專利名稱：一種甲氧基聚乙二醇-蚓激酶偶聯(lián)物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甲氧基聚乙二醇(mPEG)蚓激酶偶聯(lián)物及其制備方法。具體而言，本發(fā)明涉及利用蚓激酶的氨基與帶有活潑功能基團(tuán)的聚乙二醇衍生物反應(yīng)制備得到的mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物及其制備方法，屬于肽或蛋白質(zhì)的修飾復(fù)合物及其制備的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血栓性疾病的高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率嚴(yán)重威脅人類的生存，溶栓性藥物是治療該病的首選用藥。蝴激酶(Iumbrokinase)是從新鮮蟲丘蝴體內(nèi)提取的一種蛋白酶,具有直接溶解纖維蛋白的纖維酶活性，又具有類似尿激酶的纖溶酶原激活活性，因此既能溶解舊血栓又能抑制新血栓形成,是一種良好的溶栓藥物。
目前國(guó)內(nèi)已有蚓激酶的腸溶口服膠囊制劑上市，用于治療腦血栓、中風(fēng)后遺癥等疾病。但作為溶栓藥物，具有起效快、作用強(qiáng)的特點(diǎn)非常重要，而Fan等人(Fan Q，etal. Some features of intestinal absorption of intact fibrinolytic enzyme III—l.Biochim Biophya Acta, 2001 Jun 15 ；1523(3) :286-292)用免疫組化法研究顯示，該蚓激酶的腸溶口服膠囊只有10-15%完整的蚓激酶EFE-III-I以完整形式被腸上皮細(xì)胞吸收，證明其口服生物利用度很低。針對(duì)此問(wèn)題，目前國(guó)內(nèi)已有蚓激酶注射劑的研究，主要是通過(guò)進(jìn)一步提取純化蚓激酶后制備成凍干粉針，但蚓激酶作為分子量2-4萬(wàn)道爾頓的外源性蛋白，其靜脈應(yīng)用必將引起過(guò)敏反應(yīng)，同時(shí)，過(guò)敏會(huì)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，影響藥效，不利于多次給藥。因此，對(duì)于蚓激酶的新型制劑研究存在迫切需要。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，采用具有活潑功能基團(tuán)的聚乙二醇衍生物與與蚓激酶反應(yīng)，可以得到穩(wěn)定的mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)式如下mPEG-CH2-W-NH-Lumbrokinase
O其中mPEG是甲氧基聚乙二醇，Lumbrokinase是蝴激酶；W是 ||
一C一 O在本發(fā)明的mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物中，mPEG分子量為5000-40000道爾頓，優(yōu)選10000-20000 道爾頓。本發(fā)明的mPEG-蚓激酶是mPEG以共價(jià)鍵方式與蚓激酶連接的偶聯(lián)物。由于聚合物以具有鏈長(zhǎng)分布的混合物制備，因此，分子量通常是指其平均分子量。比如分子量為5000-40000道爾頓的聚乙二醇是指平均分子量為5000-40000道爾頓的聚乙二醇。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供本發(fā)明所述mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物的制備方法，其包括在緩沖液體系下，使具有活潑功能基團(tuán)的mPEG-聚乙二醇與蚓激酶分子反應(yīng)，最后加入甘氨酸終止反應(yīng)，純化，冷凍干燥得到mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物。該制備方法的反應(yīng)原理是利用在緩沖液體系中，蚓激酶的伯氨基與具有活潑功能基團(tuán)的mPEG-聚乙二醇可進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)。在本發(fā)明中，具有活潑功能基團(tuán)的甲氧基聚乙二醇可以選自甲氧基聚乙二醇玻拍酸酯(mPEG-succinimidyl succinate, mPEG-SS)、甲氧基聚乙二醇丙酸酸酯(mPEG-succinimidyl propionate, mPEG-SPA)、甲氧基聚乙二醇玻拍酸亞胺碳酸酯(mPEG-succinimidyl carbonate, mPEG-SC)、甲氧基聚乙二醇 N-輕基玻拍酸亞胺酯(mPEG-N-hydroxysuccinimide, mPEG-NHS)、甲氧基聚乙二醇琥拍酰亞胺酯(mPEG-succinimidyl ester)、甲氧基聚乙二醇對(duì)硝基苯碳酸酯(mPEG-p-nitrophenyl-carbonate)、甲氧基聚乙二醇三氯苯碳酸酯(mPEG-trichlorophenylcarbonate)、甲氧基聚乙二醇苯并三唑碳酸酯(mPEG-benzolriazole carbonate)和甲氧基聚乙二醇氧擬基咪唑(mPEG-oxycarbonyIimi dazoIe)。在本發(fā)明，緩沖液體系是指pH 7. 0-9. 5的緩沖液，選自磷酸緩沖液、硼酸緩沖液、碳酸緩沖液、檸檬酸緩沖液及其混合溶液，優(yōu)選地PH范圍為pH 7. 2-8. 5。 在本發(fā)明的制備方法中，分離純化后的蚓激酶與具有活潑功能基團(tuán)的聚乙二醇的物質(zhì)的量比為I : 3 I : 30。反應(yīng)的溫度為O 25°C，反應(yīng)時(shí)間為l_24h，一般3h即可完成反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間一到，以甘氨酸終止反應(yīng)，采用凝膠排阻法和離子交換法分離反應(yīng)液，即得到mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物。在本發(fā)明的制備方法中，由于反應(yīng)混合物中各組分具有不同的等電點(diǎn)和分子量，因此可以采用各種色譜方法來(lái)純化得到純的mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物，所述色譜方法如離子交換色譜、分子排阻色譜；此外，可以通過(guò)控制反應(yīng)條件(包括反應(yīng)溫度、時(shí)間、活性基團(tuán)的種類、PEG衍生物與蚓激酶的比例、緩沖液的pH以及摩爾濃度)來(lái)獲得單修飾的mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物。得到的mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物的鑒定，可以采用高效液相法、SDS-PAGE等方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供本發(fā)明的mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物在制備治療心腦血管系統(tǒng)疾病、缺血性腦血管疾病、下肢深部靜脈血栓、中風(fēng)、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、突發(fā)性耳聾等疾病的藥物中的用途。所述心腦血管系統(tǒng)疾病包括老年人不穩(wěn)定型心絞痛、冠心病心絞痛、糖尿病并發(fā)冠心病、血液流變性異常、高纖維蛋白原血癥等；所述缺血性腦血管疾病包括腦梗塞、急性腦梗塞、腦梗死后遺癥、缺血性腦血管病等。在本發(fā)明中，如果沒(méi)有特別地說(shuō)明，所采用的術(shù)語(yǔ)都具有本領(lǐng)域已知的含義，所采用的物質(zhì)、制備條件、反應(yīng)條件、儀器、裝置等都是本領(lǐng)域已知的，或者是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述結(jié)合公知常識(shí)可以獲得或得到的。本發(fā)明的mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物的制備方法所采用的連接反應(yīng)工藝簡(jiǎn)單、易于分離產(chǎn)物且安全有效，制備得到的mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物具有在體內(nèi)保留時(shí)間長(zhǎng)，降低了其免疫原性，提高了溶栓藥效。


圖I為實(shí)施例I中，蚓激酶分離純化前粗品的高效液相圖譜，從圖中可以看出，蚓激酶的主峰出現(xiàn)在約12. 3min，前面有幾個(gè)小雜峰，推測(cè)是一些凍干保護(hù)劑或聚合物等。圖2為實(shí)施例I中，分離純化后蚓激酶單體的高效液相圖譜，從圖中能看出，前面基本不存在小雜峰，蚓激酶主峰出現(xiàn)在約12. 4min。
圖3為實(shí)施例I中，用凝膠排阻法分離修飾前的蚓激酶粗品的高效液相圖譜，主要出現(xiàn)了兩個(gè)部分大峰，峰A和峰B，后面雜峰為一些凍干保護(hù)劑和小分子物質(zhì)。對(duì)分離到的峰A和B進(jìn)行體外效價(jià)測(cè)定，結(jié)果峰A代表的物質(zhì)體外活性很小，峰B代表的物質(zhì)體外活性大，取峰B代表的物質(zhì)做下一步純化。圖4為用離子交換法對(duì)實(shí)施例I中的凝膠排阻法所得到蚓激酶峰(峰B)再次進(jìn)行分離后的色譜圖。用離子交換法分離后又出現(xiàn)了分離程度比較好的兩個(gè)峰峰C和峰D。對(duì)兩個(gè)峰分別進(jìn)行體外效價(jià)測(cè)定，結(jié)果顯示峰D代表的物質(zhì)具有體外纖溶活性。圖5為對(duì)實(shí)施例I中，用凝膠排阻法和離子交換法分離純化蚓激酶粗品后得到的四個(gè)部分峰(峰A、峰B、峰C、峰D)的體外效價(jià)測(cè)定結(jié)果圖。結(jié)果表明，峰B和峰D代表的物質(zhì)具有體外栓溶活性。圖6為對(duì)實(shí)施例I中，用凝膠排阻法和離子交換法分離純化蚓激酶粗品后得到的四個(gè)部分峰(峰A、峰B、峰C、峰D)的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖，峰A的分子量很大，接近于·IOOKDa左右，推測(cè)是一些聚合物；峰B為蚓激酶峰，主要有三個(gè)條帶，一個(gè)在35KDa處，一個(gè)在25KDa處，一個(gè)在18KDa處；峰C和峰D為將峰B進(jìn)行進(jìn)一步離子交換分離后得到的兩個(gè)峰，峰C分子量在18KDa左右，但沒(méi)有體外活性，峰D為蚓激酶的主峰，是兩個(gè)分別在35KDa和25KDa處的條帶。圖7為實(shí)施例2中，分子量為10000的甲氧基聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺(mPEG-NHS10000)的高效液相色譜圖，mPEG-NHS10000的峰出現(xiàn)在約13. 3min。圖8為實(shí)施例2中，mPEG-NHS1(l_與蚓激酶反應(yīng)后得到的IiiPEG-NHSicicicici-蚓激酶偶聯(lián)物的高效液相色譜圖，在12. 3min的峰為沒(méi)反應(yīng)完剩余的蚓激酶峰，在13. 2min的峰為沒(méi)反應(yīng)完剩余的mPEG-NHS的峰，前面10. Imin和9. 5min左右出現(xiàn)了兩個(gè)小峰，是mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物的峰。圖9為實(shí)施例3-5中，用不同分子量甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(mPEG-SC)修飾蚓激酶的電泳圖譜，分別用5KDa、10KDa、20KDa的mPEG-SC修飾蚓激酶單體，從電泳圖譜中可以看出，不同分子量的mPEG-SC修飾蚓激酶的程度都有所不同，用mPEG-SC5_修飾后，殘留的蚓激酶量最少，說(shuō)明大部分蚓激酶都接上了 mPEG-SC5_，但可能分子量比較??；用mPEG-SC1(l_修飾后，有一半多的蚓激酶已接上了 IiiPEG-SCicicicici，有一個(gè)蚓激酶分子接上一個(gè)分子mPEG-SC·。。的，也有接上兩個(gè)或三個(gè)分子mPEG-SC·。。的，出現(xiàn)不同分子量的mPEG-蚓激酶產(chǎn)物；用mPEG-SC2_修飾后，出現(xiàn)了分子量較大的產(chǎn)物，蚓激酶的主峰分子量在35KDa左右，修飾產(chǎn)物主要都在分子量75KDa處出現(xiàn)，說(shuō)明每個(gè)蚓激酶分子平均接上了 2個(gè)分子mPEG-SC^·，但將近一半的蚓激酶沒(méi)有被修飾。結(jié)果說(shuō)明，mPEG-SC5000雖然分子量相對(duì)小，但修飾率比較高，而且有的蚓激酶分子能接上2-3個(gè)分子的mPEG-SC，使分子量增大很多，能起到一定長(zhǎng)效循環(huán)作用；mPEG-SC1Q_分子量大小適中，進(jìn)入體內(nèi)之后，也具有較好的長(zhǎng)循環(huán)作用，但修飾率在50-70%左右；mPEG-SC2(l_修飾的蚓激酶分子量最大，進(jìn)入體內(nèi)能起到很好的長(zhǎng)循環(huán)作用，但修飾率相對(duì)低，因此，認(rèn)為分子量為5KDa的mPEG-SC修飾蚓激酶為最佳選擇。圖10為實(shí)施例5中，將分離純化后的蚓激酶用mPEG-SC2(l_修飾后的電泳圖譜，從結(jié)果中可以看出，修飾后的主要峰在75KDa處，而蚓激酶主要峰在35KDa處，說(shuō)明平均有一個(gè)分子的蚓激酶連接上了兩個(gè)分子的mPEG-SC2Q_。
圖11為實(shí)施例7中，mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物的體外活性測(cè)定結(jié)果圖，用中國(guó)食品藥品檢定研究院的蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定蚓激酶粗品、實(shí)施例I的分離純化后蚓激酶單體、實(shí)施例3的mPEG-SC5_-蚓激酶偶聯(lián)物、實(shí)施例4的IiiPEG-SCicicicici-蚓激酶偶聯(lián)物、實(shí)施例5的HiPEG-SC2cicicicr蚓激酶偶聯(lián)物的體外活性。結(jié)果活性測(cè)定結(jié)果如下蚓激酶粗品為16000U/mg、分離純化后蚓激酶單體為19995U/mg、mPEG-SC5_-蚓激酶偶聯(lián)物為12426U/mg,mPEG-SC10000-蚓激酶偶聯(lián)物為 11114U/mg、mPEG-SC2(l(l(l(l-蚓激酶偶聯(lián)物為 9869U/mg。圖12為實(shí)施例8中，不同投料比mPEG-SC2(l_修飾蚓激酶的結(jié)果比較圖，其中a圖為用銀染法染色的結(jié)果圖，b圖為用考馬斯亮蘭染色的結(jié)果圖。從結(jié)果中可以看出，隨著投料比例增加，修飾程度也隨著變大，而最佳修飾投料比為I : 25。圖13為實(shí)施例9中，mPEG-SC2_-蚓激酶合成產(chǎn)物的體內(nèi)活性測(cè)定結(jié)果圖，從圖 中能看出，空白模型組的黑尾程度比較嚴(yán)重；蚓激酶原料藥(對(duì)照)組的黑尾程度跟模型組相比，具有明顯改善；mPEG-SC2_-蚓激酶(藥物)組的黑尾程度與蚓激酶原料藥組相比，具有一定改善作用。
具體實(shí)施例方式給出以下實(shí)施方式旨在解釋本發(fā)明的方案，而不意味著以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例I.用蛋白純化儀純化蚓激酶粗品將20mg蚓激酶用O. IM磷酸鈉(pH7. 4)溶解，配制成濃度為10mg/mL，利用superdex75凝膠柱,用Akta Purify 10蛋白純化儀進(jìn)行分子篩分離。得到兩個(gè)部分峰(峰A和峰B)，做體外效價(jià)測(cè)定，把有體外活性的峰(峰B)保留，沒(méi)有活性或活性極少的峰(峰 A)棄掉，得到的有體外活性的B峰，再用Hi Trap DEAE FF離子交換柱進(jìn)行分離，分離出來(lái)兩個(gè)部分的峰(峰C和峰D)，再做體外效價(jià)測(cè)定，把有體外溶栓活性的峰(峰C)收集，冷凍干燥，最后得到的有體外活性的D峰認(rèn)為是我們想要的分離純化后的蚓激酶單體峰。凝膠排阻法和離子交換色譜法分離出來(lái)的四個(gè)部分的峰都做電泳分析，查看分子量(見(jiàn)附圖1-6)，蚓激酶粗品分離純化后得到的純化物進(jìn)行冷凍干燥，備用。實(shí)施例2. mPEG-NHS10000-蚓激酶偶聯(lián)物的制備將20mg用上述實(shí)施例I的方法進(jìn)行分離純化后得到的蚓激酶，用5mM pH醋酸鈉緩沖液(pH 7. O)溶解，配制成濃度為5mg/mL，加入IOOmg的mPEG-NHS1(l_ (摩爾比為蚓激酶mPEG-NHS1Q_ = I 5)，在冰浴下(0°C )反應(yīng)2h，加入甘氨酸攪拌IOmin終止反應(yīng)，得到mPEG-NHS1(l_-蚓激酶偶聯(lián)物。將反應(yīng)前后的溶液用高效液相檢測(cè)，進(jìn)行比較。計(jì)算得到的修飾率為61. 5% (見(jiàn)附圖7-8)。實(shí)施例3. mPEG-SC5000-蚓激酶偶聯(lián)物的制備將5mg用上述實(shí)施例I的方法進(jìn)行分離純化后得到的蚓激酶，用O. IM磷酸鈉(pH7. 4)溶液配制成濃度10mg/ml的溶液；按蚓激酶mPEG摩爾比I : 5加入mPEG_SC5。。。，以氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8. O，在25°C反應(yīng)2h，加入O. 5M甘氨酸終止反應(yīng)，得到mPEG-SC5_-蚓激酶偶聯(lián)物，將該偶聯(lián)物的溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，查看結(jié)果(見(jiàn)附圖9)。實(shí)施例4. mPEG-SC10000-蚓激酶偶聯(lián)物的制備將40mg用上述實(shí)施例I的方法進(jìn)行分離純化后得到的蚓激酶，用O. IM磷酸鈉(pH7. 4)溶液配制成濃度為3mg/mL，加入IOOmgmPEG-SClticicici, 4°C反應(yīng)3h，加入甘氨酸攪拌IOmin終止反應(yīng)，得到mPEG-SC1(l_-蚓激酶偶聯(lián)物，將該偶聯(lián)物的溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，查看結(jié)果(見(jiàn)附圖9)。 實(shí)施例5. mPEG-SC20000-蚓激酶偶聯(lián)物的制備將20mg用上述實(shí)施例I的方法進(jìn)行分離純化后得到的蚓激酶，用O. IM磷酸鈉(pH7. 4)溶液配制成濃度為5mg/mL,加入40mgmPEG-SC2_Q,室溫反應(yīng)5h,加入甘氨酸攪拌IOmin終止反應(yīng)。得到mPEG-SC2(l_-蚓激酶偶聯(lián)物，將該偶聯(lián)物的溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，查看結(jié)果(見(jiàn)附圖9-10)。
實(shí)施例6. mPEG-NHS30000-蚓激酶偶聯(lián)物的制備將20mg用上述實(shí)施例I的方法進(jìn)行分離純化后得到的蚓激酶，用O. IM硼酸緩沖液(pH8. O)溶液配制成濃度為5mg/mL,加入mPEG-SC3_Q100mg,于4 反應(yīng)2h后，加入甘氨酸攪拌IOmin終止反應(yīng)，得到mPEG-NHS3(l_-蚓激酶偶聯(lián)物。實(shí)施例7. mPEG-蚓激酶合成產(chǎn)物的體外活性測(cè)定用蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(140650-200502))配制不同活性單位標(biāo)準(zhǔn)品(2500U/mg、5000U/mg、10000U/mg、15000U/mg、20000U/mg)，用纖維蛋白紙板法進(jìn)行體外活性測(cè)定，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。將蚓激酶粗品(上海國(guó)源生物技術(shù)有限公司購(gòu)買)、實(shí)施例I的蚓激酶分離純化后單體以及上述實(shí)施例3-5的產(chǎn)物，分別測(cè)定體外活性，代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出活性。其活性值分別為蚓激酶粗品(16000U/mg)、蚓激酶單體(19995U/mg)、mPEG-SC5_-蚓激酶偶聯(lián)物(12426U/mg)、mPEG-SC10000-蚓激酶偶聯(lián)物(11114U/mg)、mPEG-SC20000-蚓激酶偶聯(lián)物(9869U/mg)。結(jié)果見(jiàn)附圖11。實(shí)施例8.不同投料比的mPEG修飾蚓激酶的結(jié)果比較將80mg用上述實(shí)施例I的方法進(jìn)行分離純化后得到的蚓激酶，用O. IM磷酸鈉(pH7. 4)溶液配制成濃度為5mg/mL，平均分為8份，IOmg/份，分別加入mPEG-SC2_Q，mPEG-SC2_ 與蚓激酶的投料比例分別為 I : 3、1 4、1 5、1 IOU 15、1 20、1 25、
I 30，在冰浴下((TC)反應(yīng)2. 5h，最后加入甘氨酸終止反應(yīng)，反應(yīng)液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分別用考馬斯亮蘭染色法和銀染法進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)附圖12。實(shí)施例9. mPEG-SC2_-蚓激酶偶聯(lián)物的體內(nèi)活性測(cè)定將500mg用上述實(shí)施例I的方法進(jìn)行分離純化后得到的蚓激酶，用O. IM磷酸鈉(pH7. 4)溶液配制成濃度為5mg/mL，加入2. 5gmPEG-SC20000,室溫反應(yīng)3h，加入甘氨酸攪拌IOmin終止反應(yīng),得到mPEG-SC2(l_-蝴激酶偶聯(lián)物。配制一份5mg/mL蝴激酶原料藥,備用。將18只體重為30g左右、4周齡的雄性小鼠隨機(jī)分為3組正常對(duì)照組、蚓激酶原料藥對(duì)照組、蚓激酶-PEG藥物組，每組6只。小鼠腹腔注射角叉菜膠20mg/kg復(fù)制血栓模型，并于注射角叉菜膠前24h、lh，注射角叉菜膠后24h、48h，分別腹腔注射生理鹽水、上述蚓激酶原料藥、上述IiiPEG-SC2cicicici-蚓激酶偶聯(lián)物各一次，劑量為25mg/kg。在注射角叉菜膠后72h，觀察小鼠尾動(dòng)脈血栓發(fā)生率及血栓長(zhǎng)度，并進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)表I、附圖13。如表I所示，蚓激酶原料藥對(duì)照組和mPEG-SC2Q_-蚓激酶偶聯(lián)物藥物組與空白組相比，血栓率和血栓長(zhǎng)度均有顯著性差異，說(shuō)明造模成功，蚓激酶-PEG藥物組與對(duì)照組相比，血栓率與血栓長(zhǎng)度有一定改善情況，說(shuō)明蚓激酶-PEG在體內(nèi)發(fā)揮其長(zhǎng)循環(huán)作用，延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，提高了生物利用度。表lmPEG-SC2Q_-蚓激酶對(duì)小鼠血栓發(fā)生率和血栓形成長(zhǎng)度影響結(jié)果表(η = 5)
權(quán)利要求
1.一種mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)式如下 mPEG-CH2-W-NH-Lumbrokinase,O 其中，mPEG是甲氧基聚乙二醇，Lumbrokinase是蝴激酶；W是
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物，其中mPEG的分子量為5000-40000道爾頓，優(yōu)選10000-20000道爾頓。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物的制備方法，其特征是在緩沖液體系中，使具有活潑功能基團(tuán)的mPEG與蚓激酶分子反應(yīng)、純化、冷凍干燥得到mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其中所述具有活潑功能基團(tuán)的甲氧基聚乙二醇指甲氧基聚乙二醇玻拍酸酯(mPEG-succinimidyl succinate, mPEG-SS)、甲氧基聚乙二醇丙酸酸酯(mPEG-succinimidyl propionate, mPEG-SPA)、甲氧基聚乙二醇玻拍酸亞胺碳酸酯(mPEG-succinimidyl carbonate, mPEG-SC)、甲氧基聚乙二醇 N-輕基玻拍酸亞胺酯(mPEG-N-hydroxysuccinimide, mPEG-NHS)、甲氧基聚乙二醇琥拍酰亞胺酯(mPEG-succinimidyl ester)、甲氧基聚乙二醇對(duì)硝基苯碳酸酯(mPEG-p-nitrophenyl-carbonate)、甲氧基聚乙二醇三氯苯碳酸酯(mPEG-trichlorophenylcarbonate)、甲氧基聚乙二醇苯并三唑碳酸酯(mPEG-benzolriazole carbonate)和甲氧基聚乙二醇氧擬基咪唑(mPEG-oxycarbonyIimi dazoIe)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其中所述的緩沖液指pH7.0-9. 5的緩沖液，選自磷酸緩沖液、硼酸緩沖液、碳酸緩沖液、檸檬酸緩沖液及其混合溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其中所述的具有活潑功能基團(tuán)的mPEG-聚乙二醇與分離純化后蚓激酶的物質(zhì)的量的比例為I : 3 I : 30。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物或根據(jù)權(quán)利要求3-8中任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物在制備治療心腦血管系統(tǒng)疾病、缺血性腦血管疾病、下肢深部靜脈血栓、中風(fēng)、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、突發(fā)性耳聾疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有生理活性的甲氧基聚乙二醇(mPEG)-蚓激酶偶聯(lián)物，具有如下結(jié)構(gòu)，其中，mPEG是甲氧基聚乙二醇，Lumbrokinase是蚓激酶，mPEG的分子量為5000-40000道爾頓。本發(fā)明的mPEG-蚓激酶偶聯(lián)物，在體內(nèi)保留時(shí)間長(zhǎng)，降低了其免疫原性，提高了溶栓藥效。mPEG——CH2-W——NH-Lumbrokinase。
文檔編號(hào)A61P9/10GK102787109SQ20111012722
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月17日
發(fā)明者金明姬, 陳衛(wèi), 高鐘鎬 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所