專利名稱：碳酰肼的藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及吡唑酰腙衍生物在抑制血管內(nèi)皮細胞衰老和凋亡中的應(yīng)用；尤其涉及 (E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在制備抑制血管內(nèi)皮細胞衰老和凋亡藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
(E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6_氯吡啶)甲基)_3_ (4_甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼結(jié)構(gòu)式如下分子式=C24H2tlClN5O3分子量461.90性狀黃色固體。目前，有關(guān)吡唑酰腙衍生物鮮有報道，尤其未見(E)-N_(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在血管內(nèi)皮細胞衰老及凋亡方面的作用以及相關(guān)的藥理學的研究與應(yīng)用的報道。針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在制備抑制血管內(nèi)皮細胞衰老和凋亡藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼在制備抑制血管內(nèi)皮細胞衰老和凋亡藥物中的應(yīng)用；其中 能有效抑制凋亡、核片段化和DNA凝縮的(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼的濃度是40 80mg/L。本發(fā)明的(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在抑制血管內(nèi)皮細胞衰老和凋亡中具有明顯作用，為新型心血管藥物的開發(fā)提供了誘人前景。為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)及本發(fā)明所述化合物的作用效果，下面結(jié)合
發(fā)明內(nèi)容(E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼的藥理實驗及結(jié)果，來進一步闡述其在抑制血管內(nèi)皮細胞衰老和凋亡中的作用。血管內(nèi)皮細胞的制備以常規(guī)方法培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞，選取生長狀態(tài)良好的、且處于對數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細胞，備用。觀察(E)-N_(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼對抑制去除血清和生長因子的血管內(nèi)皮細胞衰老和凋亡的影響。1、顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化將所培養(yǎng)的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。正常組細胞用含有血清和生長因子的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)；對照組細胞去處血清和生長因子培養(yǎng)；處理組是將血管內(nèi)皮細胞去除血清和生長因子后，分別加(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1- (3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼，處理M小時和48小時。然后，光鏡下直接觀察血管內(nèi)皮細胞凋亡的形態(tài)學變化和凋亡小體的形成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1- (3- (6_氯吡啶)甲基)_3_ (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理血管內(nèi)皮細胞M和48小時，較之對照組可明顯抑制凋亡小體的形成以及凋亡的形態(tài)學變化(見圖1)。2、熒光顯微鏡觀察細胞核凝縮及核碎裂情況將所培養(yǎng)的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。正常組細胞用含有血清和生長因子的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)；對照組細胞去處血清和生長因子培養(yǎng)；處理組是將血管內(nèi)皮細胞去除血清和生長因子后，加(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理M小時。 然后對各組進行AO染色，在熒光顯微鏡下觀察血管內(nèi)皮細胞凋亡時，細胞核DNA的凝縮及核碎裂情況。結(jié)果顯示處理組中細胞核DNA凝縮及碎裂較對照組減少(見圖2)。3、用MTT法檢測細胞琥珀酸脫氫酶的活性，以判斷血管內(nèi)皮細胞生長情況將血管內(nèi)皮細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，經(jīng)不同濃度(40，60，80 μ g/ml) (E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理后，在M小時和48小時分別用MTT法測琥珀酸脫氫酶活性，計算存活率，存活細胞％ =(處理組OD值/對照組OD值)X 100% (以不含細胞的培養(yǎng)液為空白組調(diào)零)。結(jié)果表明處理組細胞存活率較對照組顯著升高且呈劑量依賴性。(E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6_氯吡啶)甲基)_3_ (4_甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼對細胞生長的影響結(jié)果見下表藥物(|J g/ml) M小時細胞存活率(％)48小時細胞存活率(％)
對照組 54. 7±3. 1046. 89±5. 46
DMSO 組 54. 60 土 3. 5045. 16 土 5. 26 藥物處理組
40 66. 79±4. 7352. 12±3. 22 60 72. 46±5. 5263. 32±6. 43 _80_75. 72±4. 14 _ 65. 71±2. 57_4、Tunel染色標記凋亡細胞將所培養(yǎng)的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。正常組細胞用含有血清和生長因子的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)；對照組細胞去處血清和 生長因子培養(yǎng)；處理組是將血管內(nèi)皮細胞去除血清和生長因子后，加 )-N-(2-羥基苯亞 甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理M小吋。 然后，用福爾馬林固定25分鐘，0.2% Triton X-100處理5分鐘，每孔加入50 yl rTdr孵 育液，37°C下孵育1小吋，SSC終止反應(yīng)，檢測標記凋亡細胞。分別計數(shù)正常組細胞、對照組 細胞、處理組細胞，計算其陽性率。結(jié)果顯示(見圖3):正常組細胞，用含有血清和生長因子的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)M小時幾乎無陽性細 胞；對照組細胞，去除血清和生長因子M小吋，陽性細胞較多；處理組細胞，用￠) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)_3_ (4_甲氧 基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理M小吋，陽性細胞較對照組顯著降低。提示⑶-N_(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3バ4_甲氧基苯 基)-IH-吡唑-5-碳酰胼可抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡。5、衰老相關(guān)的0 -半乳糖苷酶染色，以判斷細胞衰老情況將所培養(yǎng)的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。正常組細胞用含有血清和生長因子的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)；對照組細胞去處血清和 生長因子培養(yǎng)；處理組是將血管內(nèi)皮細胞去除血清和生長因子后，加 )-N-(2-羥基苯亞 甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理M小吋。 然后，用￠-半乳糖染液染色后觀察。隨機選取正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞中的 各10個視野，計數(shù)細胞總數(shù)和陽性細胞數(shù)，計算陽性率。結(jié)果顯示(見圖4):正常組細胞，含有血清和生長因子的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)M小吋，陽性率較低；對照組細胞，去處血清和生長因子陽性率較正常細胞組陽性率上升；處理組細胞，去處血清和生長因子用-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡 啶)甲基)-3-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理M小吋，陽性率下降。提示⑶-N_(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3バ4_甲氧基苯 基)-IH-吡唑-5-碳酰胼降低了陽性細胞比率，能抑制血管內(nèi)皮細胞衰老。6、(E)-N-Q-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3バ4_甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼對膜整聯(lián)蛋白β 4表達的影響將所培養(yǎng)的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。對正常組細胞、對照組細胞和處理組三組細胞膜整聯(lián)蛋白β 4的表達進行熒光定量分析，結(jié)果見圖5。(注#ρ < 0. 05比照正常組，*ρ<0. 05比照對照組)。正常組細胞，含有血清和生長因子的Μ199培養(yǎng)液培養(yǎng)M小時，膜整聯(lián)蛋白β 4表達較低；對照組細胞，去除血清和生長因子后，膜整聯(lián)蛋白β4表達表達升高；處理組細胞，去除血清和生長因子后用(E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1- (3- (6_氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼處理M小時，膜整聯(lián)蛋白β4表達表達下降。提示加入(E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6_氯吡啶)甲基)_3_ (4_甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼可以降低膜整聯(lián)蛋白β 4在去除血清和生長因子培養(yǎng)細胞中的表達，抑制血管內(nèi)皮細胞衰老。7、(Ε)-Ν_(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼對活性氧水平的影響將所培養(yǎng)的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。對正常組細胞、對照組細胞和處理組三組細胞活性氧水平進行熒光定量分析，顯微鏡下結(jié)果見圖6。正常組細胞，含有血清和生長因子的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)M小時，活性氧水平表達較低；對照組細胞，去除血清和生長因子M小時，活性氧水平比正常組顯著升高；處理組細胞，用(E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6_氯吡啶)甲基)_3_ (4_甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理細胞M小時后，活性氧表達水平比對照組有所降低但是無明顯區(qū)別。結(jié)果表明加入(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)_3_(4_甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼可以降低活性氧水平但不顯著，一定程度上能抑制血管內(nèi)皮細胞衰老。通過上述實驗及其結(jié)果，可以得出如下結(jié)論(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼濃度在40-80mg/L時，能有效抑制血管內(nèi)皮細胞衰老和凋亡，預示 (E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在制備抑制血管內(nèi)皮細胞衰老和凋亡藥物以及治療心血管疾病藥物中有很大的開發(fā)應(yīng)用前景。


圖1 :(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼處理血管內(nèi)皮細胞的顯微鏡下結(jié)果。其中=A 示正常組(48小時)；B 示對照組(48小時)；C 示經(jīng)(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理后的血管內(nèi)皮細胞(48小時)。圖2 熒光顯微鏡下所示(E)-N_(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼處理M小時后的血管內(nèi)皮細胞中核凝縮及核碎裂的結(jié)果。其中A為正常組；B為對照組；C為(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶) 甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理組。圖3 顯示Tunel染色標記凋亡細胞。其中A為正常組04小時)；B為對照組04小時)；C為處理組Q4小時)。圖4 β -半乳糖苷酶染色，顯示細胞衰老情況。其中Α為正常組04小時)；B為對照組04小時)；C為處理組Q4小時)。圖5 細胞膜整聯(lián)蛋白β 4的表達熒光定量分析結(jié)果統(tǒng)計。圖6 顯微鏡下示(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼對活性氧水平影響的結(jié)果。其中A為正常組04小時)；B為對照組04小時)；C為處理組Q4小時)。
具體實施例方式實施例1(E)-N_(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼的制備1)在100毫升的圓底燒瓶中加入0.690克碳酸鉀(0. 005摩爾)，1. 230克3_ (4_甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-甲酸乙酯(0.005摩爾)，0.810克2-氯-5-氯甲基吡啶(0.005 摩爾)以及乙腈(25毫升)，裝置回流冷凝器，上部接干燥管。加熱回流4小時，反應(yīng)至原料完全消耗，用TLC檢測反應(yīng)終點。減壓濃縮，去除溶劑，加入乙酸乙酯(30毫升)，過濾，濾液濃縮，用乙酸乙酯-石油醚(V/ V = 1/2)作洗脫劑硅膠柱色譜分離剩余物(100 200目硅膠)，得到1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基)吡唑-5-羧酸乙酯；2)在0.371克(0.001摩爾)1-(3-(6-氯吡啶)甲基)_3_甲氧基苯基)吡唑-5-羧酸乙酯的甲醇(5毫升)溶液中加入1. 2毫升80%的水合胼，攪拌回流反應(yīng)1小時，反應(yīng)至原料完全消耗，用TLC檢測反應(yīng)終點。靜置過夜，析出固體，過濾，減壓抽濾得粗產(chǎn)物；用8毫升乙醇重結(jié)晶制得高純度1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基-IH-吡唑-5-碳酰胼；3)將得到的0.361克(0.001摩爾)1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼與0. 122克(0. 001摩爾)水楊醛加入到10毫升乙醇中，回流反應(yīng)3小時，反應(yīng)至原料完全消耗，用TLC檢測反應(yīng)終點；靜置過夜，析出白色固體，過濾，減壓抽濾得粗產(chǎn)物；用12毫升乙醇重結(jié)晶制得高純度(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼。核磁共振數(shù)據(jù)如下1H-NMR (400MHz, CDC13+DMS0) δ :3. 77 (s, 3H, OCH3)，5. 76 (s, 2H, CH2)，
6.81-6. 92 (m, 5H, ArH, OH)，7. 20-7. 22 (m, 4H, ArH, PyH, 4-H)，7. 66 (d, J = 8. 4Hz,2H, ArH)，
7.68 (dd, J = 2. 2Hz，8. 4Hz, 1Η, PyH), 8. 35 (d, J = 2. 2Hz, 1H, PyH), 8. 45 (s, 1H, = CH)， 11. 85(s，1H, NH)。
紅外光譜數(shù)據(jù)如下IR(KBr)v :3560 (OH)，3209-2833 (NH)，1680 (C = 0) cm_10質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下MS(EI) :m/z 462·4(Μ+Η)+。實施例2將所培養(yǎng)的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。正常組細胞用含有血清和生長因子的Μ199培養(yǎng)液培養(yǎng)；對照組細胞去處血清和生長因子培養(yǎng)；處理組細胞去除血清和生長因子后用40 80mg/L濃度的(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理。三組細胞培養(yǎng)M小時后均用2%的甲醛、0. 5%戊二醛固定5分鐘，之后用不帶β -半乳糖染液洗一次，加入含β -半乳糖的染液在37°C無二氧化碳條件下孵育18- 小時。PBS清洗后觀察。對上述三組細胞隨機各選取10個視野，計數(shù)細胞總數(shù)和陽性細胞數(shù)，計算陽性率 (顯微鏡下結(jié)果見圖4)。結(jié)果顯示，正常組細胞陽性率較低；對照組細胞陽性率較正常組有顯著上升； (E) -N- (2-羥基苯亞甲基)-1-(3- (6-氯吡啶)甲基)-3- (4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理M小時后的處理組細胞其陽性率顯著下降。提示(E)-N-Q-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼降低了陽性細胞比率，表明(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼能抑制血管內(nèi)皮細胞衰老。實施例3將所培養(yǎng)的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。正常組細胞用含有血清和生長因子的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)；對照組細胞去處血清和生長因子培養(yǎng)；處理組細胞去除血清和生長因子后用40 80mg/L濃度的(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理。三組細胞培養(yǎng)M小時后，棄去培養(yǎng)液，用4%的多聚甲醛固定15分鐘。用0. IM PBS清洗后， 加入正常血清封閉液。棄封閉液，加一抗，棄一抗加二抗，37°C下30分鐘，棄去二抗，用0. IM PBS清洗后觀察。對上述三組細胞膜整聯(lián)蛋白β 4的表達進行熒光定量分析。結(jié)果顯示，正常組細胞膜整聯(lián)蛋白β 4表達較低；對照組細胞β 4表達升高；處理組細胞用(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼處理M小時，β 4表達表達顯著下降(細胞膜整聯(lián)蛋白β 4的表達熒光定量分析結(jié)果統(tǒng)計見圖5)。提示(Ε)-Ν-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼可以降低膜整聯(lián)蛋白β 4在去除血清和生長因子培養(yǎng)細胞中的表達，抑制血管內(nèi)皮細胞衰老。實施例4將所培養(yǎng)的細胞分為正常組細胞、對照組細胞和處理組細胞。正常組細胞用含有血清和生長因子的Μ199培養(yǎng)液培養(yǎng)；對照組細胞去處血清和生長因子培養(yǎng)；處理組是將(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼配制成 5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、 100mg/L等濃度，分別加入以去除血清和生長因子的血管內(nèi)皮細胞中，處理M小時。
在倒置顯微鏡下每4小時觀察一次細胞的生長變化，結(jié)果看到對照組細胞不斷地脫離培養(yǎng)板底面而漂浮于培養(yǎng)液中，然后細胞逐漸形成凋亡小體，即發(fā)生典型的細胞凋亡，24小時后僅有7%的細胞存活，β-半乳糖苷酶染色細胞陽性率較高達40% ； 而(Ε)-Ν-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼處理組細胞則較少發(fā)生凋亡，核片段化和DNA凝縮均受到抑制，此時的存活率為67 76%，β-半乳糖苷酶染色細胞陽性率下降至20%。說明(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-1Η-吡唑-5-碳酰胼在所述實驗濃度下，均呈現(xiàn)出抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡和衰老的現(xiàn)象，特別是(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在40 80mg/L 濃度時，能有效抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡和衰老；60士 10mg/L濃度時更為經(jīng)濟。
權(quán)利要求
1. (E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3- -甲氧基苯基)-IH-吡唑-5-碳酰胼在制備抑制血管內(nèi)皮細胞衰老和凋亡藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-碳酰肼在制備抑制血管內(nèi)皮細胞衰老和凋亡藥物中的應(yīng)用；其中能有效抑制凋亡、核片段化和DNA凝縮的(E)-N-(2-羥基苯亞甲基)-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-碳酰肼的濃度是40～80mg/L。本發(fā)明為制備抑制血管內(nèi)皮細胞衰老和凋亡藥物和治療心血管疾病又提供了一條開發(fā)和應(yīng)用的途徑。
文檔編號A61P9/00GK102274225SQ20111016831
公開日2011年12月14日 申請日期2011年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月18日
發(fā)明者常宏文, 張尚立, 張恒, 王麗, 王萍, 馬劍峰 申請人:山東大學