專利名稱：皮膚材料及其制備方法
皮膚材料及其制備方法
技術領域：
本是發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域，特別是一種皮膚材料及其制備方法。
背景技術：
皮膚是人體最大的器官，覆蓋全身，使體內(nèi)各種組織和器官免受物理性、機械性、 化學性和病原微生物性的侵襲，具有重要的生理功能。由于炎癥、潰瘍、燒傷等因素造成的 皮膚損傷，嚴重的可危及生命。 目前的臨床治療方式有自體皮膚移植、異體皮膚移植以及異種皮膚移植。通過皮 膚移植可以挽救病人生命、并有助于創(chuàng)面愈合。表皮干細胞(ESC)等干細胞移植治療，在正 常情況下，保證了皮膚的微環(huán)境和毛發(fā)生長，在組織損傷后參與其修復，同時其也是潛在的 多能干細胞，完全可以利用其構建出具有完整表皮、真皮、皮膚附屬器的功能健全的人工皮 膚，實現(xiàn)創(chuàng)面由暫時性解剖修復向功能永久性修復的轉變。 當燒傷面積超過50%時，由于自體皮膚來源有限，因此在大多數(shù)情況下無法應用 自體皮膚移植，而且自體皮膚移植給患者造成新的創(chuàng)傷，治療費用巨大。盡管異體皮膚移植 和異種皮膚移植可以克服以上問題，充當臨時的傷面覆蓋物，但是伴隨移植會產(chǎn)生排斥反 應和可能的一些移植疾病。盡管組織工程皮膚是最先進的組織工程產(chǎn)物，但是它缺乏天然 組織的功能?；蛑委煹姆椒ㄍㄟ^賦予新的功能以及提高細胞的功能，可以用來制造新一 代皮膚替代物。 盡管干細胞移植治療和基因治療等方法在臨床應用上已經(jīng)取得了巨大的成功，但 是仍有問題未能很好的解決，在愈合過程中由于細胞之間的生長和分化缺乏正確的誘導， 植入的細胞和新生細胞及周邊的健康細胞之間的生長不同步，因而無法產(chǎn)生正常的皮膚附 屬物。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，有必要提供一種能夠調(diào)控細胞生長和分化的皮膚材料。 此外，還有必要提供一種能夠調(diào)控細胞生長和分化的皮膚材料的制備方法。 —種皮膚材料，包括生物材料和攜帶光敏感基因和目的基因的細胞，所述細胞接
種于所述生物材料中。 在優(yōu)選的實施例中，所述細胞為自體細胞、異體細胞或自體細胞和異體細胞的混 合物。 在優(yōu)選的實施例中，所述細胞為表皮細胞、成纖維細胞、干細胞或前體細胞。
在優(yōu)選的實施例中，所述光敏感基因包括興奮型通道蛋白基因和/或抑制型通道 蛋白基因。 在優(yōu)選的實施例中，所述興奮型通道蛋白基因為ChR2、 ChR2-310、 Chop2或者 Chop2-310 ;所述抑制型通道蛋白基因為NpHR。 在優(yōu)選的實施例中，所述目的基因為人生長激素、表皮生長因子或成纖維細胞生
3長因子。 在優(yōu)選的實施例中，所述生物材料為可降解型生物材料或非降解型生物材料。 在優(yōu)選的實施例中，所述可降解型生物材料為家蠶絲或柞蠶絲溶解提純到的絲
膠、絲素及膠原、甲殼素、纖維素、聚氨基酸、聚乳酸聚羥基乙酸共聚物、聚羥基乙酸、聚乳
酸，或者脫細胞真皮基質；所述非降解型生物材料為聚酰胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙
烯酸酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯或硝酸纖維。 —種皮膚材料的制備方法，包括如下步驟 從健康皮膚中分離、消化組織，提取細胞； 制備轉基因細胞； 將光敏感基因轉染到細胞中； 將含有轉基因的細胞接種于生物材料中，構建含有細胞的組織工程化皮膚。
在優(yōu)選的實施例中，利用慢病毒作為載體轉染編碼光敏感離子通道蛋白基因到細 胞中。 在優(yōu)選的實施例中，所述慢病毒載體為人體免疫缺損病毒、乳多空病毒、腺病毒、 牛痘病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和逆轉錄病毒中的一種。 上述皮膚材料移植到創(chuàng)面后，使光敏感離子通道蛋白的基因的多核苷酸序列連接 一個細胞特異啟動子，從而靶向性的特定細胞中表達，通過光照系統(tǒng)發(fā)出特定波長光的剌 激，調(diào)控特定細胞的活性，從而精確調(diào)控細胞的分化以及基因表達水平，使移植的皮膚材料 細胞和新生細胞與周圍的健康細胞之間生長同步，產(chǎn)生正常的皮膚附屬物，來促進創(chuàng)面愈 合和提高愈合速度。
具體實施方式
研究發(fā)現(xiàn)，光敏感基因Channelrhodopsin-2(ChR2)對波長為470nm左右的藍光 敏感，表達ChR2的細胞在藍光的剌激下，細胞膜對Na+等陽離子的通透性增加，離子進入細 胞，去極化，使興奮細胞；而Helorhodopsin(NphR)對波長為580nm左右的黃光敏感，表達 NphR的細胞在黃光的照射下，細胞膜對C1—離子的通透性增加，導致細胞超極化，從而抑制 細胞活性?；诓《巨D染的蛋白表達系統(tǒng)，利用細胞類型特異性的啟動子，光敏感基因即可 在特定類型的細胞中表達。這樣利用藍光或黃光交替照射就可以在特定細胞亞群水平上在 生理的時間分辨率上控制細胞的活性，從而精確調(diào)控干細胞的分化以及基因表達水平。
—種皮膚材料，包括攜帶光敏感基因和目的基因的細胞和生物材料。借助來源于 微生物的光敏感基因來調(diào)控細胞的生長、分化和基因表達來促進創(chuàng)面愈合和提高愈合速 度。 光敏感基因是編碼光敏感離子通道蛋白基因。編碼光敏感離子通道蛋白基因 可以是編碼興奮型通道蛋白基因(Channelrhodopsin-2， ChR2)、編碼抑制型通道蛋白 基因(Helorhodopsin， NpHR)、與ChR2具有相同功能的基因(如ChR2-310、 Chop2或者 Chop2-310)或者與NpHR具有相同功能的基因。 ChR2蛋白是一種視紫紅質，起源于單細胞類綠藻萊茵衣藻 (ChlamydomonasReinhardtii)。視紫紅質蛋白ChR2由一分子的視蛋白(Opsin)和一分子 稱為視黃醛(retinal)的生色基團所組成。ChR2對藍光(波長為472nm)敏感，藍光將使Na+等陽離子進入細胞而興奮細胞。NpHR是一種嗜鹽菌紫質(Halorhodopsins) 。 NphR對黃光(波長為593nm)敏感，
黃光將使cr等陰離子進入細胞而抑制細胞。 編碼的ChR2/NpHR的多核苷酸序列可操作地連接一個細胞特異的啟動子，從而靶 向性的特定細胞中表達。 目的基因可以為人生長激素、表皮生長因子或成纖維細胞生長因子等。目的基因 可以轉染到與創(chuàng)面愈合相關的細胞中，使其大量表達相應的有生物活性的蛋白，從而促進 創(chuàng)面愈合的速度和提高創(chuàng)面愈合的質量。 細胞可以是自體細胞、異體細胞或其混合物，如表皮細胞、成纖維細胞、干細胞或 前體細胞等。 生物材料可以是可降解型生物材料，例如家蠶絲或柞蠶絲溶解提純到的絲膠、 絲素及膠原、甲殼素、纖維素、聚氨基酸、聚乳酸聚羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚羥基乙酸 (PGA)、聚乳酸(PLA)，或者脫細胞真皮基質；也可以是非降解型生物材料，如聚酰胺、聚酯、 聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、硝酸纖維等。
皮膚材料制備方法如下 Sl，從健康皮膚中分離、消化組織，提取細胞。健康皮膚可以取自自體或異體。另 外，還可以進行細胞鑒定，并進行細胞原代培養(yǎng)和傳代，例如進行形態(tài)學、細胞表型和致癌 性等細胞鑒定。 S2，制備轉基因細胞。選擇能促進創(chuàng)面愈合的目的基因，如人生長激素、表皮生長 因子、成纖維細胞生長因子等，轉染到創(chuàng)面愈合密切相關的細胞中，使其大量表達相應的有 生物活性的蛋白，以促進創(chuàng)面愈合的速度和提高創(chuàng)面愈合質量。 S3，將光敏感基因轉染到細胞中。本實施方式中，利用重組慢病毒載體等將攜帶編 碼光敏感離子通道蛋白基因轉染到目的細胞中。慢病毒載體克服了逆轉錄病毒只能感染分 裂期細胞的特點，可感染分裂期和非分裂細胞、目的基因整合至靶細胞基因組長期表達、感 染效率高。對慢病毒載體進行了基因工程改造，使慢病毒的生活周期的復制能力失活。在病 毒DNA不整合至宿主細胞染色體的情況下實現(xiàn)慢病毒表達，由此減小了插入誘變的風險。 經(jīng)過改建后的慢病毒載體可以容納約10kb左右的外源基因，可以兼容多個轉錄啟動子。慢 病毒載體可以是人體免疫缺損病毒、乳多空病毒、腺病毒、牛痘病毒、腺相關病毒、皰疹病毒 或者逆轉錄病毒等。 S4，將含有轉基因的細胞按一定細胞密度接種于生物材料中，構建含有細胞的組 織工程化皮膚。將細胞接種于生物材料后，可以繼續(xù)培養(yǎng)，然后進行皮膚剌激、遺傳毒性和 致敏試驗等一系列的檢測。 皮膚經(jīng)培養(yǎng)并檢驗合格后，可以進行移植，將組織工程皮膚敷于創(chuàng)面上。移植前， 用75 %的酒精消毒，然后清除壞死的組織，將含有細胞液體涂于創(chuàng)面上，再立即將組織工程 皮膚敷于創(chuàng)面上。然后利用光照系統(tǒng)發(fā)光，調(diào)節(jié)光的強度和頻率，透過生物材料對移植細胞 進行光剌激，在特定波長的光的剌激下，通過調(diào)控特定細胞的活性，從而調(diào)控移植細胞的生 長、分化和基因表達。光敏感基因可以只有興奮型通道蛋白基因，也可以只有抑制型通道蛋 白基因，還可以同時有興奮型通道蛋白基因和抑制型通道蛋白基因。如果同時有興奮型通 道蛋白基因和抑制型通道蛋白基因，則便于更好的控制細胞的生長、分化和基因表達。
光照系統(tǒng)由LED組成，可為單個或多個，光強度和頻率可調(diào)控。 上述皮膚材料可以應用于臨床燒傷、潰瘍、創(chuàng)傷、畸形、術后缺損、疤痕等皮膚組織
修復和皮膚組織替代物等。采用上述皮膚材料移植到創(chuàng)面后，使光敏感離子通道蛋白的基
因ChR2/NpHR在細胞內(nèi)表達，通過特定波長光的剌激，調(diào)控特定細胞的活性，從而精確調(diào)控
細胞的分化以及基因表達水平，使移植的皮膚材料細胞和新生細胞與周圍的健康細胞之間
生長同步，產(chǎn)生正常的皮膚附屬物，來促進創(chuàng)面愈合和提高愈合速度。 以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保 護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
權利要求
一種皮膚材料，其特征在于所述皮膚材料包括生物材料和攜帶光敏感基因和目的基因的細胞，所述細胞接種于所述生物材料中。
2. 根據(jù)權利要求1所述的皮膚材料，其特征在于所述細胞為自體細胞、異體細胞或自 體細胞和異體細胞的混合物。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的皮膚材料，其特征在于所述細胞為表皮細胞、成纖維細 胞、干細胞或前體細胞。
4. 根據(jù)權利要求1所述的皮膚材料，其特征在于所述光敏感基因包括興奮型通道蛋 白基因和/或抑制型通道蛋白基因。
5. 根據(jù)權利要求4所述的皮膚材料，其特征在于所述興奮型通道蛋白基因為ChR2、ChR2-310、 Chop2或者Chop2-310 ;所述抑制型通道蛋白基因為NpHR。
6. 根據(jù)權利要求1所述的皮膚材料，其特征在于所述目的基因為人生長激素、表皮生 長因子或成纖維細胞生長因子。
7. 根據(jù)權利要求1所述的皮膚材料，其特征在于所述生物材料為可降解型生物材料 或非降解型生物材料。
8. 根據(jù)權利要求7所述的皮膚材料，其特征在于所述可降解型生物材料為家蠶絲或柞蠶絲溶解提純到的絲膠、絲素及膠原、甲殼素、纖維素、聚氨基酸、聚乳酸聚羥基乙酸共聚物、聚羥基乙酸、聚乳酸，或者脫細胞真皮基質；所述非降解型生物材料為聚酰胺、聚酯、聚 苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯或硝酸纖維。
9. 一種皮膚材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 從健康皮膚中分離、消化組織，提取細胞； 制備轉基因細胞； 將光敏感基因轉染到細胞中；將含有轉基因的細胞接種于生物材料中，構建含有細胞的組織工程化皮膚。
10. 根據(jù)權利要求9所述的皮膚材料的制備方法，其特征在于利用慢病毒作為載體轉 染編碼光敏感離子通道蛋白基因到細胞中。
11. 根據(jù)權利要求10所述的皮膚材料的制備方法，其特征在于所述慢病毒載體為人 體免疫缺損病毒、乳多空病毒、腺病毒、牛痘病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和逆轉錄病毒中的 一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種皮膚材料，所述皮膚材料包括生物材料和攜帶光敏感基因和目的基因的細胞，所述細胞接種于所述生物材料中。上述皮膚材料應用于制備臨床燒傷、潰瘍、創(chuàng)傷、畸形、術后缺損、疤痕等皮膚組織修復和皮膚組織替代物。采用上述皮膚材料移植后，通過光照使光感基因在特定細胞中表達，精確調(diào)控細胞的分化以及基因表達水平，使植入細胞和新生細胞及周邊健康細胞生長同步，產(chǎn)生正常皮膚附屬物，達到創(chuàng)面愈合質量較高效果。此外，還提供了一種皮膚材料的制備方法。
文檔編號A61L27/38GK101693127SQ200910110740
公開日2010年4月14日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權日2009年9月30日
發(fā)明者盧恬, 張奕, 王立平 申請人:深圳先進技術研究院;