專利名稱：AsLc－IFN融合蛋白及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人源抗HBs輕鏈與IFN融合蛋白(AsLc-IFN)及其制備方法和應(yīng)用。
IFN-α是一組能夠誘導(dǎo)一系列細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)，繼而發(fā)揮抗病毒作用的細(xì)胞因子，除能直接誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài)外，還能通過活化巨噬細(xì)胞，NK細(xì)胞和增強(qiáng)其它免疫功能，產(chǎn)生廣泛抗病毒效應(yīng)。IFN-α用于慢性乙型肝炎的抗病毒治療已有20多年，是目前治療病毒性肝炎最有效的藥物。
干擾素克隆與表達(dá)的報(bào)道很多，有原核、酵母菌、細(xì)胞等多種形式，是一項(xiàng)成熟的技術(shù)。人源抗HBs的克隆與表達(dá)有數(shù)家報(bào)道，均為原核系統(tǒng)的周質(zhì)腔分泌性表達(dá)?？贵w片段與IFN的融合表達(dá)國外未見報(bào)道，國內(nèi)見于兩家，一是北京海軍總醫(yī)院報(bào)導(dǎo)的抗HBsFd與IFN的融合；另一是解放軍醫(yī)學(xué)雜志2000，25(3)204-206報(bào)導(dǎo)的Fab與IFN的融合表達(dá)。在人源自然抗體的抗原結(jié)合能力中，輕鏈占據(jù)重要地位，因而選擇研究抗體輕鏈與IFN的融合顯得更為重要。
本發(fā)明AsLc-IFN融合蛋白是由人源抗HBsλ輕鏈與IFN-α融合的分子量約為47Kd的蛋白，其輕鏈序列見序列1(Lc-DNA)。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是公開上述AsLc-IFN融合蛋白的制備方法。
本發(fā)明公開的AsLc-IFN融合蛋白是采用人抗HBs輕鏈基因與IFNα的基因在體外連接，其具體步驟包括1、選擇商品高表達(dá)載體pBAD/gIII作為本產(chǎn)品的克隆載體，應(yīng)用輕鏈框架區(qū)和穩(wěn)定區(qū)兩端的序列特異引物從抗HBFab陽性克隆中擴(kuò)增出輕鏈序列，經(jīng)酶切與連接后構(gòu)建成輕鏈表達(dá)載體；用基因擴(kuò)增法將IFN-α基因插入到已載有輕鏈的載體中；改建后的質(zhì)粒圖譜為見

圖1。
2、載體轉(zhuǎn)化Top10細(xì)菌后經(jīng)抗原結(jié)合活性和干擾素活性的雙重篩選確定陽性克隆，增菌、發(fā)酵培養(yǎng)所選克隆，在阿拉伯糖誘導(dǎo)條件下表達(dá)融合蛋白。
3、經(jīng)Ni-NTA Agarose親和層析純化，得到約80mg/L菌液的目的蛋白，并大量生產(chǎn)該融合蛋白。
4所得蛋白經(jīng)與抗原結(jié)合試驗(yàn)和干擾素活性測定表明具有雙重活性。
本發(fā)明實(shí)施例1詳細(xì)描述了AsLc-IFN融合蛋白的制備。
本發(fā)明選擇抗HBs輕鏈與IFN的融合表達(dá)，將原pComb3表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換為pBAD系統(tǒng)。其中pBAD/gIII Top10原核表達(dá)系統(tǒng)，系周質(zhì)腔分泌性表達(dá)，有助于活性蛋白的正確折疊，有助于抗體與干擾素的立體結(jié)構(gòu)形成與活性保持。
表達(dá)純化后的融合蛋白保持了原抗原結(jié)合能力，實(shí)驗(yàn)證明其抗原結(jié)合性與Fab片段相近，并具有IFN-α的生物活性，經(jīng)dot-blot，westernblot鑒定其抗原結(jié)合能力與原Fab的生物活性在同一級別。初步鑒定表明融合蛋白中的干擾素具良好生物活性。
本發(fā)明所要解決的再一技術(shù)問題是公開上述AsLc-IFN融合蛋白在制備治療HBV感染藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明公開的AsLc-IFN融合蛋白，可用于HBV感染的預(yù)防和某些患者的治療，還可用于包括HBsAg陽性的部分肝癌患者。
本發(fā)明克隆表達(dá)的融合蛋白中的抗體片段為人源抗體基因的表達(dá)產(chǎn)物，其氨基酸的序列見序列2(Lc-pro)，各框架區(qū)和CDR區(qū)的序列見序列5，IFN-α為人源干擾素基因，其基因序列和對應(yīng)的氨基酸分別見序列3(INF-DNA)，序列4(INF-pro)。
序列表序列1 人源抗HBsλ輕鏈序列(Lc-DNA)cgcctggccg agctccagcc tgcctccgtc tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt gcttatgact ttgtctcctg gtaccaacaa120cacccaggca aaccccccaa actcatcatt tttgatgtca agaagcggcc cccaggggtt180tccaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc240caaactgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caaacaccgt cacccccgtt300ttcggcggag agaccaaggt gaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact360ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata420agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag480gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc540tatctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg600catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccctacag aatgttcata gttctagaac660序列2 人源抗HBsλ輕鏈氨基酸序列(Lc-pro)Arg Leu Ala Glu Leu Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr20 25 30Asp Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu35 40 45Ile Ile Phe Asp Val Lys Lys Arg Pro Pro Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Asn Thr85 90 95Val Thr Pro Val Phe Gly Gly Glu Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln100 105 110Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu115 120 125Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr130 135 140Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys145 150 155 160Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His180 185 190Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys195 200 205Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Phe Asn Lys Asn210 215 220序列3 IFN-α基因序列(INF-DNA)atgtgcgacc ttcctcaaac tcacagcctt ggcaaccgcc gcgccttgat actcctggca 60cagatgagga aaatctctct tttctcctgc ttgaaggaca gacatgactt tggatttccc120caggaggagt ttggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ccatgagatg180atccagcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc240atcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg300atacaggggg tgggggtgac agagactccc ctgatgaagg aggactccat tctggctgtg360aggaaatact tccaaagaat cactctctat ctgaaagaga agaaatacag cccttgtgcc420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttttctt tgtcaacaaa cttgcaagaa480agtttaagaa gtaaggaacg tctagaac508序列4 IFN-α氨基酸序列(INF-pro)Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu1 5 10 15Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys20 25 30Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe35 40 45Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile50 55 60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr65 70 75 80Ile Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu85 90 95Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met100 105 110Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr115 120 125Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val130 135 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu145 150 155 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu Arg Leu Glu165序列5 輕鏈各框架區(qū)和CDR區(qū)的序列RL″AELQPASVSGSPGQSITISC″TGTSSDVGAYDFVS″WYQQHPGKPPKLIIF″DVKKRPP″GVSNRFSFR 1 CDR 1 FR 2 CDR 2GSKSGNTASLTISGLQTEDEADYYC″SSYTNTVTPVF″GETKVTVLG″QPKAAPSVTLFPPSSEELQANFR 3 CDR 3FR 4KATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
(2)克隆及篩選將重組了人源抗HBsAg抗體Lc基因的pBAD/gIIIA載體用xbaI單酶切，膠回收后作去磷酸化處理，與經(jīng)同樣由xbaI單酶切的IFN-α目的基因以1∶1摩爾比混合，T4連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，選取單克隆，抽提質(zhì)粒載體為模板，用擴(kuò)增IFN-α基因的引物行PCR鑒定插入了IFN-α的陽性克隆，再以載體上游的18個堿基序列合成一段正向篩選引物，序列為5’-TTC GCG ATT CCG CTGGTG-3’。用此引物與擴(kuò)增IFN-α的反向引物組合，以插入了IFN-α的陽性載體為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，如IFN-α插入方向正確則可擴(kuò)增出一包含抗體片段基因與IFN-α基因在內(nèi)的長約2KB的基因片段，如IFN-α為反向插入，則擴(kuò)增不出此片段。
(3)融合蛋白的表達(dá)及純化選取篩選的陽性克隆，轉(zhuǎn)化TOP10大腸桿菌，挑選單個克隆，接種于10ml LB中(含50mg/ml氨芐)37℃，225rpm震搖過夜，按1％比例轉(zhuǎn)接入100ml LB中(含50mg/ml氨芐)37℃，225rpm震搖4-5h，按4％比例接入2.5L KLF2000發(fā)酵系統(tǒng)中發(fā)酵培養(yǎng)14h，于第4h開始分批補(bǔ)料，于第9h開始加入阿拉糖誘導(dǎo)表達(dá)，14h后離心收菌，取一定量菌體按1∶10(W/V)加入10倍體積預(yù)冷1xPBS液，超聲裂解，功率300-400W，10次，每次10秒，間隔10秒，裂解后5000rpm，4℃離心30min，收集上清，用Ni-NTA Agarose柱進(jìn)行親和層析純化，經(jīng)過上柱結(jié)合，洗滌，洗脫幾個步驟，收集洗脫液，用Beckman Du640核酸及蛋白分析儀，測量蛋白含量。
(4)純化產(chǎn)品的檢測取一定濃度純化蛋白，以HRP標(biāo)記的抗人IgG Fab抗體為顯色抗體作Western-blot檢測融合蛋白中抗體成份。在抗IFN-α ELISA Kit板條加樣孔中分別加入100μl純化蛋白液，及各種濃度的IFN-α標(biāo)準(zhǔn)品，并以PBS及標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為陰性對照，37℃溫育90分鐘，洗板5次，加入酶聯(lián)工作液37℃溫育60分鐘，洗板5次，顯色，終止后測450mm吸光度值。
(5)抗體融合蛋白的生物學(xué)活性鑒定在硝纖膜上預(yù)點(diǎn)HBSAg抗原，以所獲純化蛋白為一抗，以HRP標(biāo)記羊抗人IgG Fab抗體為二抗，作DOT-blot分析。以人源抗HBsAgFab片段蛋白為對照檢測融合蛋白抗體親合性。應(yīng)用WISS細(xì)胞法檢測表達(dá)產(chǎn)物中IFN-α的生物活性。用人IFN-αELISA檢測試劑盒檢測融合蛋白中IFN-α的抗原性，與IFN-α標(biāo)準(zhǔn)品對照示純化蛋白液呈陽性結(jié)果。應(yīng)用Dot-blot檢測融合蛋白中抗體親合性，結(jié)果提示融合蛋白有較好的抗原結(jié)合性，與Fab蛋白差別不大。WISS細(xì)胞法檢測顯示表達(dá)產(chǎn)物IFN-α生物活性較好。
(6)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出了人IFN-α基因，并插入到重組了人抗HBsAg Lc基因的pBAD/gIIIA載體(圖1)，又進(jìn)一步篩選出了插入方向正確的陽性克隆。
發(fā)酵培養(yǎng)后離心收取菌落，獲得濕菌重為96g/L，經(jīng)Ni-NTAAgrase柱純化后，獲得了λ輕鏈與IFN-α的融合蛋白，分子量約為47kd。
權(quán)利要求
1.一種AsLc-IFN融合蛋白，其特征在于該蛋白由人源抗HBsλ輕鏈與IFN-α融合的分子量約為47Kd的蛋白，其輕鏈具序列1的DNA序列和序列2的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AsLc-IFN融合蛋白的制備方法，其特征在于所述融合蛋白的制備包括下列步驟1)選擇載體pBAD/gIII作為本產(chǎn)品的克隆載體，應(yīng)用輕鏈框架區(qū)和穩(wěn)定區(qū)兩端的序列特異引物從抗HBFab陽性克隆中擴(kuò)增出輕鏈序列，經(jīng)酶切與連接后構(gòu)建成輕鏈表達(dá)載體，用基因擴(kuò)增法將IFN-α基因插入到已載有輕鏈的載體中；2)載體轉(zhuǎn)化Top10細(xì)菌后經(jīng)抗原結(jié)合活性和干擾素活性的雙重篩選確定陽性克隆，增菌、發(fā)酵培養(yǎng)所選克隆，在阿拉伯糖誘導(dǎo)條件下表達(dá)融合蛋白；3)經(jīng)Ni-NTA Agarose親和層析純化，得到目的蛋白，并大量生產(chǎn)該融合蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AsLc-IFN融合蛋白在制備治療HBV感染藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物可用于HBV感染的預(yù)防和治療，還可用于HBsAg陽性的部分肝癌患者的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及人源抗HBs輕鏈與IFN融合蛋白(AsLc－IFN)及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明AsLc－IFN融合蛋白是由人源抗HBsλ輕鏈與IFN－α融合，分子量約為47Kd的蛋白。該AsLc－IFN融合蛋白采用人抗HBs輕鏈基因與IFNα的基因在體外連接，構(gòu)建pBAD/gIII載體，轉(zhuǎn)化Top10細(xì)菌后經(jīng)抗原結(jié)合活性和干擾素活性的雙重篩選，陽性克隆在阿拉伯糖誘導(dǎo)條件下原核表達(dá)，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)和Ni－NTAAgarose親和層析純化，得到約80mg/L菌液的周質(zhì)腔蛋白，并可大量生產(chǎn)該融合蛋白。該融合蛋白保持了原抗原結(jié)合能力，并具有IFN－α的生物活性，可用于HBV感染的預(yù)防和某些患者的治療，還可用于包括HBsAg陽性的部分肝癌患者。
文檔編號A61P31/00GK1442430SQ0311623
公開日2003年9月17日 申請日期2003年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月8日
發(fā)明者韓煥興 申請人:韓煥興, 安峰, 陸慧琦