一種具有腫瘤主動靶向及pH敏感性細(xì)胞穿膜能力的新型多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種既能主動靶向腫瘤細(xì)胞高表達的整合素受體，同時又能高效介導(dǎo)入胞的新型多肽。所述的新型多肽TR（c(RGDfK)- AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-Cys）是由特異性靶向整合素受體的環(huán)狀RGD肽（c(RGDfK)） 和非特異性的pH敏感性細(xì)胞穿膜肽TH(AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-Cys)通過共價鍵連接而成。將該新型多肽TR修飾于載藥系統(tǒng)表面，其能介導(dǎo)載藥系統(tǒng)更加高效地傳遞到腫瘤內(nèi)部，從而更加有效地治療腫瘤。
【專利說明】一種具有腫瘤主動靶向及pH敏感性細(xì)胞穿膜能力的新型多肽

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物制劑【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地說，本發(fā)明涉及一種既有主動靶向腫瘤細(xì)胞高表達的整合素受體的能力又具有pH敏感性細(xì)胞穿膜能力的新型多肽。該新型多肽經(jīng)修飾于載藥系統(tǒng)表面用于介導(dǎo)載藥系統(tǒng)高效主動靶向高表達整合素受體的腫瘤及高效介導(dǎo)其入胞，達到提高腫瘤治療效果的目的。

【背景技術(shù)】
[0002]1.癌癥的發(fā)病率和死亡率近年來呈逐年上升的趨勢，已經(jīng)嚴(yán)重威脅了人類健康。盡管有多種治療癌癥的手段，但目前最為常用的仍然是化療。由于化療藥物往往在正常組織和腫瘤組織間缺乏選擇性，因此其治療效果和應(yīng)用范圍常受到限制。目前，納米載藥系統(tǒng)的發(fā)展給祀向腫瘤治療帶來新的突破。
[0003]2.相對于普通的載藥系統(tǒng)，特異性配體修飾的載藥系統(tǒng)增加了其在腫瘤部位的蓄積，同時降低了在非靶向性器官中的蓄積(如肝，脾等)。其中，整合素(integrin)是一類細(xì)胞黏附受體分子，在所有的有核細(xì)胞表面均廣泛表達，其在體內(nèi)能夠介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間，以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的互相黏附。整合素是由α和β亞基通過非共價鍵結(jié)合形成的異二聚體，在脊椎動物體內(nèi)，整合素有18種α亞基和8種β亞基，其可以組成約24種不同的異二聚體結(jié)構(gòu)。其中整合素ανβ3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞及腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞表面高度表達，與腫瘤的血管發(fā)生、腫瘤轉(zhuǎn)移及腫瘤的抗放射治療密切相關(guān)。因此，整合素ανβ3常被用作腫瘤靶向的特異性靶點。已有研究證實，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)的三肽序列能夠特異性識別含α ν亞基的整合素家族。進一步的研究也已證實，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的R⑶能夠高度地與整合素ανβ3、ανβ5結(jié)合。然而，特異性配體(如RGD、Tf等)雖能主動靶向高表達相關(guān)受體的腫瘤細(xì)胞，但受制于優(yōu)于受體的飽和效應(yīng)不能高效地介導(dǎo)載藥系統(tǒng)進入腫瘤細(xì)胞。
[0004]3.另一方面，細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs)是一類具有很強的穿透細(xì)胞膜能力的短肽。穿膜肽在生理條件下帶有正電荷，它既可以從生物體內(nèi)提取，也可以通過人工合成。目前，細(xì)胞穿膜肽已經(jīng)成功地應(yīng)用于蛋白、多肽、核苷酸及小分子物質(zhì)的遞釋，這類載藥系統(tǒng)的優(yōu)勢在于穿膜效率高。但因為其本身具有下述兩個特征而不能廣泛地被使用:①細(xì)胞穿膜肽帶正電荷的特性使得其在血液循環(huán)過程中容易與調(diào)理蛋白結(jié)合從而使所介導(dǎo)的載藥系統(tǒng)快速地被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除；②細(xì)胞穿膜肽在正常的組織以及腫瘤之間不具有選擇性。
[0005]4.相對于正常的細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞是一種快速增長的細(xì)胞，在生長過程中需要消耗大量的氧氣和營養(yǎng)，產(chǎn)生過剩的乳酸，導(dǎo)致腫瘤部位的PH偏酸。另外，正常組織中的微血管內(nèi)皮間隙致密、結(jié)構(gòu)完整，載藥系統(tǒng)不易透過血管壁，而實體瘤組織中血管豐富、血管壁間隙較寬、結(jié)構(gòu)完整性差，淋巴回流缺失，造成載藥系統(tǒng)具有選擇性高通透性和滯留性，這種現(xiàn)象被稱作實體瘤組織的高通透性和滯留效應(yīng)，簡稱EPR效應(yīng)。
[0006]5.為屏蔽穿膜肽的正電性，最新的研究利用組氨酸的修飾使穿膜肽獲得pH敏感性。在B1materials [34 (2013) 7980-7993]雜志上，本課題組介紹了一種腫瘤微環(huán)境敏感的TH肽修飾的脂質(zhì)體在治療腫瘤方面的應(yīng)用。TH肽上的組氨酸的等電點Ip約為6.5，因此TH肽修飾的脂質(zhì)體在血液循環(huán)中(pH7.4)帶負(fù)電荷從而延長了 TH肽修飾的脂質(zhì)體在血液中的循環(huán)時間；當(dāng)通過EPR效應(yīng)被動靶向蓄積到腫瘤部位時，在腫瘤的微酸環(huán)境中(pH6.2~pH6.8)TH肽中的組氨酸被質(zhì)子化而帶正電荷，使得TH肽在微酸環(huán)境中恢復(fù)穿透細(xì)胞膜的能力，即轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ畹募?xì)胞穿膜肽。TH肽的上述特性增強了 TH肽修飾的脂質(zhì)體在腫瘤部位的蓄積以及進入腫瘤深部的能力。然而，在腫瘤部位具有較強細(xì)胞穿膜能力的TH肽卻不具有在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞間的選擇性，仍然會造成一定的副作用。
[0007]6.因此，我們希望構(gòu)建一種既具有主動靶向能力，又能高效介導(dǎo)入胞的新型多肽。本發(fā)明擬將環(huán)RGD與pH敏感的細(xì)胞穿膜肽TH通過共價鍵鏈接起來，達到既有主動靶向高表達整合素受體的腫瘤，同時又能高效介導(dǎo)入胞的能力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]1.本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種既能主動靶向腫瘤高表達的整合素受體又有PH敏感性細(xì)胞穿膜能力的新型多肽，可修飾于載藥系統(tǒng)表面用于介導(dǎo)載藥系統(tǒng)主動靶向高表達整合素受體的腫瘤及高效介導(dǎo)其入胞。
[0009]2.具體而言，其特征在于，新型多肽TR的c (RGDfK)部分能主動靶向腫瘤高表達的整合素受體。新型多肽TR的TH部分上的組氨酸等電點Ip約為6.5，在腫瘤微酸環(huán)境中TH肽中的組氨酸被質(zhì)子化而具有穿過細(xì)胞膜的能力；而在體內(nèi)循環(huán)過程中，組氨酸不被質(zhì)子化使得TH肽穿過細(xì)胞膜的能力被屏蔽。因此，新型多肽TR既具有受體介導(dǎo)入胞又具有與帶負(fù)電荷的腫瘤細(xì)胞靜電吸附高效介導(dǎo)入胞的雙重功效，經(jīng)其修飾的載藥系統(tǒng)能高效地進入腫瘤細(xì)胞，達到治療腫瘤的目的。
[0010]3.本發(fā)明中，新型多肽TR的氨基酸序列為C (RGDfK) -AGYLLGHINLHHLAHL (Aib)HHIL-Cys。
[0011]本發(fā)明的突出優(yōu)點是，新型多肽TR在腫瘤微酸環(huán)境中，既可以通過高表達的整合素受體介導(dǎo)入胞，同時又可以通過靜電吸附作用入胞，這兩種作用同時發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。將新型多肽TR修飾于載藥系統(tǒng)表面后用于介導(dǎo)載藥系統(tǒng)主動祀向腫瘤的高表達的整合素受體及高效介導(dǎo)其入胞。
[0012]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明的新型多肽TR修飾的載藥系統(tǒng)進行詳細(xì)的描述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中:
1.圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0014]2.TR肽修飾的載藥系統(tǒng)的表征，圖2 (A) TR修飾的脂質(zhì)體(TR-Lip)在微酸環(huán)境中穿膜能力轉(zhuǎn)換的示意圖；(B) TR修飾的納米粒(TR-NPs)的粒徑分布；(C) TR修飾的膠束(TR-micellar)在不同pH條件下的電位分布；(D) TR修飾的脂質(zhì)納米粒復(fù)合物(TR-L-NPs)與整合素ανβ3的結(jié)合能力。
[0015]3.圖3為TR修飾的脂質(zhì)體(TR-Lip)在B16F10細(xì)胞(高表達整合素α ν β 3)上的攝取能力。
[0016]4.圖4 (A)包載DiR的經(jīng)TR肽修飾的納米粒(DiR-TR-NPs)在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布。(B)載DiD的經(jīng)TR肽修飾的脂質(zhì)納米粒復(fù)合物(DiD-TR-L-NPs)穿透腫瘤的深度。
具體實施例
[0017]實施例1
TR肽修飾的脂質(zhì)體(TR-Lip)的制備以及表征
采用薄膜分散法制備脂質(zhì)體。分別稱取1.2 mg大豆磷脂、0.4 mg膽固醇、0.05 mg單甲氧基修飾的聚乙二醇和I mg TR肽修飾的聚乙二醇，將其全部溶于氯仿/甲醇混合液中，旋轉(zhuǎn)，蒸發(fā)，形成薄膜層，置于真空干燥器中過夜，使得有機溶劑充分揮發(fā)干凈。加入Iml !fepes緩沖液(pH 7.4)，置于搖床(180 rpmX30 min，37 °C )震搖后，用超聲儀超聲(5次X5 sX15 s)后，得到粒徑均一的TR-Lip。取100 μ I TR-Lip稀釋10倍，采用Zetanano粒徑儀測其粒徑分布以及電荷分布。TR-Lip的粒徑在150 nm左右。在pH 7.4條件下，TR-Lip的Zeta電位在-7 mV左右；在pH 6.5條件下，TR-Lip的Zeta電位在+5 mV左右。用表面等離子共振儀(SPR)測定不同多肽修飾的脂質(zhì)體與整合素的結(jié)合力，結(jié)果證明TR-Lip與整合素的結(jié)合能力最強。
[0018]實施例2
TR肽修飾的納米粒(TR-NPs)的制備以及表征
采用W/0/W型乳化-溶劑蒸發(fā)法制備TR肽修飾的納米粒。將一定量的PLA-PLL-TR溶于二氯甲烷中構(gòu)成有機相，以純水為水相，按一定比例混合有機相與水相，超聲形成初乳。將初乳傾入含泊洛沙姆F-18乳化劑的外水相中，繼續(xù)超聲得到復(fù)乳后置燒杯中，攪拌揮盡有機溶劑得到納米粒膠體分散體系。采用Zetanano粒徑儀測其粒徑分布以及電荷分布；用SPR儀測定其與整合素的結(jié)合力。TR-NPs的粒徑為90 nm左右。在pH 7.4條件下，TR-NPs的Zeta電位為-7.5 mV左右；在pH 6.5條件下，TR-NPs的Zeta電位為+6 mV左右。用表面等離子共振儀(SPR)測定不同多肽修飾的納米粒與整合素的結(jié)合力，，TR-NPs與整合素的結(jié)合能力最強。
[0019]實施例3
TR肽修飾的膠束(TR-micelle)的制備以及表征
分別取10 mg DSPE-PEG-TR與20 mg DSPE-PEG-OMe溶于無水氯仿，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜后減壓干燥過夜，加入20 mM Ifepes緩沖液(pH 7.4)5 ml, 37 1:水浴振蕩20 1^11，用0.22μ m微孔濾膜過濾,得到TR肽修飾的聚合物膠束(TR-micelle)。采用Zetanano粒徑儀測其粒徑分布以及電荷分布；用SPR儀測定其與整合素的結(jié)合力。TR-micelle的粒徑為112nm左右。在pH 7.4條件下，TR-micelle的Zeta電位為_8 mV左右；在pH 6.5條件下，TR-micelle的Zeta電位為+4 mV左右。用表面等離子共振儀(SPR)測定不同多肽修飾的膠束與整合素的結(jié)合力，TR-micelle與整合素的結(jié)合能力最強。
[0020]實施例4
TR肽修飾的脂質(zhì)納米粒(TR-L-NPs)的制備及表征
將卵磷脂和DSPE-PEG-TR溶于4 %的乙醇溶液中，加熱到65 °C。將含20%的PLGA乙腈溶液逐滴加入到上述預(yù)熱的脂質(zhì)溶液中，輕輕的振蕩，然后渦旋3 min0繼續(xù)攪拌2 h，使得納米粒充分地完成自主裝，然后在37 °C下減壓蒸發(fā)除去有機溶劑。用純水重懸TR-L-NPs，使得最終濃度是I mg/ml。采用Zetanano粒徑儀測其粒徑分布以及電荷分布；用SPR儀測定其與整合素的結(jié)合力。TR-L-NPs的粒徑為100 nm左右。在pH 7.4條件下，TR-L-NPs的Zeta電位為-6.5 mV左右；在pH 6.5條件下，TR-L-NPs的Zeta電位為+5.5 mV左右。用表面等離子共振儀(SPR)測定不同多肽修飾的脂質(zhì)納米粒與整合素的結(jié)合力，TR-L-NPs與整合素的結(jié)合能力最強。
[0021]實施例5
TR修飾的脂質(zhì)體(TR-Lip)在B16F10細(xì)胞(高表達整合素ανβ3)上的攝取將B16F10按密度5 X 15個/孔細(xì)胞接于6孔板中，在孵箱中孵育24 h后，將載CFPE的四種脂質(zhì)體在不同的PffipH 7.4和pH 6.5)條件下孵育2 h，棄培養(yǎng)液，用冷PBS洗兩次，2%的胰酶消化得到單個細(xì)胞后，培養(yǎng)基終止消化。加入0.5 ml的PBS使成單個懸浮的細(xì)胞，用細(xì)胞流式儀檢測細(xì)胞攝取量。如圖3所示，載CFPE的TR肽修飾的脂質(zhì)體(CFPE-TR-Lip)在pH 6.5條件下進入高表達整合素受體的細(xì)胞的能力最強。
[0022]實施例6
載DiR的TR肽修飾的納米粒(DiR-TR-NPs)在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布以及載DiD的TR肽修飾的脂質(zhì)納米粒復(fù)合物(DiD-TR-L-NPs)穿透腫瘤的能力
將每只C57/BL6的左背部接種2父105個則6?10細(xì)胞，一周后即可看到70 mm 3的腫瘤，待用。將載DiR染料的長循環(huán)納米粒(PEG-NPs)、RGD修飾的納米粒(RGD-NPs)、TH修飾的納米粒(TH-NPs)和TR-NPs經(jīng)過尾靜脈注射到荷瘤小鼠內(nèi)，24 h后，活體成像儀檢測不同載體在荷瘤小鼠的腫瘤部位的蓄積量。如圖4 (A)所示，相對于其他三組的納米粒，DiR-TR-NPs在荷高表達整合素的B16F10腫瘤的C57小鼠的腫瘤部位的蓄積能力最強。
[0023]按如上方式建荷瘤小鼠模型，將載DiD染料的長循環(huán)脂質(zhì)納米粒復(fù)合物(PEG-L-NPs), RGD修飾的脂質(zhì)納米粒復(fù)合物(RGD-L-NPs)、TH修飾的脂質(zhì)納米粒復(fù)合物(TH-L-NPs)和TR修飾的脂質(zhì)納米粒復(fù)合物(TR-L-NPs)經(jīng)過尾靜脈注射到荷瘤小鼠內(nèi)，24h后，將小鼠處死，取出腫瘤，做成切片，觀察不同載體穿透腫瘤的能力。如圖4 (B)所示，DiD-TR-L-NPs穿透腫瘤的能力最強。
【權(quán)利要求】
1.新型多肽TR，具有這樣的特征:新型多肽TR由特異性靶向整合素受體的環(huán)狀RGD肽(c (RGDfK))和非特異性的pH敏感性細(xì)胞穿膜肽TH(AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-Cys)通過共價鍵連接而成，其氨基酸序列為c (RGDfK) -AGYLLGHINLHHLAHL (Aib) HHIL-Cys。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型多肽TR，其特征在于，新型多肽TR既可以由c(RGDfK)肽與TH(AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-Cys)肽通過肽腱相連，也可以通過氨基、羧基、巰基等橋鍵相連。
3.一種基于權(quán)利要求1所述的新型多肽TR修飾的載藥系統(tǒng)，其特征在于，TR肽通過聚乙二醇連接后修飾于載藥系統(tǒng)的表面。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的載藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的載藥系統(tǒng)包括但不限于脂質(zhì)體，納米粒，膠束或脂質(zhì)納米粒復(fù)合物。
【文檔編號】A61P35/00GK104497149SQ201510001268
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月5日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月5日
【發(fā)明者】何勤, 石凱榮, 高會樂 申請人:四川大學(xué)