專利名稱：仙人掌果多糖在制備降血脂作用的藥物或保健品中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及仙人掌果及仙人掌果多糖在制備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或保健品中的應用，屬于天然植物資源的利用技術領域。
背景技術：
廣西北海潿洲島是我國最大的死火山島，島上的熔巖給仙人掌生長提供了充足的養(yǎng)分，加之適宜的熱帶氣候，形成了成片野生的仙人掌。而且島上的仙人掌四季都可以結出數(shù)量可觀的仙人掌果。潿洲島產(chǎn)仙人掌果具有特有的胭脂紅色，其中富含礦物質(如硒) 和硫磺酸。但迄今為止，潿洲島盛產(chǎn)的仙人掌果除了極少量被當?shù)鼐用窕蚵糜握呤秤猛?，絕大部分都枯爛在地里，或被鳥、蛇等作為了腹中之餐，造成了資源的極大浪費，嚴重影響了仙人掌果的充分開發(fā)利用。中草藥及其活性成分的藥用功能具有多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)的特點，成為現(xiàn)代藥物開發(fā)的熱點，因此近年來天然植物在疾病預防和治療方面的作用引起人們的廣泛關注和重視。仙人掌作為一種天然植物，具有良好的觀賞價值、食用價值、保健價值和藥用價值，并且藥源豐富，無毒無異味，開發(fā)產(chǎn)品安全方便。近年來，動物實驗及人體試驗證明，仙人掌具有提高機體免疫力、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗菌、消炎等藥理作用。仙人掌果(Opimtia ficus-indica)為仙人掌屬(Opimtia)植物的果實，果肉含有豐富的微量元素、蛋白質、氨基酸、維生素、多糖類、黃酮類和果膠等。印第安人和墨西哥人將其作為食物和藥物使用已有幾千年的歷史。國內外對仙人掌根莖具有降血脂和降血糖等作用均有報道，但仙人掌果是否也具有降血脂和降血糖等活性未見報道。鑒于仙人掌果資源充足，廣西北海潿洲島產(chǎn)仙人掌果顏色鮮艷，口感甘甜，維生素和多糖的含量高，因此本申請人對仙人掌果以及從其中分離出的有效部位仙人掌果多糖進行了相關的藥理試驗研究和探索。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是根據(jù)仙人掌果所含的成分，將仙人掌果及從其中提取分離出的仙人掌果多糖用于制備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或保健品中。本發(fā)明是這樣構成的仙人掌果(Opuntia ficus-indica)在制備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或保健品中的應用。
仙人掌果多糖在制備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或保健品中的應用。所述仙人掌果多糖是從仙人掌果中提取出來的多糖類成分，其總糖含量為70% 80%。具體的仙人掌果多糖的制備方法為取仙人掌果，加4 10倍重量的水超聲提取 0. 5 2. 5小時，提取液濃縮，加入40 95%的乙醇，調節(jié)濃縮液的乙醇濃度至40 90% 進行沉淀，然后在1000 IOOOOrpm轉速下離心2 lOmin，離心沉淀物加水溶解，用體積比為1 5 2 10的無水乙醇和乙酸乙酯混合液萃取1 4次，水層用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，濃縮，干燥，即得。其中Sevage+木瓜蛋白酶法的具體過程為用Sevage溶液(體積比氯仿正丁醇=4 10 1 5)萃取水溶液1 3次后，取水層液，調pH至5 7，向水溶液中加入 1 4u/100ml的木瓜蛋白酶，45 65°C保溫20 ^h，1000 IOOOOrpm離心2 lOmin， 去除底層沉淀，得仙人掌果多糖脫蛋白液。具體的說，仙人掌果、仙人掌果多糖的應用方法為取仙人掌果或仙人掌果多糖， 加入或不加藥用輔料，按照常規(guī)方法制備成藥物制劑?；蛘邔⑾扇苏乒蛳扇苏乒嗵桥c其它藥用成分組合，并加入或不加藥用輔料， 按照常規(guī)方法制備成藥物制劑。還可以取仙人掌果或仙人掌果多糖，加入或不加輔料，按照常規(guī)方法制備成保健
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ΡΠ O或者將仙人掌果或仙人掌果多糖與其它物質組合，加入或不加輔料，按照常規(guī)方法制備成保健品。為了驗證本發(fā)明的效果，下面將通過仙人掌果多糖的制備及對仙人掌果原汁和仙人掌果多糖進行的藥效試驗研究來進一步闡述本發(fā)明。一、仙人掌果多糖的提取純化取仙人掌果，加4 10倍重量的水超聲提取0. 5 2. 5小時，提取液濃縮，加入 40 95%的乙醇，調節(jié)濃縮液的乙醇濃度至40 90%進行沉淀，然后在1000 IOOOOrpm 轉速下離心2 lOmin，離心沉淀物加水溶解，用體積比為1 5 2 10的無水乙醇和乙酸乙酯混合液萃取1 4次，水層用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，濃縮，干燥，即得仙人掌果多糖。Sevage+木瓜蛋白酶法用kvage溶液(體積比氯仿正丁醇=4 10 1 5)萃取水溶液1 3次后，取水層液，調pH至5 7，向水溶液中加入1 如/IOOml的木瓜蛋白酶，45 65°C保溫20 ^h，1000 IOOOOrpm離心2 lOmin，去除底層沉淀，得仙人掌果多糖脫蛋白液。經(jīng)測定，所提取的仙人掌果多糖中多糖含量達60 80%。二、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)降血壓作用的試驗研究1.仙人掌果及仙人掌果多糖單次及連續(xù)9周給藥對原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的收縮壓和心率(HR)影響1. 1實驗動物選擇16 周(w)齡雄性 SHR60 只，收縮壓(SBP)彡 23. 94kPa (IkPa = 7. 5mmHg)，體重O50士50)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號SCXK(滬)2003-0003 ； 同齡雄性Wistar大鼠，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號桂動許字2000第 001號。飼養(yǎng)在配備空調的動物房內，室溫(25士2) °C，自由飲水。1. 2實驗方法1.2. 1分組及給藥實驗前馴化并行適應性測壓訓練2w，待適應環(huán)境，隨機分為6組即模型組(NC) 給蒸餾水；CPFP高劑量組(HD)、中劑量組(MD)、低劑量組(LD)分別給3. 06g · kg-1 · cf1， 1. 58g · kg—1 · d—1，?！?79g · kg—1 · cf1 的 CPFP ；仙人掌果原汁組(NJ)給 3. 15g · kg—1 · cf1 仙人掌果原汁(CPNJ)；卡托普利組(PC)給0. Olg · kg-1 · cf1卡托普利；正常對照組(Wt) Wistar大鼠給蒸餾水。每組10只，給藥途徑為灌胃。1. 2. 2測壓方法用小型電吹風機對準大鼠尾巴腹側烘熱，待大鼠尾巴皮膚變?yōu)槲⒓t時，將血壓計的壓脈套套至大鼠尾部近心端處，高敏換能器置于尾巴中上1/3處，換能器表面對準尾部腹側，固定，松緊以換能器用手推不動為好。待大鼠平靜之后，打開記錄系統(tǒng)，可見有脈搏波出現(xiàn)，用充氣囊使壓脈套內的壓力升高到脈搏波完全消失再加壓升高3. 99kPa，然后通過充氣囊閥門緩慢放氣逐漸降低壓脈套內壓力，從開始放氣到管道內壓力為零一般維持時間 5 6秒。仔細觀察脈搏波從被阻斷到再次出現(xiàn)第一個波，這第一個波出現(xiàn)時所對應的壓力即為SBP。取連續(xù)3次測壓值的平均值作為應測SBP值，分別測定第一次用藥前、用藥后 2小時(h)、4hJh、8h、12h、24h及連續(xù)給藥9w期間每周SHR的SBP和HR。然后再根據(jù)脈搏波間接推算出HR。1. 2. 3統(tǒng)計學處理應用SPSSl 1. 0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料均采用J ± S表示，兩組間計量資料比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用方差分析。1. 3實驗結果 1. 3. 1單次給藥對SHR的SBP和HR影響單次給予CPFP后池即有明顯的降壓效應，4h降壓效應達到高峰。4h時HD與治療前相比有顯著性差異(P < 0. 05)，MD和LD降壓效應較HD稍弱，與治療前比較均無顯著性差異(P >0.05)。PC給予卡托普利后，池血壓下降達到高峰，與NC和治療前比較有顯著性差異(P < 0. 05)，降壓幅度最大值為0. 80士8. 03kPa,優(yōu)于HD降壓幅度最大值 (0. 68士8. 02kPa)。從降壓療效維持的時間來看，PC給藥他后SBP恢復到治療前水平，CPFP 各給藥組給藥1 后恢復到治療前水平，其降壓穩(wěn)定性優(yōu)于PC ；從降壓幅度來看CPFP降壓呈現(xiàn)明顯的量效和時效關系。上述各組給藥后Mh內HR無明顯變化(P > 0. 05)。1. 3. 2連續(xù)9w給藥對SHR的SBP和HR影響各給藥組在用藥2w后SBP下降幅度開始明顯，至8w SBP降幅減緩，基本穩(wěn)定在一個較低的水平。PC、HD和MD分別在#、5w和6w開始與治療前相比有非常顯著性意義(P <0.01)，LD和NJ自身前后比較也有差異(P<0. 05)。NC在實驗期間血壓趨于升高，9w后 SBP平均升高了 1. OOkPa,與治療前相比有非常顯著性差異(P < 0. 01)。組間對比PC、HD、 MD、LD和NJ分別在3w3w、5w、6w和5w降壓效果均顯著優(yōu)于NC (P < 0. 01)，其降壓的最大均值分別為 2. 16士0. 18,1. 59士 1. 44,1. 42士0. 16,0. 87士0. 18 和 0. 82士0. 19kPa,從降壓幅度來看PC的降壓療效優(yōu)于CPFP給藥組，但它們之間無顯著性差異(P > 0. 05)。另外，從
5降壓幅度來看CPFP連續(xù)給藥9w降壓也呈現(xiàn)明顯的量效和時效關系。用藥各組對HR的影響較小，用藥前后經(jīng)統(tǒng)計學處理無顯著性差異(P > 0. 05)。2.仙人掌果及仙人掌果多糖對原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血漿腎素(RA)和血管緊張素II (AngII)的影響2.1實驗動物同實驗1。2. 2實驗方法2. 2.1分組及給藥同實驗1，給藥時間為9w。2. 2. 2實驗步驟連續(xù)給藥9w，末次給藥后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml ·1 Ρ)，自腹主動脈取血各2ml分別置于預冷的含乙二胺四乙酸(EDTA)、二巰基丙醇和 8-羥基喹啉試管中，混勻，4°C，3000轉/分(rpm)離心lOmin，分離血漿，_20°C密封保存待測。血漿RA活性的測定，即測定血漿中血管緊張素I (AngI)產(chǎn)生的速率。取雙份血漿，一份讓其直接與抗體反應，測其AngI的濃度，作為對照管；另一份在37°C溫育30min后再讓其與抗體反應，測其AngI的濃度為測定管。測定管AngI的濃度減去對照管AngI的濃度并除以溫育時間，則為單位時間內AngI的產(chǎn)生速度，稱RA活性。AngII水平的測定操作步驟嚴格按照分析藥盒使用說明書進行，待加樣操作結束后混勻，室溫放置15min，3500rpm離心15min，吸上清液測定各管沉淀的放射性計數(shù)(cpm)， 并由r計數(shù)器預先編制的程序直接給出有關參數(shù)、標準曲線和樣品濃度。2. 2. 3統(tǒng)計學處理同實驗1。2. 3實驗結果HD和PC有降低血漿腎素活性的作用，與NC相比均有顯著性差異(P < 0. 05)，但 HD與PC之間無顯著性差異(P > 0. 05)。在降低血漿AngII方面，PC最強，HD次之，與NC 比較均有非常顯著性差異(P < 0. 01)，但HD與PC之間相比無統(tǒng)計學意義(P > 0. 05) ；LD 和NJ相對較差，與NC比無顯著性差異(P > 0. 05)。從而提示HD有類似于血管緊張素轉換酶抑制劑的作用機制。3.仙人掌果及仙人掌果多糖對原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血漿內皮素(ET)和一氧化氮(NO)的影響3.1實驗動物同實驗1。3. 2實驗方法3. 2.1分組及給藥同實驗1，給藥時間為9w。3. 2. 2實驗步驟連續(xù)給藥9w，末次給藥后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml · kg—1)，自腹主動脈各取血2ml置于含10% EDTA30 μ 1試管中，混勻。4°C放置約2h 后，3000rpm離心IOmin分離血漿，_20°C密封保存待測。測試前復融，按照ΕΤ、Ν0分析藥盒說明書進行嚴格操作。3. 2. 3統(tǒng)計學處理同實驗1。3. 3實驗結果與NC相比較，HD和MD有明顯降低SHR血漿ET的作用(P < 0. 05)，但與PC相比無顯著性差異(P > 0. 05) ；PC、HD和MD能顯著增加NO含量(P < 0. 01或P < 0. 05)，但與 PC相比均無顯著性差異(P > 0. 05)。4.仙人掌果及仙人掌果多糖對原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血漿NA和腎上腺素 (Adr)的影響4.1實驗動物同實驗1。4. 2實驗方法4. 2.1分組及給藥同實驗1，給藥時間為9w。4. 2. 2色譜條件色譜柱為C18色譜柱O50mmX4. 0mm, 5 μ m)；柱溫為室溫；流動相為甲醇-0. 15mol化―1磷酸二氫鉀緩沖液(1 9，ρΗ6· 0)；流速為Iml .mirT1 ；檢測波長為280nm。 此條件下分別以NA和Adr計算理論塔板數(shù)不低于3000。4. 2. 3實驗步驟連續(xù)給藥9w，末次給藥后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml · kg"1),自腹主動脈取血1.5ml置于含肝素試管中，混勻，4°C條件下2000rpm離心 15min，分離血菜；取血漿100 μ 1，加0. 05mol .171高氯酸200 μ 1，IOOOOrpm離心2min，倒入 Millipore Ultra-free-Mc 離心管，IOOOOrpm 離心 3min 后置 _20°C冰箱待測。4. 2. 4統(tǒng)計學處理同實驗1。4. 3實驗結果血漿樣品的測定取“4. 2. 3”項處理好的血樣超濾液按上述色譜條件分析，給藥 9w后HD和PC與NC比較，NA顯著降低(P < 0. 05)。5.仙人掌果及仙人掌果多糖對原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心臟重量及其指數(shù)的影響5.1實驗動物同實驗1。5. 2實驗方法5. 2.1分組及給藥同實驗1，給藥時間為9w。5. 2. 2實驗步驟連續(xù)給藥9w，末次給藥后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml · kg—1)，自腹主動脈取血后，快速取心，置預冷生理鹽水中洗凈，剪去殘余組織，用濾紙吸干表面水分，分離左右心室并稱重，室間隔歸左室。稱取左心室重量，計算表示左心室肥厚程度的左室重量指數(shù)(左心室重與體重比)。5. 2. 3統(tǒng)計學處理同實驗1。5. 3實驗結果與NC相比，各給藥組的左室重量、左室重量/右室重量和心室重量/體重有顯著性差異(P < 0. 05或P < 0. 01) ；CPFP給藥組與PC比較左室重量無明顯差別(P > 0. 05)。6.仙人掌果及仙人掌果多糖對原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)主動脈和腎動脈組織形態(tài)學的影響6.1實驗動物同實驗1。6. 2實驗方法6. 2.1分組及給藥同實驗1，給藥時間為9w。
6. 2. 2實驗步驟6. 2. 2. 1主動脈HE染色病理形態(tài)觀察連續(xù)給藥9w，末次給藥后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml · kg—1)，自腹主動脈取血后，迅速摘取胸主動脈，用福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色。 用光學顯微鏡觀察并拍照。6. 2. 2. 2主動脈和腎動脈bFGF、Ki_67的免疫組化檢測連續(xù)給藥9w，末次給藥后禁食(不禁水) 小時，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml · kg—1)，自腹主動脈取血后，迅速摘取胸主動脈和腎動脈，福爾馬林固定，脫水、透明、 浸蠟、包埋、切片。組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，浸泡于水中待用。酸性修復取配置好的檸檬酸緩沖液(pH = 6.0士0. 1)800 1500ml于壓力鍋中，電爐加熱至沸騰。脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料染色架上，放入已沸騰的緩沖液中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣，從噴氣開始記時，1. 5min后壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫。取出玻片，先用自來水沖洗后，置放于卵育盒中。PBS(NaCl 9. 0g+Na2HP04 ‘ 12H20 6. 0g+NaH2P04 ·2Η20 0. 4g+ 蒸餾水 1000ml)沖洗三次，每次間隔 3min, 除去PBS液。每張切片加50μ1 3%過氧化氫，室溫下孵育lOmin，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗三次，每次間隔3min，除去PBS液。每張切片加50μ 1的bFGF-2 (sc-79)或Ki_67 (cloneSP6)兔抗大鼠多克隆抗體 (均按1 50稀釋)，在4°C下孵育過夜。PBS沖洗三次，每次間隔;3min，除去PBS液，每張切片加50 μ 1即用型二步法(非生物素)PV6001兔二步法檢測試劑盒，室溫下孵育15min。 PBS沖洗三次，每次間隔3min，除去PBS液。DAB顯色850 μ 1蒸餾水與DAB試劑中Α、B、C試劑各50 μ 1混勻，配制成ImlDAB 顯色液。每張切片加50 μ 1新鮮配制的DAB溶液，自來水沖洗，蘇木素復染30秒，自來水沖洗，返藍。切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥、中性樹膠封固。結果判定①bFGF染色結果判定參考Mattern方法，從以下兩方面評分陽性染色深度(未見染色為0，輕度染色為1，中度染色為2，深度染色為幻和陽性細胞的百分比 (未見染色記為0，染色細胞< 25%為1，25-50%為2，> 50%為幻，將這兩方面得分相加。 在未知病理診斷的條件下，在高倍鏡下分別觀察10個視野后，平均得分、記錄。得分0-2分為陰性表達，超過2分(3-6)為陽性表達，其中3-4分為弱陽性，5-6分為強陽性。②Ki-67標記指數(shù)判定參照文獻，以胞核染成均一棕黃色，胞漿及胞膜不著色為陽性細胞，隨機計數(shù)5個以上高倍視野1000個細胞，平均每100個細胞中陽性染色細胞核數(shù)為 Ki-67 指數(shù)(Ki-671)。6. 2. 3統(tǒng)計學處理同實驗1。6. 3實驗結果 6.3.1對SHR組織病理形態(tài)的影響6. 3. 1. 1組織學檢查各組變化不明顯。6. 3. 1. 2光鏡下檢查Wt 主動脈大部分接近正常，個別內皮細胞腫脹，中膜未見明顯增厚(6-8層)，外膜結締組織未見沉積物。NC 主動脈動脈壁厚薄不一，內膜增生，呈現(xiàn)小的高低起伏狀，內皮下間隙可見少量沉積物，內皮細胞不完整，內膜表面可見紅細胞附壁，部分中膜平滑肌細胞增生，管壁中膜明顯增厚(達11-13層)，外膜結締組織未見沉積物。HD 主動脈內膜輕度增生，部分增厚，內皮細胞腫脹，部分中膜輕度增厚(8-10層)，外膜結締組織未見沉積物。MD 主動脈內膜輕度增生，可見小的突起。內皮細胞不完整，部分中膜增厚(10-11層)，外膜結締組織未見沉積物。LD 主動脈內膜輕度增生，呈現(xiàn)小的高低起伏狀，內皮下間隙可見少量沉積物，內皮細胞不完整，內膜表面可見紅細胞附壁，部分中膜平滑肌細胞增生，中膜明顯增厚(10-12層)，外膜結締組織未見沉積物。NJ:主動脈內膜輕度增生，可見小的突起。內皮細胞不完整，部分中膜增厚(9-11層)，外膜結締組織未見沉積物。PC:主動脈內膜輕度增生，部分增厚，內皮細胞腫脹，部分中膜輕度增厚(8-10層)，外膜結締組織未見沉積物。6. 3. 2對SHR主動脈和腎動脈平滑肌細胞(VSMC) bFGF和Ki_67的影響6. 3. 2. 1對各組主動脈和腎動脈VSMC bFGF含量的影響bFGF陽性染色主要彌漫性分布于動脈中膜VSMC胞漿中，在高倍視野下觀察呈顆粒狀；細胞核幾乎不著色。與NC相比，Wt主動脈和腎動脈VSMCbFGF含量明顯降低(P
<0. 01)，HD和MD主動脈VSMC bFGF含量顯著下降(P < 0. 01或P < 0. 05)，HD的腎動脈 VSMC bFGF的含量也明顯下降(P < 0. 05)；與PC相比，HD、MD和NJ的VSMC bFGF含量均無明顯差異(P > 0. 05)。6. 3. 2. 2對各組主動脈和腎動脈VSMC Ki-671的影響Ki-67陽性反應均分布于主動脈中膜VSMC的細胞核中，胞漿無染色。與NC相比， Wt、HD和PC的主動脈和腎動脈VSMC Ki-671明顯減少(P < 0. 01或P < 0. 05), NJ的腎動脈VSMC Ki-671也明顯降低(P < 0. 05)；與PC相比，HD、MD和NJ的VSMC Ki-671均無明顯差異(P > 0. 05)。降壓實驗研究表明單次給予仙人掌果多糖后池即有明顯的降壓效應，4h降壓效應達到高峰，降壓幅度最大值為0. 68士8. 02kPa。4h時HD與治療前相比有顯著性差異(P
<0.05)。從降壓療效維持的時間來看，仙人掌果多糖各給藥組給藥1 后SBP恢復到治療前水平。從降壓幅度來看仙人掌果多糖降壓呈現(xiàn)明顯的量效和時效關系。在連續(xù)9W給藥過程中，仙人掌果多糖對SHR顯示持續(xù)的降壓作用，各劑量組之間呈現(xiàn)量效和時效依賴趨勢，其作用特點是平緩、穩(wěn)定。HD和MD與治療前和NC相比有顯著性差異(P<0.01) ；LD和 NJ與NC相比也有顯著性差異(P <0.01)，但自身前后比較不是非常明顯，但也有差異(P
<0. 05)。HD、MD、LD 和 NJ 降壓的最大均值分別為 2. 16士0. 18、1. 59士 1. 44、1. 42士0. 16、 0.87士0. 18和0.82士0. IQkPa0由此說明仙人掌果多糖具有良好的降血壓的作用。因此，仙人掌果多糖可明顯降低SHR的收縮壓，并呈明顯的時效和量效關系；能明顯降低SHR血漿RA、AngII、ET、去甲腎上腺素(NE)和升高NO的含量；保護SHR主動脈內皮細胞，逆轉平滑肌細胞增殖，在某種程度上具有逆轉SHR靶器官損害的作用。三、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)降血脂作用的試驗研究1.仙人掌果及仙人掌果多糖對高脂血癥(HLP)大鼠血脂及肝臟形態(tài)學的影響1. 1實驗動物SD大鼠60只，雄性，體重160士 10g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號為SCXK桂2003-0003 ；動物飼料由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心生產(chǎn)(標準飼料)。實驗期間大鼠自由攝食、飲水、通風和自然采光。1.2實驗方法
1. 2. 1模型建立及實驗分組取大鼠60只，隨機分成為空白組(KB) 10只和高脂造模型組(ZM)50只。常規(guī)飼養(yǎng) 1周(w)后，禁食不禁水12小時(h)，采血，檢測基礎血脂。參照文獻方法制備高脂飼料，即由87. 3%基礎飼料、10%豬油、2%膽固醇、0. 5%豬膽鹽、0. 2%丙基硫氧嘧啶配制而成。ZM 大鼠以高脂飼料喂飼3w后，禁食(不禁水)1池，采血，檢測血脂。與造模前的血脂比較以確定HLP模型是否建成。HLP模型造成后，將HLP大鼠按血清總膽固醇(TC)水平分為5組: CPFP高劑量組(HD) XPFP低劑量組(LD)、仙人掌果原汁組(NJ)、陽性對照組(LF)及HLP模型組(HL)，每組10只。1.2. 2給藥方法大鼠造模結束各組分別給予相應藥物灌胃。HD和LD分別給3. 06g · kg—1 · cf1和 0. 79g · kg—1 · CT1CPFP，NJ 給 3. 15g · kg—1 · cf1 仙人掌果原汁；LF 給 3. Omg · kg—1 · cf1 洛伐他汀，空白組(KB)及HL以IOml · kg—1生理鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)3w。各組均自由飲水。1.2. 3攝食量和體重每日同一時間記錄進食量，每w同一時間記錄各組大鼠體重，以便調整給藥劑量。1.2.4TC、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白-膽固醇 (LDL-C)、載脂蛋白AI (apoAI)和載脂蛋白B(apoB)的測定給藥3w，末次給藥前禁食12h，給藥Ih后，取血，裝入抗凝或不抗凝試管中，在4°C 下3000轉/分(rpm)離心lOmin，分別取血清或血漿，在全自動生化分析儀上分別測定TC、 TG、HDL-C, LDL-C, apoAI 和 apoB 的含量。1. 2. 5LDL-C/HDL-C、TG/HDL-C比值和動脈硬化指數(shù)(Al)的計算根據(jù)單項的血脂測定結果(TC、TG、HDL-C和LDL-C含量)分別計算血脂綜合指數(shù)(LDL-C/HDL-C、TG/HDL-C比值以及Al)，其中AI根據(jù)Frieldwald公式計算AI = (TC-HDL-C)/HDL-C。1.2. 6肝重和肝臟系數(shù)各組大鼠處死后，迅速摘取肝臟，用預冷生理鹽水漂洗再用濾紙吸干表面水分后， 稱重。根據(jù)肝重計算肝臟系數(shù)肝臟系數(shù)=肝臟重量(g)/體重(g)X100%。1.2.7肝組織病理學觀察取肝組織，切成4_5mm3小塊，10 %中性福爾馬林固定，梯度乙醇脫水75%乙醇 90min 95% 乙醇 90min 100% 乙醇 90minX3 次 100%二甲苯 60minX 2 次，62°C浸石蠟》!X2次，包埋后切片6 μ m，貼于普通載玻片上。經(jīng)HE染，光學顯微鏡下觀察并拍照。1. 2. 8統(tǒng)計學處理應用SPSSl 1. 0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料均采用〒士 S表示，兩組間計量資料比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用方差分析。1.3實驗結果1. 3. 1造模期間大鼠攝食量和體重變化造模期間大鼠平均日攝食量和體重均有不同程度的增加。ZM大鼠平均日攝食量均低于KB，其中第Iw有顯著性差異(P < 0. 05)，可能由于初食高脂飼料不適應有關；第2、3w 均無顯著性差異(P>0.(^) ；ZM大鼠體重均高于KB，但無顯著性差異(P >0.05)。1. 3. 2大鼠HLP模型的建立喂飼高脂飼料的ZM大鼠3w后測血脂。與造模前相比，血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高(P < 0. 01), HDL-C水平明顯下降(P < 0. 05)。說明ZM大鼠存在著血脂代謝紊亂， HLP模型復制成功。1. 3. 3對大鼠攝食量和體重的影響給藥期間，各組大鼠生長良好，活動正常。給藥前各組大鼠攝食量和體重均無明顯差別(P>0.05)。給藥3w后，大鼠平均日攝食量和體重均穩(wěn)步增加，與KB、HL相比，各給藥組大鼠平均日攝食量和體重無顯著性差異(P > 0. 05)，說明CPFP對大鼠攝食量和體重變化無不良影響。L 3. 4 對 HLP 大鼠 TC、TG 和 LDL-C 的影響給藥前，各HLP模型組間大鼠的血清TC、TG和LDL-C水平相互比較無顯著性差異 (P > 0. 05)，但都明顯高于 KB (P < 0. 01)。給藥3w后，各組與給藥前比較，KB大鼠血清TC、TG和LDL-C分別升高1.84%、 6. 06%和7. 14%，均無顯著性差異(P > 0. 05) ；HL大鼠血清TC、TG和LDL-C分別升高 23. 84%,27. 27%和31. 82%，均有顯著性差異(P < 0. 05) ；HD、LD、NJ及LF血脂分別降低 TC(23. 10%U8. 29%U9. 60%禾口 31. 64% ) ,TG(34. 37%,27. 27%,24. 64%禾口 35. 48% )和 LDL-C(26. 70%,24. 76%、19.四％和38. 42% )，各組 TC、TG和 LDL-C均顯著降低(P < 0. 01 或 P < 0. 05)。與HL比較，各給藥組大鼠血清TC、TG和LDL-C水平均非常明顯下降(P < 0. 01)； 與LF比較，HD大鼠血清TC、TG和LDL-C水平均無顯著性差異(P > 0. 05)，說明CPFP能顯著降低HLP大鼠血清TC、TG和LDL-C，HD和LF效果均較好。L 3. 5對HLP大鼠HDL-C的影響給藥前，各HLP模型組間大鼠血清HDL-C水平相互比較無顯著性差異(P > 0. 05)， 但都明顯低于KB (P < 0.01)。給藥3w后，與給藥前比較，KB大鼠血清HDL-C水平升高0. 85%，但無顯著性差異 (P > 0. 05) ；HL 降低 8. 70%,無顯著性差異(P > 0. 05) ；HD,LD,NJ和 LF分別升高 19. 78%、 8. 51%、8. 60%和13. 83%，HD大鼠血清HDL-C升高有顯著性差異(P < 0. 05)，其余給藥組均無顯著性差異(P > 0. 05)。與HL比較，各給藥組大鼠血清HDL-C水平均有所升高，HD和LF有顯著性差異(P < 0. 05)，說明CPFP能升高HLP大鼠血清HDL-C01. 3. 6 對 HLP 大鼠 apoAI 和 apoB 的影響給藥3w 后，與 HL 比較，HD、LD、NJ 禾口 LF 血清 apoAI 分別升高 33. 49%,5. 58%, 3. 49%和21. 16%，但均無顯著性差異(P > 0. 05) ；HD, LD、NJ和LF血清apoB分別降低 49. 26%,40. 16%,47. 18%和50. 15%，均有非常顯著性差異(P < 0. 01)。各給藥組間apoAI 和apoB水平均無顯著性差異(P > 0. 05)。1. 3. 7對HLP大鼠血脂綜合指數(shù)(LDL_C/HDL_C、TG/HDL-C比值和Al)的影響給藥3w后，與HL比較，HD、LD、NJ和LF血脂綜合指數(shù)分別降低LDL_C/ HDL-C(57. 68%,52. 66%,49. 84 % 和 62. 38 % ), TG/HDL-C(63. 89 %,57. 41 %,52. 78 % 和 66. 67% )、AI (62. 23%,53. 68%,51. 54%和 65. 80% )，均有非常顯著性差異(P < 0. 01)。 與LF比較，HD無顯著性差異(P > 0. 05)，LD和NJ大鼠血清LDL-C/HDL-C和AI比值有顯著性差異(P < 0. 01或P < 0. 05)。
1. 3. 8對HLP大鼠肝重和肝臟系數(shù)的影響給藥3w后，與HL比較，HD、LD、NJ和LF大鼠的肝重和肝臟系數(shù)都有不同程度的降低，肝重依次降低15. 16%、10. 15%、11. 25%和16. 99%, HD和LF降低有顯著性差異(P < 0. 05)；肝臟系數(shù)依次降低 12. 10%,9. 80%、10. 09%和 13. 26%，HD、LD、NJ 和 LF 降低有顯著性差異(P < 0. 01或P < 0. 05)。與LF比較，各給藥組肝重和肝臟系數(shù)均無顯著性差異(P > 0. 05)。1. 3. 9對HLP大鼠肝臟脂肪變性的影響1.3.9. 1組織學檢查KB 肝臟無異常變化，肝臟表面光滑，有光澤，未見充血、水腫等現(xiàn)象；HL 肝臟體積增大，包膜緊張，邊緣圓鈍，切面油膩，無光澤，呈奶黃色，可見針頭大的細小顆粒，屬典型肝細胞脂肪變性；各給藥組肝臟色澤、質地、體積均有明顯改善。1.3. 9. 2 光鏡觀察KB 肝組織的形態(tài)學表現(xiàn)正常，肝小葉結構清晰，肝細胞排列呈條索狀，以中央靜脈為中心放射狀走行，未見肝細胞濁腫、脂變和壞死，匯管區(qū)可見小葉間小血管和毛細膽管，未見炎細胞浸潤和淤膽形成等改變，10只大鼠肝細胞均未見脂肪變性(0/10)；HL:肝小葉結構欠清晰，10只大鼠均出現(xiàn)了中度至重度的肝細胞脂肪變性 (10/10)，胞漿中出現(xiàn)大小不等的脂肪空泡，肝細胞體積普遍變大變圓，細胞核被擠在一邊， 肝竇明顯變窄或消失，肝細胞著色較正常細胞為淺，胞漿淡染，腺泡內多見點狀或灶狀壞死，匯管區(qū)伴有輕-中度炎癥細胞浸潤，未見明顯肝纖維化，大部分肝小葉中央靜脈周顯現(xiàn)膽固醇結晶；各給藥組肝組織均有不同程度的改善，尤其是HD和LF肝組織有較大程度改善。2.仙人掌果及仙人掌果多糖對高脂血癥(HLP)大鼠血液流變學的影響2.1實驗動物同實驗1。2. 2實驗方法2. 2. 1血液流變學的測定給藥3w，末次給藥前禁食12h，給藥Ih后，取血3. 5ml，用血清洗旋轉式粘度計，測全血粘度(高、中、低切)，血漿粘度和紅細胞壓積值等血液流變學指標。2. 2. 2統(tǒng)計學處理同實驗1。2. 3實驗結果對HLP大鼠血液流變學的影響給藥3w后，與HL比較，HD、LD、NJ和LF全血粘度(高切、中切、低切)、血漿粘度、 紅細胞(RBC)壓積值均有顯著性降低(P < 0. 01或P < 0. 05)；與LF比較，HD的RBC壓積值、全血粘度(高切)和血漿粘度均顯著性降低(P < 0. 01或P < 0. 05)，效果優(yōu)于LF ；LD 和NJ的RBC壓積值也顯著降低(P < 0. 05)，說明CPFP對HLP大鼠的血液流變學異常具有
明顯改善作用。3.仙人掌果及仙人掌果多糖對高脂血癥(HLP)大鼠抗氧化作用的影響3.1實驗動物同實驗1。3. 2實驗方法3. 2.1樣本處理
給藥3w，末次給藥前禁食12h，給藥Ih后，取血，裝入不抗凝試管中，在4°C下 3000rpm離心lOmin，取血清，分裝，_20°C保存。3. 2. 2血清超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定測定原理以黃嘌呤氧化酶法測定，通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色。嚴格按照SOD 測試盒說明書操作，在550nm處測定SOD的吸光度(OD)，根據(jù)下列公式計算血清SOD活性血清SOD活性(U/ml)=(對照管OD值-測定管OD值)+對照管OD值+ 50 % X 樣品測試前稀釋倍數(shù)。注每Iml反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD 活力單位⑶。3. 2. 3血清丙二醛(MDA)含量的測定測定原理采用硫代巴比妥酸(TBA)法。過氧化脂質降解產(chǎn)物中的MDA可與TBA 縮合，形成紅色產(chǎn)物。嚴格按照SOD測試盒說明書操作，在532nm處測定MDA的OD值，根據(jù)下列公式計算血清MDA含量MDA含量(nmol/ml)=(測定管OD值-測定空白管OD值)+ (標準管OD值-標準空白管OD值)X標準品濃度X樣品測試前稀釋倍數(shù)。3. 2. 4統(tǒng)計學處理同實驗1。3. 3實驗結果對HLP大鼠抗氧化作用的影響給藥3w 后，HD、LD、NJ和LF血清S0D活性分別升高 50.06%、40.64%、37. % 和34. 33% ；與HL比較，HD、LD和NJ有非常顯著性差異(P < 0. 01)，LF有顯著性差異(P < 0. 05)。血清MDA含量分別降低36. 33%,32. 72%,27. 78%和28. 66%，各給藥組均有非常顯著性差異(P < 0. 01)。另外，各給藥組組間SOD和MDA均無顯著性差異(P > 0. 05)。實驗結論1.仙人掌果多糖具有降脂及調節(jié)脂蛋白代謝的作用能降低高脂血癥大鼠血中的TC、TG、LDL-C和apoB水平，升高HDL-C和apoAI水平；并保護肝臟細胞結構功能的改變，增強其對脂質代謝的作用。2.仙人掌果多糖能改善血液粘度和流變性，直接改善血液成分能降低高脂血癥大鼠的全血粘度(高、中和低)、血漿粘度、RBC壓積，而改善血液流變性。通過改善血液濃、 粘、聚狀態(tài)，促進脂類物質的代謝。3.仙人掌果多糖能清除自由基，減少脂質過氧化物的產(chǎn)生可以有效降低高脂血癥大鼠血清中MDA含量，升高血清中SOD活性，提示仙人掌果多糖可能通過提高自由基清除酶的活性，維護體內自由基穩(wěn)態(tài)與平衡，增加LDL的抗氧化能力，減少脂質過氧化物的產(chǎn)生，從而發(fā)揮防治高脂血癥和動脈粥樣硬化的作用。因此，仙人掌果多糖具有降脂及調節(jié)脂蛋白代謝的作用，能改善血液粘度和流變性，直接改善血液成分，清除自由基，減少脂質過氧化物的產(chǎn)生，從而發(fā)揮防治高脂血癥和動脈粥樣硬化的作用。四、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)降血糖作用的試驗研究1.仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠糖代謝和一般體征的影響1.1實驗動物SD大鼠，雌雄各半，體重QOO 士 10) g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號為SCXK桂2003-0003 ；動物飼料由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心生產(chǎn)(標準飼料)。DM模型鼠自由攝食、飲水，通風，自然采光。1.2實驗方法1. 2. IDM大鼠模型建立及指標測定1.2. 1. IDM大鼠模型建立及分組SD大鼠禁食12小時(h)，以60mg · kg—1鏈脲霉素(STZ)腹腔注射(STZ溶解于 0. Imol · L—1、pH4. 2的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖溶液中，現(xiàn)配現(xiàn)用，置于冰上)。正常對照組 (Sd)大鼠腹腔注射等量上述緩沖液。7 后(大鼠采血前禁食12h)用血糖(BG)測定儀測定空腹血糖(FBG)值，凡FBG彡13mmol · L—1視為DM大鼠模型。將成模DM大鼠按BG濃度由高到低排序進行物理編號，隨機將DM大鼠分為DM模型對照組(NC)、胰島素組(IN)、原汁組(NJ)、CPFP中劑量組(MD)和CPFP高劑量組(HD)。1.2. 1.2給藥劑量與方法IN 給 10U. kg—1 · Cf1 胰島素(Ins)，NJ 給仙人掌果原汁 3. 15g · kg—1 · d-1，MD 和 HD 分別給1. 58g · kg-1 · (1^,3. 06g · kg-1 · cf1。每天上午空腹給藥1次，連續(xù)灌胃8周(w)。1. 2. 1. 3—般體征觀察觀察大鼠的精神活動、毛發(fā)改變、飲水量、進食量和大小便等一般狀況，并記錄體重變化情況。1.2. 1.4血糖的測定給藥第#和第8w，用BG測定儀測定各組FBG，計算并統(tǒng)計分析藥物對DM大鼠BG 水平的影響。1. 2. 1. 5糖化血紅蛋白(GHB)的測定給藥8w末，拔大鼠眼球采血2_鈿1置于離心管中，以500 1000轉/分(rpm)，離心5 10分鐘(min)，棄上清留沉淀的紅細胞，然后用生理鹽水洗滌2 3次。用GHB測定試劑盒測定GHB含量，具體操作詳見試劑盒說明書，計算并統(tǒng)計分析藥物對DM大鼠GHB水平的影響。計算公式每IOg GHB吸光度(OD)=測定管0D/2ml血液中GHB克數(shù)X2X IOg1. 2. 2統(tǒng)計學處理應用SPSSl 1. 0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料均采用無土 S表示，兩組間計量資料比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用方差分析。1.3實驗結果1. 3. 1對STZ所致DM大鼠的一般狀況的影響1. 3. 1. 1—般狀態(tài)觀察Sd大鼠精神振奮，活動頻繁，毛發(fā)純白有光澤，墊料干燥；NC大鼠精神萎靡，活動度低，尾巴濕冷，毛發(fā)枯黃、無色澤、脫落，豎毛弓背，墊料極潮，下腹部及外陰部毛浸濕，大便稀澹，出現(xiàn)“三多一少”的癥狀；給予CPFP和hs后，DM大鼠精神逐漸好轉，活動增多，皮毛光澤漸好，墊料比較干燥，大便稀塘減少，“三多一少”的癥狀減輕。1. 3. 1. 2對DM大鼠體重的影響在實驗中Sd和IN大鼠體重呈持續(xù)增長趨勢；NC大鼠體重逐步下降，說明DM大鼠體內產(chǎn)生代償，代謝紊亂；給予CPFP后，DM大鼠體重8w時顯著高于NC同期體重(P < 0. 05)。1.3.2藥物對STZ所致MD大鼠FBG的影響
給藥#和8w后，各組FBG均有不同程度的降低。與同期NC比較HD、MD和NJ均有顯著降血糖作用(P <0.01)，降糖效果呈現(xiàn)一定的量效和時效關系。HD、MD和NJ之間均無顯著差異(P > 0. 05)。1.3.3藥物對STZ所致DM大鼠GHB的影響結果顯示與NC相比，HD、MD和NJ的GHB含量顯著降低(P < 0. 01或P < 0. 05)， 但HD、MD和NJ之間無顯著差異(P > 0. 05)。提示HD、MD、NJ均能較穩(wěn)定地降低血糖。2.仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠脂代謝的影響2.1實驗動物同實驗1。2. 2實驗方法2.2.1血清總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、L DL_C和高密度脂蛋白-膽固醇 (HDL-C)的測定給藥8w末，取血，4 °C，3500rpm離心IOmin，在全自動生化分析儀上測定血清 TC、TG、LDL-C和HDL-C含量，并根據(jù)Frieldwald公式計算動脈硬化指數(shù)(Al) =AI = (TC-HDL-C)/HDL-C。2. 2. 2統(tǒng)計學處理同實驗1。2. 3實驗結果與Sd相比，NC大鼠TC、TG和LDL-C顯著升高(P < 0.01)，HDL-C含量顯著下降 (P < 0. 05)；給藥8w后，與NC相比，HD和IN的TC和TG含量顯著下降(P < 0. 05)，LDL-C 含量也有所減少，其中HD的LDL-C含量降低效果顯著(P < 0. 05)；同時，HD和IN的HDL-C 含量顯著升高(P < 0. 05)。3.仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠胰腺組織形態(tài)學的影響3.1實驗動物同實驗1。3. 2實驗方法3. 2. 1胰腺組織HE染色形態(tài)觀察給藥8w末，取血后，迅速取胰腺，用福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色。光鏡下觀察心肌組織病理學變化并拍照。3. 2. 2胰腺組織α細胞和β細胞的免疫組化檢測給藥8w末，剖腹取胰腺，福爾馬林固定，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片。組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，浸泡于水中待用。酸性修復取配置好的檸檬酸緩沖液(pH = 6. 0士0. l)800_1500ml于壓力鍋中，電爐加熱至沸騰。脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料染色架上，放入已沸騰的緩沖液中， 蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣，從噴氣開始記時，1. 5min后壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫。取出玻片，先用自來水沖洗后，置放于卵育盒中。PBS(NaCl 9. 0g+Na2HP04 · 12H20 6. 0g+NaH2P04 · 2H20 0. 4g+蒸餾水1000ml)沖洗三次，每次間隔3min,除去PBS液。每張切片加50 μ 1 3%過氧化氫，室溫下孵育lOmin，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗三次，每次間隔3min,除去PBS液。每張切片加50 μ 1的Glucagon Ab-I或 Insul in Ab_5 (均按1 50稀釋)，在4°C下孵育過夜。PBS沖洗三次，每次間隔^iin，除去PBS液，每張切片加50 μ 1即用型快捷免疫組化Maxvision 抗兔-HRP檢測試劑盒，室溫下孵育15min。PBS沖洗三次，每次間隔3min，除去PBS液。
DAB顯色850 μ 1蒸餾水與DAB試劑中Α、B、C試劑各50 μ 1混勻，配制成ImlDAB 顯色液。每張切片加50 μ 1新鮮配制的DAB溶液。自來水沖洗，蘇木素復染30秒，自來水沖洗，返藍。切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥、中性樹膠封固。鏡下觀察各組免疫組化片進行綜合評分。1、表達面積①陽性表達細胞數(shù)為0計為0分。②陽性表達細胞數(shù)< 25%計為1分；③陽性表達細胞數(shù)為沈 50%計為2分；④ 陽性表達細胞數(shù)占51 75%計為3分；⑤陽性表達細胞數(shù)>75%計為4分。2.表達強度 ①陽性信號強烈，呈棕褐色，小塊狀，計為3分，②陽性信號中等，呈棕色，粗顆粒狀，計為2 分；③陽性信號較弱，呈淡棕色，細顆粒狀，計為1分；④無陽性信號，計為0分。兩項相加， 0分為陰性(_)，2-3分為弱陽性(+)，4-5分為中度陽性(++)，6-7分為強陽性(+++)。計數(shù)采用雙盲法。3. 3實驗結果3. 3. 1對DM大鼠組織病理形態(tài)的影響Sd胰腺中胰島數(shù)量較多，體積較大，胰島呈圓形或橢圓形的細胞團，邊界清晰，胰島內細胞數(shù)量較多，排列整齊，胞漿豐滿，核多為圓形；NC胰島數(shù)量明顯減少，結構破壞，輪廓消失，胰島內細胞數(shù)量明顯減少，細胞排列不規(guī)則，邊界不清，部分細胞腫脹或皺縮壞死， 胰島內出現(xiàn)空泡；IN胰島數(shù)量明顯增多，輪廓完整，分布規(guī)則，細胞邊界清晰；HD和MD與NC 相比胰腺病變較輕，胰島輪廓完整，胰島內細胞數(shù)量增多，分布規(guī)則，胞漿疏松，淡染，細胞邊界較清晰。3. 3. 2藥物對STZ所致MD大鼠胰島β細胞和α細胞的影響3. 3. 2. 1胰島β細胞hs表達情況結果顯示與NC相比較，各給藥組Ins表達陽性率顯著升高(P < 0. 05)，表明各給藥組對STZ所致胰島β細胞損傷具有明顯的保護作用。免疫組化染色顯示各組表達hs 程度NC胰島中央部分著色程度較正常組明顯變淺，面積縮??；各給藥組中胰島β細胞著色加深且面積增大。3. 3. 2. 2胰島α細胞胰高血糖素表達情況結果顯示與NC相比，各給藥組胰高血糖素表達無顯著差異(P > 0. 05)。免疫組化染色顯示各組表達胰高血糖素程度與NC相比，Sd和各給藥組α細胞胰高血糖素表達無顯著差異(P > 0. 05)。4.仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠抗氧化作用的影響4.1實驗動物同實驗1。4. 2實驗方法4. 2. 1心肌中丙二醛(MDA)和超氧化歧化酶(SOD)測定給藥8w末，取血后，取心臟，用冰生理鹽水清洗，濾紙吸干，稱重后，用生理鹽水配成10%心肌勻漿，于冷凍離心機3000rpm離心15min，取上清液，按要求用生理鹽水稀釋成一定倍數(shù)后用于心肌MDA和SOD測定。4. 2. 1. 1血清MDA含量的測定測定原理采用硫代巴比妥酸(TBA)法。過氧化脂質降解產(chǎn)物中的MDA可與TBA 縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收。嚴格按照SOD測試盒說明書操作，在532nm 處測定MDA的OD值，根據(jù)下列公式計算血清MDA含量
MDA含量(nmol/ml)=(測定管OD值-測定空白管OD值)+ (標準管OD值-標準空白管OD值)X標準品濃度X樣品測試前稀釋倍數(shù)。4. 2. 1. 2血清SOD活性的測定測定原理以黃嘌呤氧化酶法測定，通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色。嚴格按照SOD 測試盒說明書操作，在550nm處測定SOD的吸光度(OD)，根據(jù)下列公式計算血清SOD活性血清SOD活性(U/ml)=(對照管OD值-測定管OD值)+對照管OD值+ 50 % X 樣品測試前稀釋倍數(shù)。注每Iml反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD 活力單位⑶。4. 3實驗結果4. 3. 1藥物對DM大鼠心肌MDA和SOD的影響鏈脲霉素(STZ)所致NC大鼠心肌MDA含量較Sd有顯著增高，SOD活性則顯著降低，顯示DM大鼠心肌抗氧化能力下降。用藥8w后，與NC比較，HD、MD和NJ心肌MDA值均顯著降低(P <0.01)，相應SOD活性明顯增高(P <0.01)，但與IN相比均有顯著差異(P < 0. 01)。5.仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠心肌超微結構的影響5.1實驗動物同實驗1。5. 2實驗方法給藥8w后，取血后，摘取心臟，迅速放入預冷的2. 5%戊二醛(用磷酸緩沖液配制， PH7. 2)固定，之后用PBS (pH7. 2)漂洗IOmin三次，放入1 %鋨酸(四氧化鋨)，固定池，PBS 漂洗IOmin三次，50 % 90 %乙醇逐級脫水，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，38°C、45°C、60°C依次聚合36h，LKB-V超薄切片機切片，約70nm，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，在H-500型透射電子顯微鏡下觀察心肌線粒體和心肌纖維等超微結構的變化并拍照。5. 3實驗結果電鏡下觀察Sd心肌纖維未見異常，心肌肌節(jié)對位整齊，無肌原纖維溶解，線粒體結構完整，嵴排列規(guī)則，清晰可見。NC可見心肌肌節(jié)對位錯亂，呈過度收縮，部分肌原纖維溶解，線粒體腫脹，線粒體邊界不清，部分嵴斷裂溶解，形成線粒體內小空泡，表明鏈脲霉素 STZ所致DM大鼠心肌有一定損傷。各給藥組大鼠心肌肌節(jié)對位基本整齊，僅見少部分錯位， 肌原纖維溶解較少，線粒體稍見腫脹和空泡。6.仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠肝和骨骼肌胰島素受體(InsR)及骨骼肌葡萄糖轉運蛋白4(GLuT4)mRNA表達的影響6.1實驗動物同實驗1。6. 2實驗方法6. 2. IRNA 抽提6. 2. 2RNA純度和完整性分析6. 2. 3 總 RNA 逆轉錄成 cDNA6. 2. 4逆轉錄-聚合酶鏈式擴增反應(RT-PCR)6. 3實驗結果6. 3. 1藥物對鏈脲霉素(STZ)所致DM大鼠肝臟和骨骼肌hsR的影響
1
結果顯示各給藥組DM大鼠肝臟和骨骼肌hsR的數(shù)量較NC均有增加(P < 0. 01)。6. 3. 2藥物對STZ所致DM大鼠骨骼肌GLuT4的影響結果顯示各給藥組大鼠骨骼肌GLuT4的數(shù)量較NC均有增加(P < 0. 01)。實驗結論通過觀察仙人掌果多糖對STZ所致糖尿病大鼠糖代謝、脂代謝及抗氧化作用的影響，并從組織學上研究了仙人掌果多糖對胰腺及糖尿病心肌病的影響。然后從基因水平探討了仙人掌果多糖降糖作用的可能機制。提示1.本研究采用60mg · kg—1 —次腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型，以適宜劑量給糖尿病大鼠灌胃仙人掌果多糖8w后，結果顯示仙人掌果多糖能改善糖尿病“三多一少”的癥狀，顯著降低BG和GHB。同時，也降低糖尿病大鼠的TC、TG、LDL-C和Al，升高HDL-C的含量，這表明仙人掌果多糖促進了糖和脂肪的利用，減輕了糖毒性和脂毒性對機體的損傷，有利于糖尿病的恢復和防止并發(fā)癥的產(chǎn)生。2.組織形態(tài)學觀察顯示仙人掌果多糖在降糖和降脂的同時，改善了 STZ所致糖尿病大鼠胰腺的損傷程度，增加胰島β細胞和胰島素的分泌，因此促進胰島β細胞修復， 增加胰島素分泌可能是仙人掌果多糖作用機制之一。3.糖尿病降低了大鼠抗氧化功能，使MDA水平升高，SOD活性降低。給予仙人掌果多糖后降低了 MDA水平，升高SOD活性，這表明仙人掌果多糖能提高機體的抗氧化功能，減輕過氧化損傷。4.電鏡觀察顯示仙人掌果多糖對STZ所致糖尿病大鼠心肌肌節(jié)對位錯亂、肌原纖維溶解和線粒體腫脹有不同程度的改善，表明其能減輕糖尿病導致的心肌損害。5.通過RT-PCR對肝臟和骨骼肌InsR、骨骼肌GLuT4分析可知，仙人掌果多糖能提高MsR和GLuT4的含量，說明其降糖機制可能是通過增加MsR和GLuT4含量而產(chǎn)生降糖作用的。因此，仙人掌果多糖能降低血糖、糖化血紅蛋白和血脂，改善糖代謝和脂代謝紊亂，提高機體的抗氧化能力，延緩并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，改善機體的狀況，這與其修復受損的胰島β細胞、促進胰島素分泌、增加InR和GLuT4含量有關。五、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)抗腫瘤作用的試驗研究(一 )體外抗腫瘤作用的研究1.實驗材料1. 1細胞株人肝癌細胞株HEPG-2、人卵巢癌細胞株SK0V3、人胃癌細胞株SGC7901 由醫(yī)學科學實驗中心細胞室提供；人肝癌細胞株HCC-LM3、人肝正常細胞株L02等由第二軍醫(yī)大學腫瘤所提供。2.實驗方法2. 1細胞的培養(yǎng)、凍存與復蘇本實驗選用人肝癌、胃癌、卵巢癌4種細胞株，于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中，10%新生牛血清以及青鏈霉素各100U/ml的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細胞生長情況， 0. 25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。凍存時，取對數(shù)生長期細胞，消化、離心、去上清。加入凍存液，使細胞密度約為 1 X IOVml分裝于凍存管中，先置于4°C 60分鐘，再置于-20°c 60分鐘，再置_80°C超低溫冰箱中保存。復蘇時，將超低溫冰箱中的腫瘤細胞凍存管迅速轉入37°C水中，保持凍存管管口部位于水面之上，攪拌加速解凍，待完全解凍后，用75%酒精棉球擦拭凍存管壁。將解凍后細胞轉移到離心管中，加入約6倍凍存液量的培養(yǎng)基IOOOrpm離心5分鐘，棄上清，重復此步一次。再加入培養(yǎng)液，混勻細胞，轉至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。2. 2噻唑藍(MTT)法確定仙人掌果多糖提取物對腫瘤細胞的抑制作用本實驗選擇胃癌7901、肝癌HEPG_2、LM3卵巢癌SK0V3、人正常肝細胞L02細胞株， 采用MTT法研究仙人掌果多糖的抗癌效果。取對數(shù)生長期的腫瘤細胞株，濃度為5X IO4個 /ml，加入到96孔板，每孔加含細胞的培養(yǎng)液100μ 1，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 后， 分別加入不同濃度的仙人掌果多糖，用PBS溶液調整每孔細胞總體積為200 μ 1，4 后加入 2(^說17(^^/1111)，371，5%0)2培養(yǎng)箱孵育411后，棄上清，每孔加入01^0 200 μ 1，放入酶標儀，中速振蕩5分鐘后，于490nm波長處測定吸光度(0D值)，每個濃度平行測定3孔。以 PBS溶液為空白對照，按下列公式求出生長抑制率(IR)。
權利要求
1.仙人掌果多糖在制備降血脂作用的藥物或保健品中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述仙人掌果多糖的應用，其特征在于仙人掌果多糖是從仙人掌果中提取出來的多糖類成分，其總糖含量為60% 80%。
3.根據(jù)權利要求2所述仙人掌果多糖的應用，其特征在于仙人掌果多糖的制備方法為取仙人掌果，加4 10倍重量的水超聲提取0. 5 2. 5小時，提取液濃縮，加入40 95%的乙醇，調節(jié)濃縮液的乙醇濃度至40 90%進行沉淀，然后在1000 IOOOOrpm轉速下離心2 lOmin，離心沉淀物加水溶解，用體積比為1 5 2 10的無水乙醇和乙酸乙酯混合液萃取1 4次，水層用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，濃縮，干燥，即得。
4.根據(jù)權利要求3所述仙人掌果多糖的應用，其特征在于=Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白的過程為用體積比為氯仿正丁醇=4 10 1 5的Sevage溶液萃取水溶液 1 3次后，取水層液，調pH至5 7，向水溶液中加入1 如/IOOml的木瓜蛋白酶，45 65°C保溫20 ^h，1000 IOOOOrpm離心2 lOmin，去除底層沉淀，得仙人掌果多糖脫蛋白液。
5.根據(jù)權利要求1或2所述仙人掌果多糖的應用，其特征在于取仙人掌果多糖，加入或不加藥用輔料，按照常規(guī)方法制備成藥物制劑。
6.根據(jù)權利要求1或2所述仙人掌果多糖的應用，其特征在于將仙人掌果多糖與其它藥用成分組合，并加入或不加藥用輔料，按照常規(guī)方法制備成藥物制劑。
7.根據(jù)權利要求1或2所述仙人掌果多糖的應用，其特征在于取仙人掌果多糖，加入或不加輔料，按照常規(guī)方法制備成保健品。
8.根據(jù)權利要求1或2所述仙人掌果多糖的應用，其特征在于將仙人掌果多糖與其它物質組合，加入或不加輔料，按照常規(guī)方法制備成保健品。
全文摘要
本發(fā)明公開了從仙人掌果中提取的仙人掌果多糖在制備降血脂作用的藥物或保健品中的應用。由于仙人掌果多糖可控制高血壓的發(fā)生發(fā)展，對防治高脂血癥和肝脂肪變性的發(fā)生發(fā)展有積極意義，對防治糖尿病及其并發(fā)癥有良好的潛在應用價值，并具有一定的抗腫瘤作用，因此本發(fā)明為開發(fā)防治高血脂的藥物或保健品奠定了基礎，有效促進了仙人掌果資源的充分利用。而且仙人掌果屬于天然植物資源，其藥用和保健效果好，對人體多個臟器及系統(tǒng)具有調節(jié)和保護作用，價格相對低廉，副作用相對較少，因此仙人掌果多糖在制備降血脂作用的藥物或保健品方面將具有良好的應用前景。
文檔編號A61K31/715GK102397287SQ20111023232
公開日2012年4月4日 申請日期2008年9月9日 優(yōu)先權日2008年9月9日
發(fā)明者劉華鋼 申請人:劉華鋼