專利名稱：用于治骨質(zhì)疏松癥和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白及編碼該融合蛋白的核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種融合蛋白及編碼該融合蛋白的核酸。
背景技術(shù)：
老年人骨質(zhì)疏松發(fā)病率較高，全球有2億骨質(zhì)疏松患者，并且女性多于男性。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的標(biāo)準(zhǔn)，美國(guó)國(guó)家健康和營(yíng)養(yǎng)調(diào)查(NHANES III，1988 1994年)結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量，50歲以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他們的一生中都會(huì)出現(xiàn)骨質(zhì)疏松性骨折，一旦患者經(jīng)歷了第一次骨質(zhì)疏松性骨折，繼發(fā)性骨折的危險(xiǎn)明顯加大。中國(guó)老年人居于世界首位，現(xiàn)有骨質(zhì)疏松癥患者9000萬(wàn)，占總?cè)丝诘?. 1%。隨著社會(huì)老齡化的進(jìn)程，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，預(yù)計(jì)到2050年將增加到2. 21億，那時(shí)全世界一半以上的骨質(zhì)疏松性骨折將發(fā)生在亞洲，絕大部分在中國(guó)。有學(xué)者 對(duì)1995 1996年美國(guó)骨質(zhì)疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年發(fā)生數(shù)進(jìn)行調(diào)查顯示，每年發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折150萬(wàn)次，其中椎體骨折70萬(wàn)次，腕部骨折20萬(wàn)次，髖部骨折30萬(wàn)次，其它骨折30萬(wàn)次。肥胖與骨量關(guān)系臨床觀察表明，肥胖與骨密度(BMD)提高有夫。肥胖是骨量的保護(hù)因素，超重和肥胖的婦女絕經(jīng)后較同齡非超重婦女骨量高且骨丟失較慢。體重下降是絕經(jīng)早期骨丟失的危險(xiǎn)因素，提高體重指數(shù)可減緩絕經(jīng)后骨丟失。但肥胖也常常引發(fā)高血糖、高血壓、高血脂、高血粘、高尿酸、高胰島素血癥、冠心病、腦卒中、下肢靜脈曲張、脂肪肝、膽石癥、睡眠呼吸暫停癥、糖尿病、痛風(fēng)癥及關(guān)節(jié)炎，是很多疾病的誘因之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明既要降低肥胖者的體重，使之遠(yuǎn)離高血糖、高血壓、高血脂、高血粘、高尿酸、高胰島素血癥、冠心病、腦卒中、下肢靜脈曲張、脂肪肝、膽石癥、睡眠呼吸暫停癥、糖尿病、痛風(fēng)癥及關(guān)節(jié)炎等風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)又增加其骨量，避免骨質(zhì)疏松的發(fā)生，而提供的一種用于治骨質(zhì)疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白及編碼該融合蛋白的核酸。本發(fā)明用于治骨質(zhì)疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO 2所示。本發(fā)明上述用于治骨質(zhì)疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸序列如SEQID NO 1 所示。本發(fā)明OGP-rhL印tin融合蛋白采用人為改造的L印tin和成骨生長(zhǎng)肽基因編碼翻譯而成。具有降低使用者體重，并防治骨質(zhì)疏松的效果。本發(fā)明用于治骨質(zhì)疏松和肥胖的OGP-rhL印tin融合蛋白微生物制劑，不產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，使用安全。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式用于治骨質(zhì)疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。本實(shí)施方式用于治骨質(zhì)疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸序列如SEQID NO 1所示，該核酸序列由生物工程公司合成，制成含有融合蛋白的核酸的質(zhì)粒載體pUC(0GP/0bese，)。將pUC (0GP/0bese’)載體用BamH I和EcoR I雙酶切出來(lái)(酶切反應(yīng)體系如表I所示，酶切反應(yīng)在37°C條件下反應(yīng)10h，然后1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNAGEL EXTRACTION KIT純化回收)，并用BamHI和EcoR I雙酶切pGEX_6P_l (酶切反應(yīng)體系如表2所示，酶切反應(yīng)在37°C條件下反應(yīng)10h，然后0. 6%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNAGEL EXTRACTION KIT純化回收)；再將本實(shí)施方式用于治骨質(zhì)疏松和肥胖的OGP-rhL印tin融合蛋白的DAN片段(0GP/0bese’)與經(jīng)過雙酶切的載體pGEX_6P_l的連接(連接反應(yīng)體系 如表3所示)。表I
pUC (OGP/Obese，)20 ^il
IOXM buffer6[il
「 nBamHX3u,l___
EcoR I3(j,l
不含 DNA 酶的 ddH2028(^1表2
載體 pGEX-6P-l20(.1l
10XM buffer6 pi
BamUl3}il_；_
KcoR I3‘ul
不含DNA酶的ddH2028^1表3
雙酶切的載體pGEX-6P-l3 ^il
融合蛋白的DNA片段\3^\~10 X T4 DNA 連接酶 buffer20 T4 DNA連接酶20
融合蛋白的DAN片段與載體pGEX-6P-l 16°C放置連接過夜，得到載體pGEX_0GP/Obese’ ；然后將載體pGEX-OGP/Obese’轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，選擇陽(yáng)性重組子命名為大腸桿菌 BL21 (DE3-0GP/0bese，)。載體pGEX-6P-l上不含有Kpn I酶切位點(diǎn)，本實(shí)施方式合成的pGEX-OGP/Obese’均能為Kpn I單酶切開,說明本實(shí)施方式用于治骨質(zhì)疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白基因成功導(dǎo)入質(zhì)粒PGEX-6P-1中。隨機(jī)挑取大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/0bese> )菌落37°C過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)DNA，用Kpn I進(jìn)行單酶切，并用相應(yīng)的空白質(zhì)粒PGEX-6P-1作為對(duì)照，將含有Kpn I酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序。測(cè)序工作委托生物公司進(jìn)行，大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/0beSe’)內(nèi)含有SEQ ID NO 1 所示 DNA。將大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/0bese，)置于LB培養(yǎng)基30°C環(huán)境條件下培養(yǎng)18h，然后采用GST標(biāo)簽融合蛋白法進(jìn)行蛋白的分離純化，本實(shí)施方式用于治骨質(zhì)疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的純度為98%，融合蛋白的表達(dá)量為38. 7%。本實(shí)施方式融合蛋白(OGP-rhLeptin融合蛋白)治療骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)取雌性SD大鼠在無(wú)菌條件下摘除雙側(cè)卵巢，12周后取存活健康大鼠40只，隨機(jī)分為5組(陽(yáng)性對(duì)照組1、陽(yáng)性對(duì)照組2、融合蛋白實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組)，每組8只。另取雌性SD大鼠切除雙側(cè)一小塊脂肪，12周后隨機(jī)取存活健康大鼠8只作為假手術(shù)對(duì)照組。共計(jì)6組，分別口服以下藥物假手術(shù)對(duì)照組質(zhì)量濃度為0. 5%的CMC-Na溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；陰性對(duì)照組質(zhì)量濃度為0. 5%的CMC-Na溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；融合蛋白實(shí)驗(yàn)組質(zhì)量濃度為0. 5%的OGP-rhLeptin融合蛋白溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；(獲得的用于治療骨質(zhì)疏松和血栓的OGP-rhLeptin融合蛋白用無(wú)菌水溶解)陽(yáng)性對(duì)照組1:阿侖膦酸鈉(Alen) 5mg/kg ；陽(yáng)性對(duì)照組2 :質(zhì)量濃度為0. 5%的OGP蛋白溶液，灌胃劑量為5ml/kg。陽(yáng)性對(duì)照組3 :質(zhì)量濃度為0. 5%的rhL印tin溶液，灌胃劑量為5ml/kg。連續(xù)給藥三個(gè)月，處死后取大鼠股骨頭，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金剛石鋸將股骨頭矢面鋸開，取其一片，經(jīng)清洗，10%次氯酸鈉浸泡6h，超聲清洗15min，乙醇梯度脫水，乙醚浸泡，干燥，離子濺射鍍膜，SX-40掃描電鏡觀察，加速電壓20kV。觀察骨質(zhì)疏松治療對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，結(jié)果表明融合蛋白實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組I和陽(yáng)性對(duì)照組2都具有治療骨質(zhì)疏松的作用，且融合蛋白實(shí)驗(yàn)組的效果最好。表4骨小梁寬度的比較和骨面積(X土SD)
權(quán)利要求
1.用于治骨質(zhì)疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白，其特征在于用于治骨質(zhì)疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
2.編碼權(quán)利要求1用于治骨質(zhì)疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸，其特征在于該核酸的序列如SEQ ID N0:1所示。
全文摘要
用于治骨質(zhì)疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白及編碼該融合蛋白的核酸，它涉及一種融合蛋白及編碼該融合蛋白的核酸。解決目前尚無(wú)同時(shí)有效治療骨質(zhì)疏松和肥胖藥品的缺陷。用于治骨質(zhì)疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。該融合蛋白核酸的序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明可用于醫(yī)藥領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61P19/10GK103012598SQ201210585618
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者余瓊 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)