)劑研究將可能為開發(fā)保護(hù)腦神經(jīng)元細(xì)胞的新型藥物、防治缺血性腦血管疾病開辟廣闊的前景。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明揭示了 ErbB4激動(dòng)劑NRGl對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞損傷和實(shí)驗(yàn)性腦缺血的保護(hù)作用，提示缺血性腦損傷后NRGl作為腦保護(hù)藥物具有很好的應(yīng)用前景。


圖1為NRGl對(duì)OGD誘發(fā)培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞損傷的保護(hù)作用；圖2為NRGl對(duì)OGD誘導(dǎo)的小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞ErbB4核移位影響；圖3為NRGl_ErbB4信號(hào)途徑參與缺血性腦損傷病理過程(圖A中白色表示梗塞區(qū))。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1 :NRG1對(duì)OGD誘發(fā)培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞損傷的保護(hù)作用藥品與試劑高糖DMEM、高糖DMEM培養(yǎng)基購于美國GIBICO公司，NRGl購自美國Prospec公司，胎牛血清、新生小牛血清購于杭州四季青生物工程材料研究所。ErbB4兔抗一抗(Santa Cruz Biotechnology)，鼠二抗(Amersham Bioscience)，其它試劑均為國產(chǎn)和進(jìn)口分析純試齊LU細(xì)胞培養(yǎng)取用孕18天的胎鼠，無菌條件下快速取出腦置于D.Hank’ s液中，在解剖顯微鏡下分離剝除腦膜和血管，分離出大腦皮層，將皮層腦組織剪碎后置于離心管。用0. 25% (w/w)胰蛋白酶(含EDTA)37°C消化15min，用含10% (ν/ν)血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液，低速離心lOmin，棄上清。再用無血清DMEM洗2次，用Neurobasal 培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，吹打形成單細(xì)胞懸液。培養(yǎng)基內(nèi)補(bǔ)充添加2% (ν/ν)的Β27補(bǔ)充劑 (Invitrogen), 25moI/L的谷氨酰胺。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至IX IO6個(gè)/mL，接種于預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸處理過的蓋玻片、培養(yǎng)皿(35mm)，在37°C、飽和空氣濕度、含5% (v/v) CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)4 后，加入鹽酸阿糖胞苷以抑制非神經(jīng)元生長。培養(yǎng)7d用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。體外低糖缺氧(oxygen and glucose cbprive，簡稱0GD)模型構(gòu)建將單細(xì)胞懸液移入96孔板，3X103Cells/Well、37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞完全融合時(shí)加入不同處理空白對(duì)照組在正常條件下培養(yǎng)；OGD組和OGD合并NRGl組 (5nM)，每孔用預(yù)熱至 370C 的 HBSS (按如下組成配制=NaCl 8. OOg, KCl 0. 20g, CaCl2O. 14g， MgSO4. 7H20 0. 20g, Na2HPO4. H2O 0. 06g, KH2PO4O. 06g, NaHCO3O. 35g,去離子水補(bǔ)足至 IOOOmL) 清洗三次，并換入相同培養(yǎng)基，以上每組每種劑量設(shè)平行3孔，先放入缺氧密閉箱通入混合氣體(含95% ，5% CO2)約5min，然后將密閉箱放入孵箱處理他，然后收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白定量。采用原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)合缺氧缺糖條件開展NRGl對(duì)OGD誘發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究。MTT法檢測OGD 4h后NRGl對(duì)缺氧缺糖條件下細(xì)胞存活率的影響。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NRGl (3nM, 5nM, IOnM)可以有效減輕0⑶導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞死亡(圖 1A)，初步驗(yàn)證了 NRGl的神經(jīng)保護(hù)作用。此外，采用流式細(xì)胞術(shù)ANNEXIN V-FITC加碘化丙啶(PI)雙染檢測細(xì)胞凋亡率來研究NRGl的抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡作用。與上述結(jié)果一致，流式細(xì)胞儀測定的細(xì)胞凋亡率顯示OGD 4h后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率明顯增加，而NRGl (5nM)干預(yù)具有顯著的抗OGD條件下神經(jīng)元細(xì)胞凋亡作用(圖1B)。實(shí)施例2 :ErbB4在缺氧缺糖條件下的亞細(xì)胞分布變化及NRG調(diào)控藥品與試劑高糖DMEM、高糖DMEM培養(yǎng)基購于美國GIBICO公司，NRGl購自美國Prospec公司，胎牛血清、新生小牛血清購于杭州四季青生物工程材料研究所。ErbB4兔抗一抗(Santa Cruz Biotechnology)，兔二抗(Amersham Bioscience)，其它試劑均為國產(chǎn)和進(jìn)口分析純試齊LU細(xì)胞培養(yǎng)取用孕18天的胎鼠，無菌條件下快速取出腦置于D. Hank's液中，在解剖顯微鏡下分離剝除腦膜和血管，分離出大腦皮層，將皮層腦組織剪碎后置于離心管。用0. 25%胰蛋白酶(含EDTA) 37°C消化15min，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液，低速離心lOmin，棄上清。再用無血清DMEM洗2次，用Neurobasal培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，吹打形成單細(xì)胞懸液。培養(yǎng)基內(nèi)補(bǔ)充添加2%的B27補(bǔ)充劑，25moI/L的谷氨酰胺。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至IXlO6個(gè)/mL，接種于預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸處理過的蓋玻片、培養(yǎng)皿(35mm)，在 37°C、飽和空氣濕度、含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)4 后，加入鹽酸阿糖胞苷以抑制非神經(jīng)元生長。培養(yǎng)7d用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 體外低糖缺氧模型構(gòu)建 將單細(xì)胞懸液移入96孔板，3X103Cells/Well、37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞完全融合時(shí)加入不同處理空白對(duì)照組在正常條件下培養(yǎng)；OGD組和OGD合并NRGl組 (5nM)，每孔用預(yù)熱至 370C 的 HBSS (按如下組成配制=NaCl 8. 00g, KCl 0. 20g, CaCl2O. 14g，MgSO4. 7H20 0. 20g, Na2HPO4. H2O 0. 06g, KH2PO4O. 06g, NaHCO3O. 35g,去離子水補(bǔ)足至 IOOOmL)
清洗三次，并換入相同培養(yǎng)基，以上每組每種劑量設(shè)平行3孔，先放入缺氧密閉箱通入混合氣體(含95% N2，5% CO2)約5min，然后將密閉箱放入孵箱處理他，然后收集細(xì)胞進(jìn)行蛋
白定量。免疫印跡法定量檢測NRGl對(duì)OGD誘導(dǎo)原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞ErbB4再分布的影響 原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞OGD損傷后ErbB4膜蛋白表達(dá)變化定量檢測，蛋白標(biāo)本電泳、轉(zhuǎn)膜、5% 脫脂奶粉室溫封閉45分鐘。滴加ErbB4兔抗一抗(1 500)，4°C過夜。IOmM PBS洗3次各5分鐘。滴加兔抗二抗(1 2000)室溫120分鐘。IOmM PBS洗3次各5分鐘，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。對(duì)免疫印跡的條帶進(jìn)行定量分析。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞在OGD 4h后發(fā)生了明顯的形態(tài)學(xué)改變細(xì)胞皺縮、結(jié)團(tuán)、突起縮短(圖2A)。同時(shí)，OGD誘發(fā)了 ErbB4由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)入細(xì)胞核的改變(圖2)。激光共聚焦免疫熒光組織化學(xué)(圖2A)和Western Blot(圖2B)結(jié)果均提示NRGl處理可以有效抑制OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞漿ErbB4向細(xì)胞核移位。上述神經(jīng)元細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前述整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，進(jìn)一步確認(rèn)了 ErbB4在缺氧缺糖條件下的亞細(xì)胞分布變化。采用本實(shí)驗(yàn)體系，可以用于進(jìn)一步的機(jī)制研究和藥效評(píng)價(jià)。實(shí)施例3 :NRGl-ErbB4信號(hào)途徑參與缺血性腦損傷的病理過程操作方法小鼠大腦中動(dòng)脈一過性缺血再灌注模型制備雄性C57小鼠，體重22 27g。小鼠采用異氟烷氣體麻醉，固定，頸正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈。頸外動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈近心端結(jié)扎，在距頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉之前剪口，插入直徑統(tǒng)一的5-0尼龍線栓(造成腦缺血現(xiàn)象)，1. 5小時(shí)后尼龍線栓退出 (造成腦血再灌注現(xiàn)象)，皮膚縫合。實(shí)驗(yàn)分組如下假手術(shù)組、腦血管損傷模型組，腦血管損傷+NRGl治療組，每組動(dòng)物 8 只。NRGl 腦室給藥(150ng/kg ；采用ALZET MICRO-OSMOTIC PUMP)，連續(xù)給藥 3 天。 3天后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)價(jià)觀察動(dòng)物行為變化、通常動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)眼球震顫，共濟(jì)失調(diào)，運(yùn)動(dòng)障礙等一系列神經(jīng)功能損害的表現(xiàn)，按照Longa法對(duì)腦血管損傷SD大鼠行為學(xué)評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下0分無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分為不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分為向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向?qū)?cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。評(píng)分1分至3分的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于梗塞面積測定。缺血性腦損傷后梗塞面積測定實(shí)驗(yàn)用小鼠缺血1. 5小時(shí)，再灌注M小時(shí)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斷頭取腦，去掉小腦和低位腦干，用小鼠腦模冠狀切片，每片厚2mm。腦片用常規(guī)紅四氮唑(TTC)染色，用Image J軟件計(jì)算梗塞面積占百分比。預(yù)實(shí)驗(yàn)已證明NRGl 腦室給藥(150ng/kg ；采用ALZET MICRO-OSMOTIC PUMP) 可以有效減少腦梗塞灶的體積(圖3A)。定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)一步提示NRGl在野生型小鼠 (ErbB4+/+)具有腦保護(hù)作用而在ErbB4基因敲除小鼠(ErbB4+)卻未能看到；反之，腦梗塞灶的體積在ErbB4+小鼠有明顯的增加(圖3B，P < 0. 05)。上述結(jié)果提示NRGl的腦保護(hù)作用是以依存于ErbB4受體的機(jī)制完成的。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Durmett-t檢驗(yàn)。
權(quán)利要求
1.ErbB受體激動(dòng)劑在制備治療缺血性腦血管病的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述ErbB受體激動(dòng)劑為ErbB4受體激動(dòng)劑。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述ErbB受體激動(dòng)劑用于制備治療缺血性腦損傷或缺血性腦卒中的藥物。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述ErbB受體激動(dòng)劑為人重組蛋白 Neuregulin-Ibeta 2，其氨基酸序列如下:shlvkcaekektfcvnggecfmvk dlsnpsryIckcpnef tgdrcqnyvmasfykaeelyq0
全文摘要
本發(fā)明提供了ErbB受體激動(dòng)劑在制備治療缺血性腦血管病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明以體內(nèi)、體外腦神經(jīng)元損傷模型為研究平臺(tái)，探索NRG1對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞損傷和實(shí)驗(yàn)性腦缺血的保護(hù)作用，同時(shí)深入研究其可能作用分子機(jī)制，充分論證了通過對(duì)缺血性腦損傷后NRG1-ErbB4關(guān)聯(lián)信號(hào)途徑的調(diào)控具有腦保護(hù)作用。因此NRG1及關(guān)聯(lián)ErbB4激動(dòng)劑研究將可能為開發(fā)保護(hù)腦神經(jīng)元細(xì)胞的新型藥物、防治缺血性腦血管疾病開辟廣闊的前景。
文檔編號(hào)A61K38/18GK102389569SQ20111035466
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者盧應(yīng)梅, 李曉明 申請人:浙江大學(xué)