專利名稱：一種疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防和治療豬瘟、豬藍(lán)耳病的疫苗組合物。
背景技術(shù)：
豬痕(classicalswine fever, CSF)是由豬痕病毒(classical swine fevervirus, CSFV)引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的毀滅性傳染病。該病死亡率高達(dá) 80-90%，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為OIE疾病名錄，我國(guó)也將其列為一類(lèi)傳染病。豬瘟的防制歷來(lái)是全世界豬瘟存在國(guó)非常重視的課題，為此各國(guó)都投入了大量的人力、物力。 目前疫苗接種仍是控制豬瘟的重要手段。我國(guó)生產(chǎn)的豬瘟兔化弱毒疫苗有脾淋苗、乳兔組織苗、牛睪丸原代細(xì)胞苗及最近兩年發(fā)展起來(lái)的豬睪丸傳代細(xì)胞苗，疫苗免疫仍是我國(guó)防控豬瘟的基本手段。
豬繁殖與呼吸綜合征(又稱豬藍(lán)耳)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的以母豬發(fā)熱、流產(chǎn)，斷奶前后的仔豬死亡率升高，不同年齡豬呼吸障礙等為臨床特征的疾病。目前，該病是嚴(yán)重影響世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。疫苗接種是預(yù)防該病最有效的方法，國(guó)內(nèi)外已有商品化的豬繁殖與呼吸綜合征疫苗。既有滅活疫苗，也有用弱毒株制備的活疫苗。由于豬場(chǎng)的區(qū)域性及流行病學(xué)特征不同，有的豬場(chǎng)免疫經(jīng)典藍(lán)耳病的弱毒苗，有的免疫高致病性藍(lán)耳病的弱毒苗，臨床上給藍(lán)耳病的免疫帶來(lái)了很多困擾。
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是一種正鏈RNA病毒，目前已發(fā)現(xiàn)兩種基因型 歐洲型和美洲型，目前兩種基因型在我國(guó)均有檢出。PRRSV基因組大小約15kb，有多個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中第一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFla和ORFlb)含有PRRSV基因組的80%的序列，其編碼有關(guān)RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的蛋白，包括RNA依賴性RNA聚合酶。(Straw et al，Diseases of Swine, 9th edition, chapter 24(2006))。ORFla 和 ORFlb 被翻譯成一個(gè)多聚蛋白 (poly-protein)，該多聚蛋白被其中含有的蛋白酶活性區(qū)域切割成多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，包括 Nspl_Nspl2(見(jiàn)，Vries et al, Seminarsin Virology,8 :33-47(1997) ；Allende et al, Journal of General Virology, 80 :307-315 (1999))。根據(jù)對(duì)國(guó)內(nèi)高致病性藍(lán)耳病毒株的遺傳變異分析，高致病性毒株是目前優(yōu)勢(shì)流行毒株，且變異較快。高致病性豬藍(lán)耳病為一類(lèi)動(dòng)物疫病，是目前嚴(yán)重危害中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的一類(lèi)疫病，表現(xiàn)為對(duì)呼吸系統(tǒng)、繁殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)均有強(qiáng)的致病力。病毒毒力極強(qiáng)，豬感染高致病性豬藍(lán)耳病病毒可以產(chǎn)生高水平的病毒血癥，高致病性豬藍(lán)耳病對(duì)豬場(chǎng)造成的經(jīng)濟(jì)損失極大，有很多豬場(chǎng)因?yàn)樵摬≡獾綒缧源驌?，高致病性豬藍(lán)耳病病毒已是我國(guó)現(xiàn)階段藍(lán)耳病流行的主導(dǎo)毒株這一事實(shí)已毋庸置疑。
PRRSV變異株各毒株0RF5基因氨基酸同源性為96% -100%,且NsP2基因都有30 個(gè)氨基酸的缺失，現(xiàn)有技術(shù)的毒株NVDC-JXA1-R，并作為預(yù)防高致病性藍(lán)耳病疫情政府招標(biāo)用疫苗株，在控制高致病性藍(lán)耳病疫情中起到重要作用。隨后又有兩株高致病性藍(lán)耳病變異株TJ M-F92株和HuN4-F112株活疫苗上市，上述毒種的效力和免疫效果上基本一致。
經(jīng)典株藍(lán)耳病毒株大多為美洲分離株，經(jīng)典藍(lán)耳病為二類(lèi)動(dòng)物疫病，表現(xiàn)為對(duì)仔豬呼吸系統(tǒng)和母豬繁殖系統(tǒng)有較強(qiáng)的致病力，病毒傳播能力較強(qiáng)，經(jīng)典藍(lán)耳病病毒的復(fù)制能力要比高致病性藍(lán)耳病病毒低10000倍以上，豬群一旦感染高致病性豬藍(lán)耳病病毒，經(jīng)典的藍(lán)耳病病毒就很難在豬體內(nèi)檢測(cè)到。目前主要有豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗R98株、 豬藍(lán)耳病ATCCVR-2332株、豬藍(lán)耳病CH-1R株。
目前，PRRS活疫苗使用的弱毒株均為人工馴化毒株，均經(jīng)過(guò)傳代致弱而成為無(wú)毒力，且有良好的免疫原性的弱毒疫苗株，PRRSV變異株各毒株之間的同源性很高。通過(guò)對(duì)全國(guó)各地分離的PRRSV變異株進(jìn)行完整的0RF5和部分Nsp2基因序列比較分析發(fā)現(xiàn)，來(lái)自不同豬場(chǎng)的PRRSV高度同源，新分離毒株的GP5基因相互之間也是高度同源，同源性達(dá)到 98. 5—100% (參見(jiàn)CN 101280292A說(shuō)明書(shū)第9頁(yè)2. 2. 7序列分析)。目前，普遍使用的 PRRSV活疫苗使用的變異株毒株有NVDC-JXAl-R株、TJM-F92株和HuM-Fl 12株，雖然不同毒株在毒力和生物學(xué)特征等方面存在差異，但其免疫原性相似，因?yàn)镻RRS活疫苗變異毒株之間高度同源，具有免疫原性的蛋白均存在。因此，使用不同變異毒株的活疫苗，均可取得很好的免疫效果。
藍(lán)耳病弱毒疫苗株除了變異株還有經(jīng)典毒株，目前應(yīng)用的疫苗毒株有豬繁殖與呼吸綜合征R98株、ATCCVR-2332株、CH-1R株，經(jīng)典毒株之間的同源性很高，其交叉保護(hù)性也很好，均能夠很好地抵抗經(jīng)典毒株強(qiáng)毒的攻擊。各毒株制備的疫苗對(duì)經(jīng)典藍(lán)耳病強(qiáng)毒株均有良好的免疫保護(hù)性。
豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株和經(jīng)典毒株之間的同源性僅為69. 8-86. 2%，到目前為止也有經(jīng)典毒株制備的疫苗可以保護(hù)高致病性藍(lán)耳病毒的攻擊的成功例子，但普遍認(rèn)為，經(jīng)典毒株對(duì)防控高致病性藍(lán)耳病的效果遠(yuǎn)不如變異株的弱毒株疫苗的效果好。如果飼養(yǎng)管理水平較好，且飼養(yǎng)范圍內(nèi)未發(fā)生病藍(lán)耳病流行的，經(jīng)典株與變異株制備的疫苗也會(huì)有一定的交叉保護(hù)性。
這兩種豬的傳染病對(duì)養(yǎng)豬的危害非常嚴(yán)重，目前免疫接種仍是我國(guó)防制豬瘟、豬藍(lán)耳病的重要措施。并且有文獻(xiàn)表明豬藍(lán)耳病疫苗與豬瘟疫苗同 時(shí)免疫會(huì)使疫苗的效力顯著降低(湖北畜牧獸醫(yī)，2009年第7期，豬藍(lán)耳病免疫對(duì)豬瘟免疫效果影響的試驗(yàn))，也有文獻(xiàn)表明兩種抗原同時(shí)免疫基本上無(wú)免疫抑制，其所指“基本上無(wú)免疫抑制”是指不會(huì)顯著削弱對(duì)方的免疫效果(CN102727883A豬繁殖與呼吸綜合征與豬瘟二聯(lián)苗及其用途)。但在臨床免疫程序中，這兩種疫苗一般要間隔七天以上才能免疫另外一種疫苗，這也從側(cè)面說(shuō)明了在現(xiàn)有條件下，這兩種疫苗同時(shí)免疫會(huì)發(fā)生干擾現(xiàn)象。但是由于兩種疫苗的免疫時(shí)間比較接近，在臨床應(yīng)用上，多針次、多劑量、多種免疫程序難以合理安排，既繁瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、增加成本，且容易造成漏種，直接影響免疫效果。
杜喜忠等(“豬藍(lán)耳病免疫對(duì)豬瘟免疫效果影響的試驗(yàn)”，《湖北畜牧獸醫(yī)》，2009 年第7期，第21頁(yè)，郵發(fā)代號(hào)38-352)公開(kāi)了豬藍(lán)耳病弱毒苗與豬瘟活疫苗同時(shí)免疫會(huì)對(duì)豬瘟免疫產(chǎn)生一定的影響，導(dǎo)致豬瘟活疫苗抗體滴度會(huì)降低1-2個(gè)滴度。發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明目的在于提供一種治療和預(yù)防豬瘟、豬藍(lán)耳病的疫苗組合物，，解決現(xiàn)有疫苗同時(shí)免疫時(shí)會(huì)產(chǎn)生干擾的問(wèn)題，提供了該疫苗組合物中兩類(lèi)抗原的最佳配比。
本發(fā)明的主要目的在于提供一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括豬瘟病毒抗原和豬藍(lán)耳病病毒抗原，其中，所述豬瘟病毒為豬瘟兔弱毒化株，所述豬藍(lán)耳病抗原為高致病性豬藍(lán)耳病病毒，所述豬藍(lán)耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為100 1—100 10。
優(yōu)選地，所述豬藍(lán)耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為100 3—100 10。
優(yōu)選地，所述豬藍(lán)耳病抗原包括HuM-Fl 12株、附00及41_1 株、1'廁492株活的病毒。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括豬瘟病毒抗原和豬藍(lán)耳病抗原，其中，所述豬瘟病毒為豬瘟兔弱毒化株，所述豬藍(lán)耳病抗原為經(jīng)典豬藍(lán)耳病病毒，所述豬藍(lán)耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為100 1-1000 I。
優(yōu)選地，所述豬藍(lán)耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為100 1-300 I。
優(yōu)選地，所述豬藍(lán)耳病抗原包括ATCCVR-2332株、CH-1R株、R98株活的病毒。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種制備所述疫苗組合物的方法，所述制備方法包括
培養(yǎng)增殖豬瘟病毒，制備所述豬瘟病毒抗原；
培養(yǎng)增殖豬藍(lán)耳病病毒，制備所述豬藍(lán)耳病病毒抗原；
按照所述豬藍(lán)耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例100 1-100 10進(jìn)行配比， 制備所述疫苗組合物。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種制備所述疫苗組合物的方法，所述制備方法包括
培養(yǎng)增殖豬瘟病毒，制備所述豬瘟病毒抗原；
培養(yǎng)增殖豬藍(lán)耳病病毒，制備所述豬藍(lán)耳病病毒抗原；
按照所述豬藍(lán)耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例100 1-1000 I進(jìn)行配比，制備所述疫苗組合物。
本發(fā)明的還一目的·在于提供所述疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬瘟和豬藍(lán)耳病藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明通過(guò)調(diào)整兩種抗原之間的配比關(guān)系，找出了可以完全消除兩種抗原之間干擾作用的最佳抗原配比，真正做到了消除兩種抗原之間的免疫干擾作用，達(dá)到一針預(yù)防兩種傳染病的目的。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
本發(fā)明實(shí)施例1 6中以豬高致病性藍(lán)耳病HuN4-F112毒株、JXAl-R毒株、 TJM-F92毒株為例說(shuō)明豬瘟、藍(lán)耳病全病毒抗原配比關(guān)系對(duì)免疫效果影響；實(shí)施例7 10 中以豬藍(lán)耳病經(jīng)典毒株CH-1R、R98株為例說(shuō)明豬瘟、藍(lán)耳病全病毒抗原配比關(guān)系對(duì)免疫效果影響。下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
實(shí)施例1豬瘟病毒抗原液的制備
1.將長(zhǎng)成良好單層的對(duì)豬瘟病毒(豬瘟兔化弱毒株由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保藏， 保藏號(hào)AV1412)高敏感的ST細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)用含O. 125%胰酶和O. 03% EDTA的消化液， 進(jìn)行消化分散，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以合適的密度接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入1. 5-5% FBS的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)按照M. O.1. = O. 01-0. 6接毒劑量加入種毒，進(jìn)一步優(yōu)選接毒劑量為M. O.1.= O. 1-0. 6，進(jìn)一步優(yōu)選接毒劑量為M. O.1. = O. 2-0. 4，置于34_37°C溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)一步優(yōu)選培養(yǎng)溫度為34-35 °C。
2.培養(yǎng)三天后進(jìn)行第一次收毒，收毒后補(bǔ)加1. 5-3% FBS的細(xì)胞維持液，以后每隔 2天收毒一次，可連續(xù)收毒5次。收毒后將抗原混合置于-20°C儲(chǔ)藏。
3.將5次收獲的病毒液混合取樣后進(jìn)行TCID5tl和RID測(cè)定，抗原液病毒含量 106_ 5TCID5ciAil (免疫熒光法)，兔體感染劑量應(yīng)不低于500，000RID/ml (兔體反應(yīng)熱法)，同時(shí)按照中國(guó)獸藥典2010年版“豬瘟活疫苗”檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，符合規(guī)定。
實(shí)施例2豬藍(lán)耳病高致病性變異株抗原的制備方法
1.制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)將Marc 145或MA104細(xì)胞系經(jīng)EDTA-胰酶消化液分散傳代，以細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，形成致密單層時(shí)，備用，用于繼續(xù)傳代或接種病毒。
2.細(xì)胞毒種的繁殖將藍(lán)耳病HUN4-F112毒株(市售)病毒液，按M.O.1.= O. 001-0. 01的劑量接入已經(jīng)生長(zhǎng)成良好細(xì)胞單層的細(xì)胞瓶，進(jìn)一步優(yōu)選接毒劑量為 M. O.1. = O. 005-0. 01，吸附I小時(shí)后，加入細(xì)胞維持液于細(xì)胞系單層，繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)70-80% 細(xì)胞出現(xiàn)病變后收獲，收獲的毒液凍融1-2次后置-20°C以下保存，取少量做半成品檢驗(yàn)， 抗原液病毒含量106_ 5TCID5cZml，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)均符合規(guī)定。
將藍(lán)耳病JXAl-R毒株(市售)病毒液，按M. O.1. = O. 001-0. 01的劑量接入已經(jīng)生長(zhǎng)成良好細(xì)胞單層的細(xì)胞瓶，進(jìn)一步優(yōu)選接毒劑量為M. O.1. = O. 005-0. 01，吸附I小時(shí)后，加入細(xì)胞維持液于細(xì)胞系單層，繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)70-80%細(xì)胞出現(xiàn)病變后收獲，收獲的毒液凍融1-2次后置_20°C以下保存，取少量做半成品檢驗(yàn)，抗原液病毒含量107_°TCID5(l/ml，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)均符合規(guī)定。
將藍(lán)耳病TJM-F92毒株(市售)病毒液，按M. O.1. = O. 001-0. 01的劑量接入已經(jīng)生長(zhǎng)成良好細(xì)胞單層的細(xì)胞瓶，進(jìn)一步優(yōu)選接毒劑量為M. O.1. = O. 005-0. 01，吸附I小時(shí)后，加入細(xì)胞維持液于細(xì)胞系單層，繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)70-80%細(xì)胞出現(xiàn)病變后收獲，收獲的毒液凍融1-2次后置_20°C以下保存，取少量做半成品檢驗(yàn)，抗原液病毒含量106_5TCID5cZml， 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)均符合規(guī)定。
實(shí)施例3豬瘟、豬高致病性藍(lán)耳病(HuM-Fl 12、JXA1-R、TJM-F92)抗原與豬瘟病毒抗原不同配比后制備成二聯(lián)疫苗組合物
將實(shí)施列I制 備好的豬瘟病毒抗原(病毒含量106_5TCID5(l/ml)，實(shí)施例2制備好的三種豬藍(lán)耳病病毒抗原分別按照表I的抗原含量進(jìn)行配比，然后與等量的凍干保護(hù)劑混合，制成豬藍(lán)耳病、豬瘟二聯(lián)活疫苗疫苗組合物，具體情況見(jiàn)表I。
表I豬藍(lán)耳病抗原、豬瘟抗原的不同配比及分組
權(quán)利要求
1.一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括豬瘟病毒抗原和豬藍(lán)耳病抗原，其中，所述豬瘟病毒為豬瘟兔弱毒化株，所述豬藍(lán)耳病抗原為高致病性豬藍(lán)耳病病毒，所述豬藍(lán)耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為100 1—100 10。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述豬藍(lán)耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為 100 3—100 10。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述豬藍(lán)耳病抗原包括HUN4-F112株、NVDC-JXA1-R 株、TJM-F92 株活的病毒。
4.一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括豬瘟病毒抗原和豬藍(lán)耳病抗原，其中，所述豬瘟病毒為豬瘟兔弱毒化株，所述豬藍(lán)耳病抗原為經(jīng)典豬藍(lán)耳病病毒，所述豬藍(lán)耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為100 1-1000 I。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其中，所述豬藍(lán)耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為 100 1-300 I。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其中，所述豬藍(lán)耳病抗原包括ATCCVR-2332株、CH-1R株、R98株活的病毒。
7.一種制備權(quán)利要求1所述疫苗組合物的方法，所述制備方法包括 培養(yǎng)增殖豬瘟病毒，制備所述豬瘟病毒抗原； 培養(yǎng)增殖豬藍(lán)耳病病毒，制備所述豬藍(lán)耳病病毒抗原； 按照所述豬藍(lán)耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例100 1--100 10進(jìn)行配比，制備所述疫苗組合物。
8.一種制備權(quán)利要求4所述疫苗組合物的方法，所述制備方法包括 培養(yǎng)增殖豬瘟病毒，制備所述豬瘟病毒抗原； 培養(yǎng)增殖豬藍(lán)耳病病毒，制備所述豬藍(lán)耳病病毒抗原； 按照所述豬藍(lán)耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例100 1-1000 I進(jìn)行配比，制備所述疫苗組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 3所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬瘟和豬藍(lán)耳病藥物的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求4 6所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬瘟和豬藍(lán)耳病藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，該疫苗組合物包括豬瘟病毒抗原和豬藍(lán)耳病抗原，其中，該豬瘟病毒為豬瘟兔弱毒化株，該豬藍(lán)耳病抗原為高致病性豬藍(lán)耳病病毒，該豬藍(lán)耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為100∶1—100∶10，該疫苗組合物可以消除兩種抗原之間的干擾作用，達(dá)到一針預(yù)防兩種傳染病的目的，大大減少了免疫次數(shù)及動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61P31/14GK103041384SQ20121059033
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月29日
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