專利名稱：千斤拔總黃酮提取物及其提取方法和其藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥提取物制備方法及其藥物用途，具體涉及千斤拔總黃酮提取物及其提取方法和其藥物用途。
背景技術(shù)：
千斤拔隸屬于豆科(Leguminosac)蝶形花亞科(Papilionoideae),在我國廣泛分布于東南、中南、西南地區(qū)。千斤拔以根入藥，有祛風(fēng)濕，強(qiáng)腰膝的功效，用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腰腿痛，腰肌勞損，白帶，跌打損傷?！吨兴幋筠o典》記載“千斤拔味甘辛，微苦，性溫平，無毒，具有祛風(fēng)利濕、消瘀解毒之功效，可治療風(fēng)濕痹痛，慢性腎炎、跌打損傷、癰腫、喉蛾等癥”。國內(nèi)外學(xué)者對該植物化學(xué)成分及其生物活性的研究報道很多，其化學(xué)成分含有黃酮類、香 豆素類、萜類、揮發(fā)油、留醇類等，其中以黃酮類化合物為主，尤其是異戊烯基取代的異黃酮類化合物?，F(xiàn)代藥理研究及臨床試驗(yàn)表明千斤拔不僅對各種婦科炎癥有顯著療效，具有類雌激素作用，還具有良好的抗血栓、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化的作用，對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷也具有一定的保護(hù)作用。千斤拔含有大量的活性物質(zhì)，其中的黃酮類化合物具有抗菌、消炎、抗氧化、降血月旨、降血栓、防治血管硬化和抗衰老等作用。國內(nèi)外關(guān)于千斤拔的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用和活性成分提取的研究。未見基于熱回流提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法提取，大孔樹脂樹脂純化，使千斤拔有效部位總黃酮含量大于50%的報道；未見關(guān)于千斤拔有效部位總黃酮含量大于50%提取物藥物用途的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種蔓性千斤拔總黃酮提取物制備方法，該方法包括以下步驟
(1)將千斤拔藥材粉碎；
(2)用乙醇熱回流提取、超聲波輔助提取或微波輔助提取，合并提取液，過濾，濃縮，真空干燥得千斤拔粗提物；
(3)將步驟(2)中的千斤拔粗提物加水沉淀后離心，上清液備用；
(4)將(3)得到的上清液上大孔樹脂柱；
(5)用水洗脫去雜后，用乙醇梯度洗脫；
(6)收集乙醇洗脫液減壓濃縮真空干燥，粉碎后得到千斤拔總黃酮粗提物。其中步驟(I)中千斤拔粉碎后的粒度為30-60目。步驟(2)中乙醇的濃度為40%_85%。步驟(3)中加水量為浸膏重量的8-10倍。步驟(4)中所述大孔樹脂為AB-8型大孔樹脂，大孔樹脂與步驟⑴中所述千斤拔的重量比為O. 5-5:1。步驟(5)中洗脫溶劑采用與大孔樹脂體積比5-10的蒸餾水、10%、70%乙醇梯度洗脫，合并70%乙醇洗脫液。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下
(1)本發(fā)明采用溶劑提取結(jié)合大孔樹脂純化法對千斤拔中總黃酮進(jìn)行純化，有效提高了提取物中總黃酮含量，經(jīng)紫外分光光度法，以蘆丁為對照品，測得提取物中總黃酮含量大于 50% ；
(2)超聲波輔助提取具有提取效率高、提取時間短、提取溫度低、適應(yīng)性廣、提取藥液雜質(zhì)少，有效成分易于分離、純化、提取工藝運(yùn)行成本低，綜合經(jīng)濟(jì)效益顯著、操作簡單易行，設(shè)備維護(hù)、保養(yǎng)方便的優(yōu)點(diǎn)；
(3)微波輔助提取具有反應(yīng)或萃取快、產(chǎn)率高，產(chǎn)品質(zhì)量好、后處理方便、安全、無污染、生產(chǎn)線組成簡單，節(jié)省投資的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
I.千斤拔總黃酮的提取
(I)溶劑回流法50g千斤拔藥材粗粉，加入12倍量的40-85%乙醇，回流提取3次，每次分別為3h、2h、lh，合并提取液過濾，減壓濃縮，真空干燥。(2)超聲波法50g千斤拔藥材粗粉，加入10倍量的50%乙醇，在60°C下進(jìn)行超聲提取3次,每次分別為50min,30min, IOmin,合并提取液過濾,減壓濃縮,真空干燥。(3)微波輔助提取法50g千斤拔藥材粗粉，加入12倍量的60%乙醇，在60°C下進(jìn)行微波輔助提取3次，每次分別為30min，20min，lOmin，合并提取液過濾，減壓濃縮，真空干燥。2.千斤拔總黃酮的含量測定
(1)對照品溶液的制備精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.Omg于50mL容量瓶中，以70%乙醇溶解，定容得濃度為O. lmg/mL的蘆丁對照品溶液；
(2)供試品溶液的制備精密稱取蔓性千斤拔總黃酮提取物20mg于25mL容量瓶中，力口入70%乙醇溶解，定容，搖勻即得；
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、l、2、3、4、5mL，分別置IOmL容量瓶中，各加70%乙醇溶液使成7mL，精密加入5%亞硝酸鈉O. 3mL,搖勻，放置6min，精密加入10%硝酸鋁溶液O. 3mL,搖勻，放置lOmin，加入lmol/L氫氧化鈉溶液2mL，分別用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置lOmin，置比色皿中，在510nm處測吸光度，測3次取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=8. 5038C-0. 0054，R=O. 9997 ；
(4)提取物中總黃酮含量的測定精密吸取供試品溶液lmL，置IOmL容量瓶中，加60%乙醇溶液使成7mL，精密加入5%亞硝酸鈉O. 3mL,搖勻，放置6min，精密加入10%硝酸鋁溶液
O.3mL,搖勻，放置lOmin，加入lmol/L氫氧化鈉溶液2mL，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置lOmin，置比色皿中，在510nm處測吸光度，測3次取平均值，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取物中總黃酮含量。3.千斤拔總黃酮的純化
(I)樹脂的預(yù)處理及裝柱取新購的AB-8大孔樹脂，以95%乙醇浸泡24h后裝柱(2. 5cmX 20cm)，裝柱過程應(yīng)該讓樹脂緩緩沉下，柱床緊實(shí)且無氣泡，95%乙醇沖洗樹脂柱，至流出液與蒸餾水1:1混合不再出現(xiàn)渾濁為止，繼續(xù)以蒸餾水沖洗樹脂柱，至無醇味為止；(2)上樣用恒流泵將濃度為O.42mg/mL O. 89mg/mL的千斤拔總黃酮提取液進(jìn)行上柱，控制流速為lmL/min ；
(3)收集以5mL為單位體積分步收集流出液，精密吸取ImL流出液，測定吸光度；
(4)飽和吸附量計算當(dāng)流出液濃度達(dá)到上樣液濃度1/10時，即為上樣終點(diǎn)。將流出液合并，通過測定流出液吸光度，計算出流出液濃度，飽和吸附量=[(上樣液濃度X上樣液體積)-(流出液體積X流出液濃度)];
(5)洗脫用5倍柱床體積(50mL)的70%乙醇溶液洗脫，以5mL為單位體積分步收集洗脫液，控制流速為lmL/min，用薄層色譜法確定洗脫終點(diǎn)；
(6)含量測定用Al(NO3)3-NaNO3-NaOH顯色法測定洗脫液中千斤拔總黃酮的濃度；
(7)總黃酮純度計算洗脫液合并，減壓回收溶劑，濃縮物真空干燥，稱重?？傸S酮純度=[(總黃酮濃度(mg/mL) X洗脫液體積(mL))/干燥物重量(mg)]；·
(8)樹脂除了吸附目標(biāo)化合物外，還會吸附雜質(zhì)，而這些雜質(zhì)會污染樹脂，所以每次使用后，樹脂必須再生，每次層析后，將樹脂倒出，用95%乙醇沖洗數(shù)次，待顏色較淺后加5%Na0H溶液沖洗，待顏色較淺后改用蒸餾水洗至中性，繼續(xù)用5%HC1溶液沖洗，待顏色較淺后改用蒸餾水洗至中性，樹脂即可再次使用。本發(fā)明的藥物用途可通過下面藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，千斤拔總黃酮提取物中總黃酮含量大于50%,以下簡稱為DLP。實(shí)驗(yàn)例I DLP對聞脂I旲型小鼠血脂的影響實(shí)驗(yàn)。一、實(shí)驗(yàn)材料
1.動物Wistar大鼠，120只，雌雄各半，體重180-210g。購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，動物合格證號SCXK-(吉)-2007-0003 ；
2.藥品與試劑千斤拔總黃酮提取物(總黃酮含量62%,性狀淺棕色粉末,氣微,味微澀，微苦。批號20100601)，吉林化工學(xué)院藥學(xué)系提供；血脂康膠囊，北京北大維信生物科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號20100206 ;非諾貝特，法國利博福尼制藥公司生產(chǎn)，批號1026396 ;膽固醇，規(guī)格生化試劑，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號100516 ;膽酸鈉，規(guī)格生化試劑，北京化學(xué)試劑公司，批號20100525 ;豬油，由吉林化工學(xué)院藥學(xué)系教研室提供；血清總膽固醇(TC)含量測定試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司，批號100501 ；甘油三酯(TG)含量測定試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司，批號101831 ；
3.儀器iMark-680酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD伯樂公司產(chǎn)品。二、實(shí)驗(yàn)方法
1.高脂飼料配制方法在88.7%的基礎(chǔ)飼料中加10%豬油、1%膽固醇和O. 3%膽酸鈉。將豬油加溫溶化，加入膽固醇和膽酸鈉，攪拌均勻后倒入飼料中，拌勻，加適量溫水拌勻，平鋪在方盤中，厚度約I. 5cm，用壁紙刀劃成2cmX 3cm大小的小塊，放置80°C恒溫干燥箱中烘干;
2.配藥方法分別根據(jù)各組給藥劑量、動物體重、給藥天數(shù)計算出所需要量，精密稱定，先加少量蒸餾水，研磨均勻，再加蒸餾水至所需濃度即可；
3.對照組的設(shè)立動物購入后適應(yīng)環(huán)境3天，按體重隨機(jī)分為正常對照組；高脂模型組；陽性對照藥血脂康膠囊組(240mg/kg);陽性對照藥非諾貝特組(40mg/kg);千斤拔總黃酮提取物高劑量組(400mg/kg)、中劑量組(200mg/kg)和低劑量組(100mg/kg)共8組,每組12只，雌雄各半；
4.動物飼養(yǎng)及取樣實(shí)驗(yàn)過程中，正常對照組動物飼以常規(guī)飼料，其他各組動物均飼以聞脂詞料。實(shí)驗(yàn)動物每天上午灌胃給藥I次，灌胃體積均為20mL/kg。正常對照組及聞脂模型組動物灌胃蒸餾水，給藥組分別給予相應(yīng)的藥物溶液。連續(xù)給藥2周，最后I次給藥當(dāng)晚，動物禁食不禁水16小時，次日眼球取血O. 5ml，離心(3000r/min)分離血清；采用酶比色法測定血清總膽固醇(TC)含量、采用酶比色法測定血清甘油三酯(TG)含量。指標(biāo)數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，統(tǒng)計學(xué)處理方法采用組間t-檢驗(yàn)。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
小鼠在連續(xù)飼以高脂飼料造模2周后，模型組動物的血清TC、TG含量均較正常對照組明顯升高，TC含量正常對照組為3. 14±0. 46mmol/L，模型組為6. 55±0. 85mmol/L(P<0. 01)； TG含量正常對照組為O. 68±0. 24mmol/L，模型組為O. 85±0. 26mmol/L (P〈0. 05)，表明高血脂癥動物模型成立；給藥兩周后，DLP高劑量組動物血清TC和TG含量均低于高脂模型組(P〈0. 01),表明千斤拔總黃酮可明顯降低高脂模型小鼠血清TC和TG含量。表I千斤拔總黃酮提取物(DLP)對實(shí)驗(yàn)性高脂血癥小鼠血脂含量的影響
權(quán)利要求
1.在一種千斤拔總黃酮提取物，其特征在于由下述方法制備得到 (1)取千斤拔藥材20g，粉碎，用60%-85%乙醇作為溶劑加熱回流提取3次，每次分別為3h、2h、Ih,合并提取液，過濾，濃縮，真空干燥即得千斤拔總黃酮粗提物； (2)取千斤拔藥材20g，粉碎，用60%-85%乙醇浸泡l_6h，常壓下，以功率200-900W進(jìn)行微波輔助提取3次，每次分別為30min，20min, IOmin,提取液過濾，濃縮，真空干燥即得千斤拔總黃酮粗提物； (3)取千斤拔藥材20g，粉碎，用60%-85%乙醇浸泡2-4h，常壓下，以頻率為200-700W，進(jìn)行超聲輔助提取3次，每次分別為50min，30min，lOmin，提取液過濾，濃縮，真空干燥即得千斤拔總黃酮粗提物； (4)將(1)、(2)或(3)得到的千斤拔總黃酮粗提物精密稱量，溶解，經(jīng)AB-8大孔樹脂純化，收集洗脫液，回收乙醇得浸膏，真空干燥至恒重即得本發(fā)明的千斤拔總黃酮提取物，其中總黃酮含量>50%。
2.如權(quán)利要求I所述的千斤拔總黃酮提取物的制備方法，其特征在于乙醇可用甲醇代替。
3.如權(quán)利要求I所述的千斤拔總黃酮提取物的制備方法，其特征在于大孔樹脂可用聚酰胺樹脂代替。
4.如權(quán)利要求I所述的千斤拔總黃酮提取物在制備降血脂、降血栓藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種千斤拔總黃酮提取物及其提取方法和其醫(yī)藥用途，屬于中藥的有效藥用部位中的提取物及其提取方法和其藥物用途。將中藥千斤拔干燥粉碎后用40-85％乙醇回流提取、微波輔助提取或超聲波輔助提取，過濾、濃縮、干燥得千斤拔總黃酮粗提物，經(jīng)AB-8大孔樹脂分離純化，收集洗脫液，回收溶劑即得用于中藥新藥研究的千斤拔總黃酮提取物，采用紫外分光光度法測定其中總黃酮含量大于50%。本發(fā)明提取純化的千斤拔總黃酮提取物具有治療高血脂、血栓等疾病的作用。
文檔編號A61K36/48GK102940667SQ201210533249
公開日2013年2月27日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者陳帥, 王慧竹, 王曉林, 薛健飛, 劉立業(yè), 年曉莉 申請人:吉林化工學(xué)院, 陳帥