專利名稱：透明質(zhì)酸的雜化協(xié)同復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于透明質(zhì)酸的產(chǎn)品領(lǐng)域。
現(xiàn)有技術(shù)下文通常所述的透明質(zhì)酸，連同它的鹽稱為透明質(zhì)酸化合物HA，是負(fù)電荷直鏈多糖，由n個ニ糖単元([email protected] l-3GlcNAc ^ 1-)的重復(fù)組成，其中D-葡糖醛酸(GlcUA)和N-こ?；?D-葡糖胺(GlcNAc)是用交替的@ -1, 3和@ -1, 4糖苷鍵連接的。HA是高水溶性多糖，并且HA溶液表現(xiàn)出非牛頓型粘弾性性能。這些性質(zhì)取決于分子量(由于HA是線性聚合物，因此，分子量取決于鏈的長度)、濃度、pH和離子強度。由于它的生物學(xué)性質(zhì)和功能，HA具有很高的附加值(它的商業(yè)價值大大超過了其它天然多糖)，應(yīng)用范圍從醫(yī)藥方面到藥用化妝品和營養(yǎng)食品。它的粘彈性連同完全沒有毒性或免疫原性(HA的結(jié)構(gòu)在其存在的所有活的有機體中通常是ー樣的)產(chǎn)生多種且廣泛的應(yīng)用。在很多這些應(yīng) 用中，性能取決于HA的分子量。對于這一點，當(dāng)開發(fā)HA的制備方法和應(yīng)用策略吋，HA的平均分子量和多分散性指數(shù)Mw/Mn (其測量分子量分布曲線的寬度，其中Mn是數(shù)量-平均分子量，定義為樣品中所有聚合物分子的總重量除以分子總數(shù)，并且Mw是重量-平均分子量，其考慮存在的分子的變化質(zhì)量)必須是考慮的金標(biāo)準(zhǔn)。特別地，目前與其分子量相關(guān)的HA的多種生物學(xué)響應(yīng)意味著在文中必須使用低分子量HA (L-HA)和高分子量HA (H-HA)。發(fā)明描述本發(fā)明描述了 L-HA與H-HA之間的協(xié)同雜化復(fù)合物(cooperative hybridcomplexes)(命名為簡稱L/H-HA)、它們的特性、其制備方法以及其在醫(yī)藥、化妝品和食品領(lǐng)域的用途。弱作用力(例如氫鍵或疏水相互作用)能在分子間產(chǎn)生非常穩(wěn)定的相互作用，如果這些是協(xié)同類型。當(dāng)在分子間可能形成多重鍵時，產(chǎn)生協(xié)同性，并且很弱，隨后它們隨機斷裂，但是由于存在完整的鄰位鍵，多重鍵能立即重新形成，所述的鄰位鍵在可用于重新形成的距離處維持鍵的結(jié)構(gòu)組成。溶液中HA分子的特征在于基于形成疏水鍵和鏈間氫鍵的相互作用的協(xié)同現(xiàn)象，并且這些相互作用的協(xié)同性取決于鏈的長度，并且因此取決于鏈的分子量。H-HA的長鏈提供它們之間穩(wěn)定的相互作用，其涉及溶液中存在的所有分子，其產(chǎn)生三維網(wǎng)絡(luò)，然而L-HA分子提供不太穩(wěn)定的相互作用，導(dǎo)致聚集的體系，其沒有同時涉及存在的所有分子，其替代聚簇中的相互作用。溶液中H-HA和L-HA的這種不同方式的聚集引起流變學(xué)性能的很大差異，例如HA溶液的粘度，對于很多應(yīng)用(特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域中)，這是非常重要的性質(zhì)。事實上，作為分子量函數(shù)的HA溶液的粘度快速下降實際上取決于分子間相互作用的這種不同能力，因此，在相同濃度下，分子量大于I IO6Da的H-HA溶液比分子量在5 IO3至5 IO5Da之間的L-HA溶液具有更高數(shù)量級的粘度。由于H-HA長鏈之間相互作用的強的協(xié)同性，當(dāng)L-HA溶于H-HA的粘稠溶液中時，短期內(nèi)沒有觀察到產(chǎn)生的溶液的粘度的顯著差異，這表明兩種分子群體獨立表現(xiàn)，并且L/H-HA協(xié)同雜化聚集體的形成是熱力學(xué)不利的過程。只有經(jīng)過一段時間(數(shù)天至數(shù)周)，才能觀察到粘度緩慢但持續(xù)下降，這不能歸因于水解過程，并且如果L-HA的分子量小于IO5Da,這些效應(yīng)更明顯。這些溶液理化性質(zhì)(特別是粘度)的不斷變化使得它們不適合實際應(yīng)用，其需要不變的流變學(xué)特征。因此，鑒于以上描述，很清楚目前還沒有獲得低分子量透明質(zhì)酸和高分子量透明質(zhì)酸之間的協(xié)同雜化復(fù)合物，所述的復(fù)合物具有使得它們能用于所需目的的性質(zhì)?，F(xiàn)在，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)通過將含有H-HA和L-HA的水溶液一起經(jīng)過合適配置的熱循環(huán)來產(chǎn)生穩(wěn)定的L/H-HA協(xié)同雜化物是可能的。本發(fā)明的穩(wěn)定的L/H-HA協(xié)同雜化物溶液的特征在于粘度不隨時間變化并且顯著低于熱循環(huán)之前。這些性能不能僅僅歸因于HA的熱解聚過程。存在四個精密決定L/H-HA復(fù)合物形成和它們流變學(xué)性質(zhì)的參數(shù):a)在相同溶液中同時存在兩種類型的HA(L_HA和H-HA)；b)在形成L/H-HA雜化物體系的過程中所用的兩種HA的分子量；c)所用的兩種HA的相對比例；d)溶液所暴露的熱循環(huán)的分布。在相同溶液中同時存在兩種類型HA (L-HA和H_HA)是ー個必要條件，因為當(dāng)進(jìn)行熱循環(huán)，溶液達(dá)到足夠高溫度時，產(chǎn)生的能量條件能同時破裂H-HA鏈間的所有相互作用以及L-HA鏈間的所有相互作用，并且在這些條件中不再存在必要條件，因為溶液中分子間產(chǎn)生的弱相互作用是協(xié)同型，并且聚合物鏈以獨立的實體表現(xiàn)。接著，當(dāng)溶液在熱處理循環(huán)范圍內(nèi)冷卻吋，鏈間相互作用開始逐漸重新形成，在這種情況下其在溶液中存在的所有HA分子間(高分子量和低分子量)隨機產(chǎn)生，引起雜化物體系，隨著弱分子間鍵數(shù)量的増加，雜化物體系是穩(wěn)定的，它們的協(xié)同性意味著不同分子量的聚合物鏈間產(chǎn)生的相互作用方式不隨時間變化。確認(rèn)這種機制有效性實際上是，當(dāng)兩種溶液(ー種L-HA和ー種H-HA)分別進(jìn)行熱循環(huán)，然后冷卻后將它們以相同濃度在溶液中一起混合時，我們沒有觀察到由雜化物系形成引起的粘度的顯著且快速降低，只有在熱循環(huán)過程中同時存在兩種分子時才能形成雜化物體系。在構(gòu)建L/H-HA雜化物體系中所用的HA的分子量精密地決定了它們的流變學(xué)特性；所用的L-HA和H-HA之間分子量差異越大，相同濃度時，相比H-HA的粘度，雜化物體系的粘度降低越多。如果L-HA的分子量在I IO4至I IO6Da之間并且H-HA的分子量是以公式MWh-BA ^ MWl_ha/0.9給定時，可以獲得具有粘度降低特征的協(xié)同雜化L/H-HA復(fù)合物。L-HA和H-HA的相對比例(決定雜化物的化學(xué)計量)相比它們之間雜化的種類引起它們流變學(xué)性質(zhì)的修飾；由于復(fù)合物的形成引起的粘度降低隨著所用的L-HA/H-HA化學(xué)計量比的増加而增加。通常所述的比值在0.1至10之間，優(yōu)選0.5至2。本發(fā)明的復(fù)合物的粘度通常比單獨含有用于形成復(fù)合物的H-HA透明質(zhì)酸的溶液的粘度小1.1至200倍。 引起由含有L-HA和H-HA的溶液開始形成協(xié)同雜化L/H-HA體系的熱分布發(fā)現(xiàn)，首先將溶液加熱至溫度為80至160°C、優(yōu)選100至120°C，然后快速冷卻至室溫。從而獲得的L/H-HA雜化物體系隨時間穩(wěn)定，證明能維持它們的流變學(xué)特征。如已經(jīng)提及的，本發(fā)明的L/H-HA雜化復(fù)合物溶液可以易于通過將所需分子量的H-HA和L-HA水溶液混合并且將產(chǎn)生的溶液進(jìn)行上面所示的熱循環(huán)而獲得，優(yōu)選L-HA溶液的濃度為0.01至50%w/w，而H-HA溶液的濃度為0.01至10%w/w。固態(tài)協(xié)同雜化L/H-HA復(fù)合物可以從含有它們的溶液以多種方式獲得:a)沉淀含有它們的溶液，加入水可混溶的有機溶劑，例如低分子量醇、丙酮等；b)溶劑蒸發(fā)；c)噴霧干燥；d)凍干。此外，類似于上述那些具有低值動態(tài)粘度特征的協(xié)同雜化復(fù)合物可以通過高溫?zé)崽幚砗械头肿恿慷嗵?例如軟骨素、硫酸軟骨素、糊精、環(huán)糊精、葡聚糖)的H-HA水溶液而獲得。由于它們流變學(xué)特性，協(xié)同雜化L/H-HA復(fù)合物在某些生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有很多益處，例如:通過皮內(nèi)注射HA生物再生皮膚；用于消退與關(guān)節(jié)炎性障礙相關(guān)的病理學(xué)狀況的粘度補充技術(shù)；膀胱內(nèi)治療膀胱炎；治療陰道炎性疾??；治療肺泡疾??；治療口腔疾病。與使用協(xié)同雜化L/H-HA復(fù)合物相關(guān)的最重要的優(yōu)勢是它們的低粘度，在醫(yī)學(xué)實踐中其允許使用更高濃度的溶液，但在用小口徑針和導(dǎo)管注射或噴霧時仍能充分流動。一旦接觸生物環(huán)境，協(xié)同雜化L/H-HA復(fù)合物作為體系表現(xiàn)出緩慢釋放L-HA和H-HA,因為微環(huán)境的 化學(xué)復(fù)雜性(特征在于溶液中存在其它種類和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的巨大表面)容許逐漸分解分子間相互作用，其表現(xiàn)為所述的復(fù)合物使得本文從頭開始可獲得L-HA和H-HA，它們是在體內(nèi)具有不同作用的分子種類，L-HA通過與細(xì)胞表面存在的受體相互作用傳遞信號，H-HA作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成。下面給出了非限制性實施例，描述了協(xié)同雜化L/H-HA復(fù)合物的制備、特性和用途。實施例1-在不同溫度下制備協(xié)同雜化L/H-HA復(fù)合物H-HA (MWl.4 IO6Da ；Mw/Mnl.5)和 L-HA (MW3.3 IO4Da ；Mw/Mnl.8)的兩種水溶液是以2%w/v在蒸餾水中制備的，其用于制備表I中給出的多種溶液。將同時含有L-HA和H-HA的這些溶液在高壓釜中進(jìn)行熱循環(huán)，其設(shè)定為:a)加熱相在10分鐘內(nèi)由25°C升至最高溫度；b)維持該溫度特定一段時間(10分鐘或40分鐘)；c)在10分鐘內(nèi)冷卻溶液至25°C。測定麗和多分散性指數(shù)Mw/Mn，使用裝有多檢測器的尺寸排阻色譜系統(tǒng)，所述的多檢測器包括四橋粘度計、折射計、直角光散射檢測器(RALS)和低角光散射檢測器(LALS),專利權(quán)歸 American group Viscotek (www.viscotek.com)所有。用 LALS 測量的信號與分子量和濃度成比例，用粘度檢測器測量的信號與樣品濃度和固有粘度成比例，而折射計提供濃度的測量。Viscotek裝置不僅能測量HA的分子量，而且能評價存在的分子群體中分子量的不均一度，通過多分散性指數(shù)Mw/Mn描述，通過Viscotek裝置自動計算，并且定義為平均分子量(Mw= 1:沖具/！:凡，其中Hii是分子量Mi的聚合物的質(zhì)量，并且2 a是聚合物的總質(zhì)量，設(shè)定Hii=Ii具，表達(dá)式還可以為Mw= I: ^iMi2/1: ^iMi)和重量-平均分子量(Mn= I: PiMi/1: ini，其中IiiMi是分子量Mi的聚合物的質(zhì)量，并且SiIii是存在的聚合物的總摩爾數(shù))的比。動態(tài)粘度n的測量是在Anton Paar Physica MCR301流變儀上進(jìn)行的，使用具有同軸圓筒的幾何圖。n是在25°C下以恒定剪切率(^,=2(1)測定的，其在聚合物溶液的牛頓粘度范圍內(nèi)(相對于Y’，n是常數(shù)，并且僅取決于溶液中聚合物的構(gòu)象)。表權(quán)利要求
1.通過在溫度為80°C至160°C進(jìn)行熱處理同時含有L-HA透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸化合物和H-HA透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸化合物的溶液制備的穩(wěn)定的雜化協(xié)同L/H-HA復(fù)合物，其中L-HA的分子量為I IO4至I IO6Da,并且H-HA的分子量是通過公式MWma彡MWL_m/0.9得到的。
2.權(quán)利要求1的穩(wěn)定的復(fù)合物，其中所述的溫度為100°C至120°C。
3.權(quán)利要求1和2的雜化協(xié)同復(fù)合物，其中H-HA和L-HA是以相對量為0.1至10、優(yōu)選0.5至2存在的。
4.權(quán)利要求1-3的L/H-HA復(fù)合物，其粘度比單獨含有用于形成復(fù)合物的H-HA透明質(zhì)酸的溶液的粘度小1.1至200倍。
5.權(quán)利要求4的L/H-HA復(fù)合物，其中除了溶劑和透明質(zhì)酸之外的其它化學(xué)物質(zhì)也存在于該溶液中。
6.權(quán)利要求1-4的L/H-HA復(fù)合物，其中所用的溶劑是水。
7.權(quán)利要求1的L/H-HA復(fù)合物，其中熱處理是在高壓釜中進(jìn)行的。
8.權(quán)利要求1和7的L/H-HA復(fù)合物，其中熱處理包括將樣品在最高溫度保持一段時間，所述的時間從10秒至2小時、優(yōu)選10至30分鐘。
9.權(quán)利要求1、7和8的L/H-HA復(fù)合物，其中熱處理包括歷經(jīng)I分鐘至I小時、優(yōu)選2至10分鐘的時間達(dá)到最高溫度。
10.權(quán)利要求1、7和8的L/H-HA復(fù)合物，其中熱處理包括在最高溫度暴露后歷經(jīng)I分鐘至I小時、優(yōu)選2至10分鐘的時 間冷卻溶液。
11.權(quán)利要求1至10的L/H-HA復(fù)合物，其通過沉淀包含它們的溶液制備為固態(tài)。
12.權(quán)利要求11的L/H-HA復(fù)合物，其中沉淀是通過加入與溶液可混溶的化合物并且用作復(fù)合物的非溶劑來獲得的。
13.權(quán)利要求12的L/H-HA復(fù)合物，其中復(fù)合物的非溶劑化合物是水可混溶的有機溶齊U，優(yōu)選丙酮、甲醇、こ醇、丙醇、異丙醇、丁醇。
14.權(quán)利要求1至10的L/H-HA復(fù)合物，其通過真空蒸發(fā)、噴霧干燥或凍干的方式除去溶劑制備為干燥狀態(tài)。
15.權(quán)利要求1至14的雜化協(xié)同復(fù)合物，其中低分子量透明質(zhì)酸被其它低分子量多糖代替，所述的其它低分子量多糖例如軟骨素、硫酸軟骨素、糊精、環(huán)糊精、葡聚糖。
16.權(quán)利要求15的雜化協(xié)同復(fù)合物,其中低分子量多糖表不小于I百萬Da。
17.權(quán)利要求1至16的雜化協(xié)同復(fù)合物作為基于應(yīng)用該多糖的所有臨床治療中高分子量透明質(zhì)酸的替代物的用途。
18.權(quán)利要求1至16的雜化協(xié)同復(fù)合物在真皮內(nèi)生物再生治療中的用途。
19.權(quán)利要求1至16的雜化協(xié)同復(fù)合物在關(guān)節(jié)內(nèi)粘性補充治療中的用途。
20.權(quán)利要求1至16的雜化協(xié)同復(fù)合物在膀胱內(nèi)治療膀胱炎中的用途。
21.權(quán)利要求1至16的雜化協(xié)同復(fù)合物在治療陰道炎性疾病中的用途。
22.權(quán)利要求1至16的雜化協(xié)同復(fù)合物在治療肺泡疾病中的用途。
23.權(quán)利要求1至16的雜化協(xié)同復(fù)合物在治療口腔疾病中的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了透明質(zhì)酸的協(xié)同雜化復(fù)合物，其簡單經(jīng)濟的制備方法以及其在醫(yī)藥、化妝品和食品領(lǐng)域中的用途。
文檔編號A61K31/728GK103119068SQ201180043030
公開日2013年5月22日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者M·德羅薩, A·達(dá)戈斯提諾, A·拉加塔, C·斯基拉爾迪 申請人:阿爾特剛股份有限公司