專利名稱：一種長春花屬生物堿脂質體及其生產工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種長春花屬生物堿脂質體及其生產工藝，具體地說是長春新堿、長春堿和長春瑞濱的脂質體和它們的pH梯度法生產工藝，屬于化學制藥領域。
背景技術：
長春花屬生物堿如長春新堿、長春瑞濱和長春堿是臨床上常用的廣譜抗腫瘤藥物。目前主要應用于急慢性白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤，以及一些實體腫瘤，如神經(jīng)母細胞瘤、腎母細胞瘤和Ewing肉瘤及乳腺癌和小細胞肺癌等。但是如同其他抗腫瘤化療藥物一樣，長春新堿在使用過程中對患者產生較大的毒副作用，主要為限制劑量的毒副作用有神經(jīng)毒性，多在給藥后6～8周出現(xiàn)，表現(xiàn)為感覺神經(jīng)和自主神經(jīng)受損，嚴重的會出現(xiàn)共濟失調、足下垂或腦神經(jīng)麻痹。此外還有胃腸道反應，漏出血管外對皮下組織的刺激作用造成病人疼痛難忍等。這些毒副作用極大地限制了長春新堿的臨床應用。
脂質體為磷脂雙層膜結構，主要成分是磷脂和膽固醇，對人體無毒性無免疫原性。由于其尺徑大小，表面易被控制，膜特性，容量大和生物兼容性等特點，近年來被用于一些抗腫瘤藥物的包裹，當藥物被投放到病灶部位后，藥物從脂質體中緩慢釋放出來，達到降低毒性提高療效的目的，因此用脂質體包裹長春新堿不失為一種理想的降低毒性并消除注射疼痛的方法。
目前，國外脂質體長春新堿作為藥物正在進行臨床III期的試驗，主要成分為長春新堿、神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin，SM)和膽固醇。這種脂質體降低了長春新堿的毒性，但是藥物穩(wěn)定性和體內循環(huán)時間都有待提高。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的主要技術問題是提供一種毒副作用小、穩(wěn)定性高、體內循環(huán)時間長的長春花屬生物堿脂質體。
本發(fā)明要解決的另一個技術問題是提供這種長春花屬生物堿脂質體的生產工藝。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案一種長春花屬生物堿脂質體，由長春花屬生物堿、脂質體材料和抗氧化劑組成，藥/脂比例(w/w)為0.05～0.2∶1；其中脂質體材料包括磷脂和膽固醇，二者的摩爾比為40～60∶30～50mol％；抗氧化劑由α-tocopherol和desferal組成，二者的濃度分別為0.015～0.025mg/ml及0.10～0.20mg/ml。
脂質體材料中還含有DSPE-PEG2000(多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)，磷脂、膽固醇和DSPE-PEG2000三者的摩爾比為40～60∶30～50∶4～9。
所述磷脂選自神經(jīng)鞘磷脂(MS)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)或氫化磷脂酰膽堿(HSPC)中的一種。
所述長春花屬生物堿選自長春新堿、長春瑞濱和長春堿中的一種，本發(fā)明使用的是它們的硫酸鹽或重酒石酸鹽(vinorelbine bitartrate)，可方便地購得。
我們使用過DSPC、HSPC和SM分別與膽固醇組成磷脂雙層膜結構的脂質體，其中以SM和膽固醇組成的脂質體穩(wěn)定性最好。SM(或者HSPC、DSPC)是組成雙層膜的磷脂，是脂質體最基本組成成分。膽固醇的作用是降低膜的流動性提高雙層膜的穩(wěn)定性。它們濃度的配比原則是為取得最佳穩(wěn)定性的脂質體，SM(或HSPC、DSPC)40～60mol％，膽固醇30～50mol％，高于或低于這個濃度比例脂質體都不會穩(wěn)定，有文獻報道膽固醇濃度不能低于30mol％，否則就不會起到任何作用，但是膽固醇濃度又不能高于50mol％，那樣反而會加快包裹藥物從脂質體中滲漏出來。
提高藥物穩(wěn)定性是通過在配方中加入微量的α-tocopherol和desferal實現(xiàn)的。它們的作用一個是抑制磷脂和膽固醇的水解和氧化，另一個作用是抑制長春新堿的氧化。穩(wěn)定性試驗表明，在本發(fā)明配方劑量下合用這兩個抗氧化劑的脂質體的滲漏率遠遠低于只用其中一種抗氧化劑的脂質體。
通常情況下，藥脂比越低藥物的包封率會越高，穩(wěn)定性也隨之增加，因此很多包封率較高的脂質體藥物的藥脂比在0.05∶1或更低。然而藥脂比越低，進入脂質體中的藥物含量越少，極不利于藥物的臨床應用。但是由于脂質體容量有限，如果再加上均勻分布于磷脂雙層兩側的大分子PEG，又占用部分脂質體容量，所以提高藥脂比非常困難。本發(fā)明采用上述配方，使藥脂比最高能夠達到0.2∶1，同時包封率不低于90％。國外文獻和脂質體產品中從未見過高于此比例的，國內許多研究機構所制備的脂質體藥物的藥脂比遠遠低于此比例。
在減少藥物毒副作用的同時盡量延長藥物在體內循環(huán)的時間從而增加藥物療效也是脂質體藥物研發(fā)所追求的目標，本發(fā)明通過在配方中加入親水性大分子多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)來實現(xiàn)這個目的，與國外只有SM和膽固醇組成的脂質體相比，本發(fā)明在體內的循環(huán)時間明顯延長。對于長春花屬生物堿而言，所用DSPE-PEG2000的較佳濃度范圍是4～9mol％低于4mol％也可延長藥物的體內循環(huán)時間，但效果不十分顯著；而PEG的濃度超過9mol％時，會使脂質體形成泡沫狀micelle而不呈現(xiàn)雙層結構。DSPE-PEG2000能夠增強脂質體膜表面親水性，降低各種血漿蛋白對脂質體的結合，使脂質體可非常有效地躲避網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)的吞噬，穩(wěn)定性及包封率得到提高，漏出率降低，使脂質體的體循環(huán)時間明顯延長，體內重新分布，降低所包藥物的毒性反應，同時在病灶中的濃度也顯著提高，因而增加治療指數(shù)。另外由于注射時藥物仍包裹在脂質體中，消除了藥物漏出后對組織的刺激造成疼痛。
為了便于實施，本發(fā)明選擇pH梯度法作為基本生產工藝，通過試驗優(yōu)化其各項反應條件，最終摸索出適合于長春花屬生物堿脂質體規(guī)?；a的工藝路線。
一種長春花屬生物堿脂質體注射液的生產工藝，包括以下步驟(1)制備多層脂質體按照前述配方的量配制含有脂質體材料和抗氧化劑的氯仿或氯仿/甲醇溶液，旋轉蒸發(fā)成膜，加入200～400mM，pH值為2～5檸檬酸溶液水化；(2)制備小單層脂質體將步驟(1)得到的含有多層脂質體的檸檬酸溶液進行五個冷凍-融化循環(huán)后，經(jīng)擠壓機擠壓成粒徑為80～120納米的小單層脂質體液；(3)制備長春花屬生物堿脂質體將長春花屬生物堿的硫酸鹽或重酒石酸鹽溶液在60℃條件下加入到小單層脂質體液中混合，應用0.3～0.6M的磷酸氫二鈉溶液調節(jié)脂質體外液pH值至7.0～7.6，在60℃水浴中放置10分鐘以上，使長春花屬生物堿進入小單層脂質體中，冷卻至室溫，除去游離的長春花屬生物堿得到成品。
步驟(1)中使用200～400mM檸檬酸的作用主要是提高長春花屬生物堿的包封率。200～400mM可穩(wěn)定脂質體滲透壓，優(yōu)選濃度為300mM；pH值采用2～5主要是建立pH梯度。包封率最好的pH值是2，但考慮到酸性過強，在脂質體破壞后會對人體有害，所以我們優(yōu)選pH值4.0。
所述步驟(2)中的五個冷凍-融化循環(huán)是指將多層脂質體用干冰(-20℃)冷凍后在室溫下自然融化，然后再用干冰冷凍，如此循環(huán)五次。作用是進一步提高包封率和穩(wěn)定性。小單層脂質體的粒徑優(yōu)選100納米。
所述步驟(3)所應用的磷酸氫二鈉溶液濃度為0.5M。用磷酸氫二鈉溶液調節(jié)脂質體外pH值到高于7.0即可，但不能高過7.6，否則pH梯度不容易保持。
所述步驟(3)中除去游離的長春新堿的方法為層析法和離心分離法，屬本領域公知常識，故不冗述。層析柱法可以使用Sephadex G-50柱，將脂質體長春新堿上柱，生理鹽水洗脫即可離心法是將脂質體長春新堿置入離心機，在100,000g條件下離心5分鐘，去除上清液，用生理鹽水溶解pellet即可。
本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明公開的配方能夠制得包封率大于90％的脂質體，毒性低，穩(wěn)定性高，加入DSPE-PEG2000后，進一步延長了藥物的體內循環(huán)時間，有利于藥物的緩釋和療效提高。使用優(yōu)化后的pH梯度法操作簡便、省時，制得的脂質體包封率高，回收率90％，磷脂，膽固醇及DSPE-PEG2000的回收率為85％左右。脂質體滲漏率低，粒徑均勻(100±10納米)，穩(wěn)定性好，4℃放置保存一年粒徑無變化，包封率仍在85％以上。同時該方法便于滅菌及除去熱原，可實現(xiàn)規(guī)模生產。
下面結合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明。
具體實施例方式
表1脂質體配方

以上材料來源如下長春堿(vinblastine)、長春新堿(硫酸鹽)和長春瑞濱(vinorelbine)購于深圳萬樂藥業(yè)。
神經(jīng)鞘磷脂(SM，sphingomyelin)、DSPC(distearoylphosphatidylcholine)、HSPC(hydrogenated soybean phosphatidylcholine)、膽固醇和PEG2000-DSPE購于美國Avantipolar Lipids(Alabaster，AL)公司。
α-tocopherol和desferal購于美國Sigma公司。
實施例11.制備多層脂質體將注射用SM、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉蒸發(fā)瓶中旋轉蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質體在60℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質體中混合，應用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調節(jié)pH值至7.2，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質，即得到長春新堿脂質體成品。
本品脂質體長春新堿穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗中，24小時后75-80％的長春新堿仍包裹于脂質體中。
實施例21.將注射用SM和膽固醇溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉蒸發(fā)瓶中旋轉蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質體在60℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質體中混合，應用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調節(jié)pH值至7.2，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質，即得到長春新堿脂質體成品。
實施例31.制備多層脂質體注射用DSPC、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉蒸發(fā)瓶中旋轉蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質體在60℃條件下，按藥/脂比為0.1∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質體中混合，應用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調節(jié)pH值至7.4，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質，即得到長春新堿脂質體成品。
本品脂質體長春新堿穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗中，24小時后75-80％的長春新堿仍包裹于脂質體中。
實施例四1.制備多層脂質體注射用DSPC和膽固醇溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉蒸發(fā)瓶中旋轉蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質體在60℃條件下，按藥/脂比為0.1∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質體中混合，應用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調節(jié)pH值至7.4，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質，即得到長春新堿脂質體成品。
實施例51.制備多層脂質體將注射用HSPC、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉蒸發(fā)瓶中旋轉蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質體在60℃條件下，按藥/脂比為0.05∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質體中混合，應用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調節(jié)pH值至7.4，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質，即得到長春新堿脂質體成品。
本品脂質體長春新堿穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗中，24小時后75-80％的長春新堿仍包裹于脂質體中。
實施例61.制備多層脂質體將注射用HSPC和膽固醇溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉蒸發(fā)瓶中旋轉蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質體在60℃條件下，按藥/脂比為0.05∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質體中混合，應用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調節(jié)pH值至7.4，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質，即得到長春新堿脂質體成品。
實施例71.制備多層脂質體將注射用SM、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉蒸發(fā)瓶中旋轉蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質體在60℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質體中混合，應用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調節(jié)pH值至7.6，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質，即得到長春新堿脂質體成品。
本品脂質體長春新堿穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗中，24小時后75-80％的長春新堿仍包裹于脂質體中。
實施例81.制備多層脂質體將注射用SM、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉蒸發(fā)瓶中旋轉蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春新堿脂質體在60℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將注射用硫酸鹽長春新堿溶液加入小單層脂質體中混合，應用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調節(jié)pH值至7.0，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春新堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質，即得到長春新堿脂質體成品。
本品脂質體長春新堿穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗中，24小時后75-80％的長春新堿仍包裹于脂質體中。
實施例9
1.制備多層脂質體將注射用SM和膽固醇溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉蒸發(fā)瓶中旋轉蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春堿脂質體在60℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將注射用硫酸鹽長春堿溶液加入小單層脂質體中混合，應用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調節(jié)pH值至7.4，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春堿。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質，即得到長春堿脂質體成品。
本品脂質體長春堿穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗中，24小時后75-80％的長春堿仍包裹于脂質體中。
實施例101.制備多層脂質體將注射用SM、膽固醇和DSPE-PEG2000三者溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，加入抗氧化劑α-tocopherol和desferal。將上述液體放入旋轉蒸發(fā)瓶中旋轉蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在300mM pH4.0檸檬酸溶液中。
2.制備小單層脂質體五個冷凍-融化循環(huán)后，將上述液體放入擠壓機中多次擠壓，得到粒徑100納米的小單層脂質體。擠壓使用的碳纖維膜分別為0.14及0.08納米。
3.制備長春瑞濱脂質體在60℃條件下，按藥/脂比為0.2∶1的量將注射用重酒石酸鹽長春瑞濱溶液加入小單層脂質體中混合，應用0.5M的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液調節(jié)pH值至7.0，在60℃水浴中放置10分鐘。冷卻至室溫，除去游離的長春瑞濱。
通過0.22納米的微孔膜除菌、熱原及其它雜質，即得到長春瑞濱脂質體成品。
本品脂質體長春瑞濱穩(wěn)定性好，在10倍緩沖液試驗以及與小牛血清培養(yǎng)的試驗中，24小時后75-80％的長春瑞濱仍包裹于脂質體中。
實施例11、急性毒性試驗一.材料DBA/2J小鼠和CD-1小鼠購于中國醫(yī)學科學院動物研究所硫酸長春新堿購于深圳萬樂藥業(yè)。
硫酸長春新堿脂質體注射液，實施例2。
二.方法比較硫酸長春新堿和硫酸長春新堿脂質體注射液一次性小鼠尾靜脈給藥后的急性毒性反應和死亡分布。
將小鼠隨機分組，每組10只，硫酸長春新堿和硫酸長春新堿脂質體注射液各用30只小鼠。分別注射硫酸長春新堿和硫酸長春新堿脂質體注射液，劑量為2、4、6毫克/公斤體重。觀察37天，每日觀察小鼠體重變化、急性中毒癥狀和死亡數(shù)目來確定半數(shù)致死量(LD50)。結果見表2。
三.結果表2.長春新堿和脂質體長春新堿的急性毒性試驗(LD50)

長春新堿脂質體有效降低載荷藥物的毒性，在不同種數(shù)的動物試驗中降低毒性1.7-2.1倍。
權利要求
1.一種長春花屬生物堿脂質體，其特征在于由長春花屬生物堿、脂質體材料和抗氧化劑組成，藥/脂比例(w/w)為0.05～0.2∶1；其中脂質體材料包括磷脂和膽固醇，二者的摩爾比為40～60∶30～50mol％；抗氧化劑由α-tocopherol和desferal組成，二者的濃度分別為0.015～0.025mg/ml及0.10～0.20mg/ml。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種長春花屬生物堿脂質體，其特征在于所述脂質體材料中還含有多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)；磷脂、膽固醇和DSPE-PEG2000三者的摩爾比為40～60∶30～50∶4～9mol％。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種長春花屬生物堿脂質體，其特征在于所述磷脂選自神經(jīng)鞘磷脂(MS)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)或氫化磷脂酰膽堿(HSPC)中的一種。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的一種長春花屬生物堿脂質體，其特征在于所述長春花屬生物堿選自長春新堿、長春瑞濱和長春堿中的一種。
5.一種長春花屬生物堿脂質體的生產工藝，包括以下步驟(1)制備多層脂質體按照權利要求1或2所述配方的量配制含有脂質體材料和抗氧化劑的氯仿或氯仿/甲醇溶液，旋轉蒸發(fā)成膜，加入200～400mM，pH值為2～5檸檬酸溶液水化；(2)制備小單層脂質體將步驟(1)得到的含有多層脂質體的檸檬酸溶液進行五個冷凍-融化循環(huán)后，經(jīng)擠壓機擠壓成80～120納米的小單層脂質體液；(3)制備長春花屬生物堿脂質體將長春花屬生物堿的硫酸鹽或重酒石酸鹽溶液在60℃條件下加入到小單層脂質體液中混合，應用0.3～0.6M的磷酸氫二鈉溶液調節(jié)脂質體外液pH值至7.0～7.6，在60℃水浴中放置10分鐘以上，使長春花屬生物堿進入小單層脂質體中，冷卻至室溫，除去游離的長春花屬生物堿得到成品。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種長春花屬生物堿脂質體的生產工藝，其特征在于所述步驟(1)中檸檬酸濃度為300mM；pH值為4.0。
7.根據(jù)權利要求5所述的一種長春花屬生物堿脂質體的生產工藝，其特征在于所述步驟(2)中的五個冷凍-融化循環(huán)是指將多層脂質體用干冰冷凍后在室溫下自然融化，然后再用干冰冷凍，如此循環(huán)五次。
8.根據(jù)權利要求5所述的一種長春花屬生物堿脂質體的生產工藝，其特征在于所述步驟(2)中小單層脂質體的粒徑為100納米。
9.根據(jù)權利要求5所述的一種長春花屬生物堿脂質體的生產工藝，其特征在于所述步驟(3)所應用的磷酸氫二鈉溶液濃度為0.5M。
10.根據(jù)權利要求5所述的一種長春花屬生物堿脂質體的生產工藝，其特征在于所述步驟(3)中除去游離的長春新堿的方法為層析法或離心分離法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種長春花屬生物堿脂質體及其生產工藝，屬于化學制藥領域。一種長春花屬生物堿脂質體，由長春花屬生物堿、脂質體材料和抗氧化劑組成，藥/脂比例(w/w)為0.05～0.2∶1；其中脂質體材料包括磷脂和膽固醇，二者的摩爾比為40～60∶30～50mol％；抗氧化劑由α－tocopherol和desferal組成，二者的濃度分別為0.015～0.025mg/ml及0.10～0.20mg/ml。該生產工藝包括(1)制備多層脂質體；(2)制備小單層脂質體；(3)制備長春花屬生物堿脂質體。本發(fā)明的優(yōu)點是成品毒性小、包封率高、穩(wěn)定性好；方法操作簡便，可工業(yè)化生產。
文檔編號A61K9/127GK1795859SQ20041010262
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月27日 優(yōu)先權日2004年12月27日
發(fā)明者曹利人, 馬潔 申請人:北京文卓醫(yī)藥生物制品技術開發(fā)有限公司, 中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所